Name: 无交叉反应和无免疫多路复用夹芯芯片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学习使用Snap芯片技术进行无交叉反应的多重夹心免疫分析，无需复杂微阵列点样仪即可同时定量多种蛋白质。该方法可应用于癌症蛋白质生物标志物发现研究。

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感谢 Rob Sladek 博士提供喷墨点样仪的使用。感谢加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）、加拿大癌症协会研究所和加拿大创新基金会（CFI）提供的最终支持。D.J. 感谢加拿大研究主席计划的支持。

1. 快速芯片的制备与储存
<ol>
	<li>单次转移法（图1a)
	<ol>
		<li>使用喷墨微阵列点样仪，将含有400 µg/mL抗体和20%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）中的cAb溶液点样到硝酸纤维素膜（或功能化玻璃）检测芯片上13 相对湿度为60％（每点1.2 nL），点间距为800 µm。确保载玻片根据某一角落固定在点样仪载台（此处使用左下角）。</li>
		<li>将点样后的检测玻片在室温下孵育1小时，相对湿度为60%。</li>
		<li>将带有16个隔室的载玻片模块垫圈夹紧在检测载玻片上，将其分割为16个孔。每孔加入80 µL含0.1% Tween-20的PBS（PBST），在振荡器上以450 rpm振荡5分钟，重复洗涤3次。</li>
		<li>每孔加入 80 µL 封闭液，在 450 rpm 条件下振荡孵育 1 小时。</li>
		<li>取下垫圈，并用氮气流吹干检测载玻片。</li>
		<li>将转移玻片固定在点样台支架上，并将玻片的左下角紧贴点样台支架的左下角。使用喷墨技术点样一组与cAbs布局相同的对齐标记（聚苯乙烯微珠溶液）。</li>
		<li>让对齐标记晾干。翻转转移玻片，并将其重新放回点样平台，固定于左下角。</li>
		<li>制备含有20 µg/mL抗体、20%甘油和1% BSA的dAb点样溶液。</li>
		<li>使用定位相机拍摄一个对齐标记的图像。将该图像作为基准标记导入点样程序中，并使喷墨点样仪的图像识别系统识别最左上角的标记。以其坐标作为dAb阵列的第一个点样位置。每滴点样8 nL，点间距（中心到中心）为800 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双转移法（图1b)
	<ol>
		<li>将一张转移玻片1放置于喷墨点样仪载物台的左下角。在相对湿度60%的条件下，使用喷墨微阵列点样仪将含有400 µg/mL抗体、20%甘油和1% BSA的PBS溶液点样到玻片上（每点0.4 nL，直径约200 µm），点与点中心间距为400 µm。</li>
		<li>使用压片装置将转移载玻片与硝酸纤维素包被（或功能化玻璃）的检测载玻片固定在一起图2) 将 cAb 液滴转移至检测玻片上。
		<ol>
			<li>将快接装置侧面的全部六个按钮旋转90度，以拉出并锁定所有柱塞于打开位置。将转移滑片插入滑片架的插槽中， clipped corner（剪角）朝向固定探针针脚。旋转第一组三个按钮，释放带有金色探针针脚的柱塞，并确保滑片紧贴对齐销钉。</li>
			<li>将一张硝酸纤维素包被的载玻片倒置插入快装装置，使其位于4个弹簧针上。转动第二组三个按钮，释放带有银针的活塞，并确保载玻片紧贴对齐针。</li>
			<li>通过将上壳体对准滑片架上的对齐柱和孔，精确放置以闭合卡扣装置。</li>
			<li>将闭合的夹子装置插入其配套的盒中，完全下压闭合标签，使微阵列面对面贴合，同时施加适当压力。保持闭合状态1分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分离载玻片。将检测载玻片在室温、相对湿度60%的条件下孵育1小时。按照步骤1.1.3–1.1.5所述方法洗涤、封闭并干燥检测载玻片。</li>
		<li>将另一张转移载玻片放置于喷墨点样仪的载物台上，并推向左下角。点样含有50或100 µg/mL抗体（见表1）、20%甘油和1% BSA的PBS溶液。确保每点体积为0.8 nL，点间中心间距为400 µm。</li>
		<li>将检测芯片和转移玻片储存起来。将检测芯片和转移玻片用含干燥剂的密封袋密封后，置于 -20 °C 冰箱中保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用快照芯片进行多重免疫测定
<ol>
	<li>从冷冻柜中取出检测玻片。将袋子密封静置30分钟，直至玻片恢复至室温。</li>
	<li>用含0.05% Tween-20的PBS缓冲液对蛋白质进行7点倍比稀释，配制样品溶液。 
	注意：此处使用5倍稀释因子。各蛋白质的起始浓度见表1。</li>
	<li>根据需要配制样品溶液。例如，将人血清用PBST缓冲液稀释4倍。</li>
	<li>将一个16孔密封垫固定在检测玻片上。</li>
	<li>用移液器向同一列的8个孔中加入7种蛋白质稀释液和1种不含蛋白质的PBST缓冲液；在同一玻片的另外8个孔中加入其他样品溶液。 
	注意：每个孔可容纳80 µL溶液。必要时可使用更多玻片以检测额外样品。</li>
	<li>将样品置于摇床中，450 rpm振荡孵育，可在室温下孵育1小时，或在4 °C过夜。随后在摇床上用PBST缓冲液洗涤玻片3次，每次5分钟。取下密封垫，并用氮气流吹干玻片。</li>
	<li>从冷冻柜中取出带有dAbs的转移玻片。保持袋子密封，在室温下静置30分钟。然后将玻片放入密闭容器（e.g. 空的枪头盒）中，该容器内含有60%湿度稳定珠，孵育20分钟以完成再水合。</li>
	<li>使用卡扣装置将转移玻片与检测玻片压合（图2），以实现dAb液滴的转移。卡扣装置的操作详见第1.2.2节。</li>
	<li>分离两片玻片。将检测玻片放入含有60%湿度稳定珠的密闭容器中孵育1小时。重新用16孔密封垫固定检测玻片，并在摇床上用PBST缓冲液清洗4次，每次5分钟，450 rpm振荡。</li>
	<li>向每个孔中加入80 µL含有2.5 µg/mL链霉亲和素荧光染料的PBS溶液。在摇床上450 rpm振荡孵育20分钟。</li>
	<li>在摇床上用PBST缓冲液清洗玻片3次，再用蒸馏水清洗1次，每次5分钟，450 rpm振荡。取下密封垫，并用氮气吹干玻片。</li>
</ol>
3. 载玻片扫描与数据分析
<ol>
	<li>使用635 nm激光的荧光微阵列扫描仪扫描检测芯片。</li>
	<li>使用分析软件（例如array-pro analyzer）提取每个点的净信号强度16。</li>
	<li>使用统计学软件计算每种蛋白质的检测限（LOD），并确定样品中蛋白质的浓度。 
	注意：检测限（LOD）定义为标准曲线的Y轴截距加上三次独立检测的标准差的三倍。</li>
</ol>

