使用来自相同宿主物种的一抗的多重免疫染色方法

取一个固定和透化的肾上腺部分，包括皮质和髓质。用沸腾的酸性缓冲液处理它，破坏固定诱导的交联以进行抗原揭蔽。

阻断非特异性结合位点并引入与皮层特异性标记物结合的一抗。

添加靶向一抗的生物素化二抗和与生物素结合的链霉亲和素偶联过氧化物酶。

引入荧光团标记的酪胺和过氧化氢。

固定化的过氧化物酶利用过氧化氢激活酪胺，酪胺与附近的蛋白质结合，标记皮层。

接下来，用沸腾缓冲液处理切片以剥离结合的抗体。

引入靶向髓质特异性标志物和生物素化二抗的相同宿主物种产生的一抗。

引入链霉亲和素偶联的过氧化物酶和不同的荧光团偶联酪胺来标记髓质。

剥离皮层特异性一抗会抑制重新引入的二抗结合它们，从而防止交叉反应。

应用核染色剂并进行成像以观察明显染色的皮质和髓质，确认没有抗体交叉反应。

前，将福尔马林固定、石蜡包埋的载玻片脱蜡并再水化，并按照指示在每种溶液中浸泡五分钟。第二次蒸馏水浸泡后，将载玻片放入带盖移液器吸头盒底部的 275 毫升沸腾柠檬酸钠溶液中，然后将盒放入 700 瓦微波炉中，以 70% 的功率煮 8 分钟。

在治疗结束时，打开盖子，让溶液冷却至室温，然后在Coplin罐中用新鲜PBST洗涤3次5分钟洗涤载玻片。要阻断任何非特异性结合位点，在最后一次洗涤后，摇动每张载玻片中多余的PBST，并用足够体积的适当封闭溶液覆盖载玻片。

室温下在加湿室中30分钟后，摇动每张载玻片中多余的封闭溶液，并向每个样品中加入250微升感兴趣的第一一抗。为防止样品变干，载玻片可以用一块石蜡薄膜覆盖。

在加湿室中以 4 摄氏度孵育过夜后，用新鲜的 PBST 洗涤载玻片 3 次，每次洗涤 5 分钟。抖掉多余的PBST，然后，用250微升适当的二抗溶液快速覆盖每张载玻片，在室温下在加湿室中孵育一小时。

孵育结束时，如图所示，在新鲜PBST中洗涤载玻片3次，并向每张载玻片中加入250微升新鲜制备的链霉亲和素辣根过氧化物酶。在室温下30分钟后，在新鲜的PBST中洗涤载玻片3次，然后，抖掉多余的PBST，并用250微升新鲜制备的荧光团酪胺溶液覆盖每张载玻片。

一分钟后，将载玻片浸入新鲜的PBST中，然后在新鲜的PBST中洗涤三次两分钟。最后一次洗涤后，将几滴1比1的甘油PBS溶液涂抹到切片上，并通过荧光显微镜检查是否存在荧光信号。

要剥离第一种抗体复合物，请将抗体标记的载玻片放入 275 毫升沸腾的柠檬酸钠溶液中至少 8 分钟，如图所示。在处理结束时，打开盖子，让溶液冷却至室温，然后用PBST洗涤载玻片3次，每次洗涤5分钟。

为了染色第二种目标靶蛋白，在证明非特异性结合的阻断后，用 250 微升第二种感兴趣的一抗在 4 摄氏度下标记每个样品过夜。第二天早上，每次洗涤在新鲜的PBST中洗涤载玻片3次，每次洗涤5分钟，然后用250微升适当的二抗溶液覆盖每张载玻片，在室温下孵育一小时。

孵育结束时，如图所示，在新鲜PBST中洗涤载玻片3次，并向每张载玻片中加入250微升新鲜制备的链霉亲和素辣根过氧化物酶。为了在三次PBST洗涤后产生第二个目标靶蛋白的信号，用不同荧光光谱的荧光团偶联酪胺处理载玻片。

要阻止酪胺信号的发展，请将载玻片浸入 PBST 中，然后用适当的核染料对样品进行染色。