无交叉反应和无免疫多路复用夹芯芯片

该程序的总体目标是使用夹心免疫测定法以无斑点的方式同时定量芯片上的多种蛋白质，而不会在试剂之间发生交叉反应。该方法可以帮助回答定量蛋白质组学领域的关键问题，例如癌症中候选蛋白质生物标志物的发现和验证。该技术的主要优点是它在多重夹心检测中抗体和抗原之间具有交叉反应性，并且用户不需要复杂的微阵列点样器。

Parallex BioAssays 的科学总监 Heidi Larkin 将演示该程序。要开始为单次转移方法准备载玻片，请在喷墨微阵列观察台上固定新的转移载玻片。使用聚苯乙烯微珠溶液或 30% 甘油，在玻片边缘发现一系列对齐标记。

使用仪器软件和点样相机，拍摄对齐标记的照片以进行质量控制。接下来，将硝酸纤维素或功能化玻璃测定载玻片固定在喷墨微阵列点样台上转移载玻片的左侧。使用对准标记，以 400 微米的中心间距点样 24 个捕获抗体溶液阵列。

将检测玻片在室温下、相对湿度为 60% 的气氛中孵育 1 小时。然后将 24 孔硅胶垫圈夹在载玻片上，与阵列对齐。将 80 微升 0.1% 聚山梨酯 20 的 PBS 溶液移液到每个孔中。

以 450 rpm 的速度摇动玻片 5 分钟，然后弃去溶液。以这种方式洗涤载玻片 3 次。接下来，将 80 微升 BSA 自由封闭溶液加载到每个冲洗的井中。

以 450 rpm 的速度摇动玻片 1 小时。然后丢弃溶液，取下硅胶垫圈，并使用氮气或离心机干燥分析玻片。将分析玻片密封在装有硅胶或其他干燥剂的密封袋中，并在零下 20 摄氏度下储存。

使用相同的对齐标记，以 400 微米的中心间距，每个点使用 3.2 纳升点样 24 组检测抗体溶液。将转移玻片存放在零下 20 摄氏度的密封袋中，并带有干燥剂。要开始为双转移方法准备载玻片，请将转移载玻片固定在喷墨微阵列观察台上。

点样 24 个捕获抗体溶液阵列，中心间距为 400 微米。然后将卡扣装置柱塞开关旋转 90 度，将柱塞锁定在打开位置。将捕获转移玻片安装到设备中，将剪下的角靠在固定的弹簧针上。

将相应的柱塞开关向后旋转 90 度，松开弹簧针。确保移载玻片被弹簧针牢牢固定，并与固定定位销齐平。然后将新的硝酸纤维素或功能化载玻片放在弹簧针上，涂层面朝下。

转动其他三个开关以释放直引脚。验证两张载玻片是否都靠在固定的定位销上固定到位。然后将顶壳安装到载玻片支架上，将支柱固定在对齐孔中。

将封闭的设备插入卡扣笼中，然后完全按下闭合卡舌。让设备关闭一分钟。然后拉起闭合片，将设备从笼子中释放出来。

取下顶壳，将测定和转移玻片分开。将检测玻片孵育 1 小时。接下来，将 24 孔硅胶垫圈夹在载玻片上，并清洗载玻片 3 次。

然后用不含 BSA 的封闭溶液摇动载玻片 1 小时。取下垫圈，在氮气流或离心机下干燥分析玻片。接下来，在喷墨观察台上固定另一个转移载玻片。

载玻片上以每个点 3.2 纳升的间距以 400 微米的中心间距点定 24 组检测抗体溶液，以制作转移玻片。将检测转移玻片存放在零下 20 摄氏度。要开始免疫测定，请从冰箱中取出准备好的测定玻片，并在密封袋中加热至室温 30 分钟。

在含有 0.05% 聚山梨酯 20 的 PBS 中制备 7 种连续稀释的蛋白质溶液。在相同的缓冲液中制备适当稀释的样品溶液。将 24 孔硅胶垫圈夹在室温测定载玻片上。

将 7 种蛋白质稀释液上样到色谱柱的 8 个孔中的 7 个孔中。将含 0.05% 聚山梨酯 20 的无蛋白 PBS 上样到该色谱柱的最后一个孔中。将样品溶液加载到剩余的孔中。

室温下以 450 rpm 摇动载玻片 1 小时或在 4 摄氏度下摇动过夜。然后洗涤载玻片 3 次。取下垫圈并在氮气流下干燥载玻片。

接下来，将检测抗体转移玻片在密封袋中加热至室温 30 分钟。然后将玻片在相对湿度为 60% 的密闭腔室中孵育 20 分钟，以使阵列再水化。使用弹簧针将检测转移玻片正面朝上固定在卡扣装置中。

将检测玻片面朝下放在弹簧针上，并将玻片与直针对齐。关闭设备并将检测抗体快速转移到检测玻片上。从仪器中取出玻片，并将检测玻片孵育 1 小时。

24 孔硅胶垫圈夹在载玻片上，并清洗载玻片 3 次。然后将 80 微升每毫升 2.5 微克的链霉亲和素氟 4 溶液加载到每个孔中，溶于 PBS 中。以 450 rpm 的速度摇动玻片 20 分钟。

用 0.1% 聚山梨酯 20 的 PBS 溶液洗涤载玻片 3 次，然后用蒸馏水洗涤 1 次。然后取下垫圈并擦干载玻片。用荧光扫描仪扫描载玻片并测量斑点强度。

确定蛋白质浓度的检测限。使用带有 16 孔模板的双转移方法，将两种荧光蛋白依次图案化在硝酸纤维素包被的载玻片上。在转移第二种荧光蛋白时未观察到交叉污染。

光斑间距减小的较小光斑可以转移到具有高度疏水表面的载玻片上。双转移方法导致阵列的角度错位最小。双转移法用于对夹心测定形式的乳腺癌相关蛋白进行 50 重免疫测定。

未观察到交叉反应性，允许独立优化每个抗体对。根据分析计算的标准曲线表明，50 种蛋白质中有 35 种的检测限为皮克/毫升。一旦掌握了这项技术，大约可以在三个小时内完成。

该技术允许科学家进行基于微阵列的分析，并以纳米液滴的形式提供试剂。尝试此过程时，请记住将载玻片正确固定在观察台和卡扣装置中。观看本视频后，您应该对如何使用 snap 装置进行无交叉反应性的多重夹心免疫测定有很好的了解。