<ol><li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li>
<li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers%3A+CEA%2C+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+improve+protein+detection+by+indirect+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).</li>
<li>Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multiplexed+MRM-based+protein+biomarker+quantitation+toward+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility.</a> Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).</li>
<li>Ekins, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-analyte+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Multi-analyte immunoassay.</a> J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).</li>
<li>Mahlknecht, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+microarray+analysis+of+serum+cytokines+in+neurodegenerative+Parkinsonian+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes.</a> Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+microarray+profiling+of+human+prostate+cancer+sera%3A+Antibody+screening+and+identification+of+potential+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers.</a> Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).</li>
<li>Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+droplet+microarrays+with+trapped+antibody-functionalized+beads+for+multiplexed+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis.</a> Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).</li>
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<li>Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+mixtures+of+14+hygroscopic+additives+to+improve+antibody+microarray+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).</li>
<li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Multiplexed+Analyte+Quantification+Using+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+Coupled+to+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Partitioned+Droplet+Array+on+Laser-Patterned+Superhydrophilic+Glass+Surface+for+Wall-less+Cell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).</li>
<li>Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolizing+enzyme+toxicology+assay+chip+%28MetaChip%29+for+high-throughput+microscale+toxicity+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).</li>
<li>Fernandes, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li>
<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-Eluting+Microarrays+for+Cell-Based+Screening+of+Chemical-Induced+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).</li>
<li>Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li>
</ol>

麦吉尔大学已就本工作的某些方面提交了专利申请，发明人为 Huiyan Li 和 David Juncker。

在本研究中，我们介绍了一种快照芯片（snap chip）技术，该技术使得无需交叉反应的多重免疫分析方法能够被具备基本实验条件的研究人员广泛使用。与现有的抗体微阵列不同，终端用户无需使用微阵列点样仪。本文展示了单次和双次转移方法，其中双次转移实现了更高的对准精度，98%的点阵对准误差低至约40 μm，最大错位为63 μm14。我们开发了一种新型快照装置，可方便地以恒定压力将两张载玻片压合，使该技术更易于被研究人员采用。试剂的可靠转移不仅可在硝酸纤维素涂层载玻片上实现，也可在普通玻璃载玻片上完成，显著拓展了该技术的应用范围，且无需 extensive 培训。为验证快照芯片的可用性，我们使用预先点样并储存的载玻片进行了50重免疫分析，其中70%的蛋白质检测限（LOD）达到pg/mL量级14。与现有将双抗体（dAbs）混合使用的多重免疫分析方法相比，ACM及快照芯片技术的一个重要优势在于，芯片上的各个检测互不干扰，因此可任意添加或移除任何抗体对，而不会影响其他检测对。利用快照芯片可同时检测数十至数百种蛋白质，相比诸如通过连续孵育进行自动化串行检测等其...

由多种蛋白质组成的生物标志物组合在诊断癌症等复杂疾病时，可能比单一生物标志物具有更高的灵敏度和特异性1,2。酶联免疫吸附测定（ELISA）一直是临床实验室中的金标准技术，可在血浆中实现低至 pg/mL 水平的检测下限，但其局限性在于每次实验只能检测一个靶标3,4,5。抗体微阵列技术已被开发用于在单张显微镜载玻片上并行开展数千个微型化检测实验6,7,8。然而，该方法的多重检测能力受限于试剂引起的交叉反应性，这种交叉反应性源于检测抗体（dAbs）混合物的应用，并且随着靶标数量的增加而变得更加严重9,10,11。Pla et al. 指出，多重夹心检测的易受影响程度与 4N(N-1) 成正比，其中 N 为靶标数量12。
为了减轻抗体微阵列中的交叉反应性，本实验室开发了抗体共定位微阵列（antibody colocalization microarray, ACM），用于多重夹心检测12。捕获抗体（cAbs）通过微阵列点样仪固定在基底表面。封闭后，将样本施加于表面，随后将各个检测抗体（dAbs）点样在含有cAb-抗原复合物的相同位点上。ACM可消除抗体与抗原之间所有可能的交叉反应情况，并已实现pg/mL级别的检测限。然而，该检测流程需要在实验过程中使用高精度的现场微阵列点样仪来制备并点样dAbs，这既昂贵又耗时，限制了该技术在其他实验室中的广泛应用。为此，已开发出一种手持式ACM装置，称为snap chip，可用于无交叉反应且无需点样仪的多重夹心免疫检测13,14,15。cAbs和dAbs分别以微阵列形式预先点样于检测芯片和转移芯片上，并进行储存。在检测时，取出芯片，通过简单地将两个芯片“咔嗒”扣合，即可将dAbs微阵列整体转移至检测芯片上。使用专用的snap装置以确保试剂转移的可靠性。检测芯片采用硝酸纤维素包被的载玻片，其具有相对较高的抗体结合能力，可吸收液滴并促进试剂转移；但此类载玻片比常规玻璃载玻片更昂贵，且需要使用兼容不透明载玻片的微阵列扫描仪进行信号采集。
本研究展示了使用快照芯片（snap chip）进行多重夹心免疫测定的实验方案。我们开发了一种新型快照装置，可更便捷、可靠地实现试剂从一个微阵列到另一个微阵列的转移。尤为重要的是，本文建立了将试剂转移至常规玻璃载玻片上的方法。利用快照芯片，成功将1024个点阵转移并精确对齐至玻璃载玻片上，显著拓展了该技术在大多数实验室中的应用范围。

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素偶联Cy5</td><td>Rockland</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>封闭液：不含BSA的StabilGuard Choice微阵列稳定剂</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素包被载玻片</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>氨基硅烷包被载玻片</td><td>Schott North America</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Snap Device</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>喷墨微阵列点样仪</td><td>GeSiM</td><td>Nanoplotter 2.0</td><td></td></tr><tr><td>载玻片模块垫圈</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>湿度稳定珠</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro Analyzer软件</td><td>Media Cybernetics</td><td>Version 4.5</td><td></td></tr><tr><td>荧光微阵列扫描仪</td><td>Agilent</td><td>SureScan Microarray Scanner</td><td></td></tr><tr><td>生物统计学软件</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>内皮糖蛋白捕获抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>内皮糖蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1097-EN</td><td></td></tr><tr><td>内皮糖蛋白检测抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF1097</td><td></td></tr><tr><td>IL-6&lt;sup&gt;a（见表1）&lt;/sup&gt;</td><td>R&amp;D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6&lt;sup&gt;b（见表1）&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于无交叉反应和无点样多重夹心免疫测定的snap chip

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

与单个蛋白质检测相比，多重蛋白质分析显示出更高的诊断灵敏度和准确性。抗体微阵列可在单个芯片上同时进行数千个微尺度免疫测定。夹心式检测通过使用两种抗体识别每个靶标，提高了检测特异性，但因试剂间的交叉反应而限制了其多重检测能力。为实现无交叉反应的多重蛋白质检测，已开发出抗体共定位微阵列（ACM）技术，但该方法在检测过程中需要现场使用昂贵的点样仪进行微阵列制备。本文展示了一种“ snap 芯片”技术，通过简单地将两个芯片扣合，即可实现试剂从一个微阵列向另一个微阵列的转移，从而在样品孵育及后续检测抗体（dAbs）应用过程中无需点样仪，仅需预先点样的玻片储存，将玻片制备与检测操作分离。本文介绍了单次和双次转移两种方法，以实现两个微阵列之间的精确对齐，并描述了两种方法的玻片制备流程。结果显示，采用双次转移方法可实现&#60;40 μm 的对齐精度，达到 625 个点/cm2 的阵列密度。通过开展 50 重免疫测定，验证了 snap 芯片在多重蛋白质分析中的可用性。35 种蛋白质的检测限均处于 pg/mL 范围内。

单次转移与双次转移两种方法的检测流程如图1所示。在单次转移法中，捕获抗体（cAbs）直接点样于检测载玻片上，检测抗体（dAbs）则在使用时以与cAbs呈镜像对称的方式转移至检测载玻片上（图1a）。该方法仅需一次转移操作，但其主要缺陷在于两个微阵列之间存在错位，错位主要由载玻片与喷墨打印架之间的角度偏差引起（图2）。为解决这一问题，一种可行方案是在点样完成后，依次将cAbs和dAbs转移至检测载玻片，并将载玻片在卡扣装置中正确固定（图1b）。采用该方法时，两个微阵列可被精确转移至完全相同的位置。双次转移法无需图像识别系统或对齐标记。98%的点阵列错位控制在41 µm以内，较单次转移法提高了6倍14。
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我们展示了一种“卡扣芯片”技术，通过简单地将两张载玻片卡合，即可实现无交叉反应的多重夹心免疫测定。该技术使用一种卡扣装置，可可靠地将试剂从一个微阵列转移至另一个微阵列。这种卡扣芯片可用于任何需要不同试剂共定位且避免交叉污染的生化反应。

用于无交叉反应和无点样多重夹心免疫测定的Snap Chip

多重蛋白质分析相较于单个蛋白质检测，展现出更高的诊断敏感性和准确性。抗体微阵列技术可实现数千种...

本实验的总体目标是采用无点样方式，通过夹心免疫分析法在芯片上同时定量多种蛋白质，并避免试剂之间的交叉反应。该方法有助于回答定量蛋白质组学领域的关键问题，例如癌症中候选蛋白质生物标志物的发现与验证。该技术的主要优势在于多重夹心免疫分析中抗体与抗原之间无交叉反应，且使用者无需复杂的微阵列点样仪。演示该实验步骤的是Parallex BioAssays公司的科研总监Heidi Larkin。开始准备单次转移法所用载玻片时，先将一张新的转移载玻片固定在喷墨微阵列点样仪的载物台上。使用聚苯乙烯微球溶液或30%甘油，在载玻片边缘点样一组对齐标记。使用仪器软件和点样相机拍摄对齐标记图像，以进行质量控制。接下来，将一张硝酸纤维素膜或功能化玻璃检测芯片固定在喷墨微阵列点样仪载台上的转移芯片左侧。利用对齐标记，以400微米的中心到中心间距，点样24个捕获抗体溶液阵列。将检测玻片置于室温、相对湿度为60%的环境中孵育1小时。然后将24孔硅胶垫圈夹在玻片上，与阵列对齐。每孔加入80 µL PBS中含0.1%吐温20的溶液。以 450 rpm 的速度振荡载玻片 5 分钟，弃去溶液。以该方法洗涤载玻片三次。随后，向每个冲洗过的孔中加入 80 µL 无 BSA 封闭液。将载片在450 rpm条件下振荡一小时。随后弃去溶液，移除硅胶垫圈，并使用氮气或离心机干燥检测载片。将检测载片与硅胶或其他干燥剂一同密封于密闭袋中，于零下20摄氏度保存。使用相同的对齐标记，用点样间距中心到中心400微米、每点3.2纳升的检测抗体溶液点样24个阵列。将转移玻片存放在含干燥剂的密封袋中，于零下20摄氏度保存。开始准备双转移法所用玻片时，将转移玻片固定在喷墨微阵列点样仪的载物台上。以400微米的中心间距点样24个捕获抗体溶液阵列。然后将卡扣装置的柱塞开关旋转90度，使柱塞锁定在打开位置。将捕获转移玻片装入装置中， clipped corner（剪角）紧靠固定的弹簧针。通过将相应的柱塞开关回转90度来释放弹簧针。确保转移载玻片被弹簧针牢固固定，并与固定的对齐针齐平。然后将新的硝酸纤维素膜或功能化玻璃载玻片放置在弹簧针上，涂层面向下。将其余三个开关拨动以释放直针。确认两个载片均紧贴固定对准针并固定到位。然后将上壳体安装到载片架上，使定位柱插入对准孔中。将闭合的装置插入卡扣式笼中，并完全按下闭合标签。保持装置闭合状态一分钟。然后向上提起闭合标签，使装置从笼中释放。移除顶部外壳，分离检测玻片和转移玻片。将检测玻片孵育一小时。随后将一个24孔硅胶垫圈夹在玻片上，并清洗玻片三次。然后用不含 BSA 的封闭液振荡孵育芯片 1 小时。取下垫圈，并在氮气流下或离心机中干燥检测芯片。接着将另一张转移芯片固定在喷墨点样仪的载物台上。使用检测抗体溶液在载玻片上点样24个阵列，每点3.2纳升，点间中心间距为400微米，制成转移载玻片。将检测转移载玻片于-20摄氏度保存。开始免疫测定前，从冷冻箱中取出已制备的测定载玻片，在密封袋中静置30分钟，使其恢复至室温。用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS）配制七种蛋白质的连续稀释溶液。在相同缓冲液中制备适当稀释的样品溶液。将24孔硅胶垫圈夹紧在室温检测载玻片上。将七种蛋白质稀释液加入一列中的八个孔中的七个孔内。将不含蛋白质的 PBS 缓冲液（含 0.05% 吐温 20）加入该列最后一个孔中。将样品溶液加入其余孔中。将载玻片在室温下以450 rpm振荡一小时，或在4摄氏度下过夜。然后用缓冲液洗涤载玻片三次。取下垫圈，并在氮气气流下干燥载玻片。接下来，将检测抗体转移玻片在其密封袋中静置，恢复至室温，持续30分钟。然后将玻片置于相对湿度为60%的密闭孵育 chamber 中孵育20分钟，以重新水化芯片阵列。使用pogo针将检测转移玻片正面朝上固定在卡扣装置中。将检测玻片正面朝下放置在弹簧针上，并用直针校准玻片位置。合上装置，快速将检测抗体转移至检测玻片上。从装置中取出玻片，将检测玻片孵育一小时。将24孔硅胶垫圈夹紧在载玻片上，并用缓冲液清洗载玻片三次。然后向每个孔中加入80 µL浓度为2.5 µg/mL的链霉亲和素Fluoro-4 PBS溶液。以450 rpm的速度振荡孵育20分钟。用含0.1%聚山梨酯20的PBS溶液洗涤载玻片三次，再用蒸馏水洗涤一次。随后移除垫圈并干燥载玻片。使用荧光扫描仪扫描载玻片，并测量斑点强度。确定蛋白质浓度的检测限。使用16孔模板通过双转移法将两种荧光蛋白依次点样到硝酸纤维素包被的载玻片上。在转移第二种荧光蛋白时未观察到交叉污染。可将点阵间距更小、点间距离更短的微阵列转移至具有高度疏水性表面的玻片上。双转移法使阵列的角向错位降至最低。采用双转移法进行了50重乳腺癌相关蛋白的夹心式免疫测定。未观察到交叉反应性，可对每对抗体进行独立优化。由检测结果绘制的标准曲线表明，50种蛋白质中有35种的检测限达到皮克每毫升水平。该技术掌握后，可在约三小时内完成。该技术可使科研人员开展基于微阵列的检测，并以纳升级液滴形式递送试剂。在进行此操作时，请务必注意将载玻片正确固定在点样平台和 snap 装置上。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用 snap 装置进行无交叉反应的多重夹心免疫分析。

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无交叉反应和无免疫多路复用夹芯芯片

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一种用于无交叉反应多重夹心免疫测定的Snap Chip技术

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