使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

本方法的总体目标是利用多光谱成像技术对蛋白质表达及共定位进行客观定量。该方法有助于解答基础研究和诊断病理学领域中的关键问题，例如蛋白质在处理干预后或疾病进展过程中表达和定位的变化情况。该技术的主要优势在于能够消除传统定量方法中固有的操作者主观性。

开始定量分析时，打开多光谱成像软件，利用先前制备的对照切片建立光谱库，这些对照切片分别用单一发色剂以及苏木精染色。接着，打开从单个发色剂对照切片获取的图像立方体，选择四到五个阳性染色区域，以光学方式定义该发色剂的光谱特征。对其他对照切片的图像立方体重复上述步骤，直至建立包含所有发色剂的完整光谱库，然后保存该光谱库。

在多光谱成像软件中创建一个新项目，选择 Multispectral 或 im3 作为图像格式选项，选择 Brightfield 作为样本格式。通过选择组织分割、特征识别、表型分析、评分和导出等步骤来配置项目。如有需要，可更改图像分辨率以加快分析速度。

导入先前创建的光谱库，并选择所有要包含在分析中的显色剂。通过选择“打开图像立方体”选项，打开要包含在训练数据集中的图像立方体。为确保训练准确性，应选择至少占待分析图像总数18%的图像。

接下来，选择图像的训练集。应包含代表所有疾病状态的图像，以提高分割的准确性。在训练集中纳入大量阴性染色图像，以避免此步骤中产生偏差。

通过选择滴管工具，并在一幅图像中选取白色区域，对训练集中的图像进行白平衡。单击“下一步”按钮以进入组织分割。然后使用组织分类面板选择要分析的组织类型，以实现更精确的蛋白质组织定位，可使用组织分类功能。

开始创建算法并定义组织类别：使用笔刷工具，在训练图像中围绕具有代表性的细胞群进行绘制。完成一个组织类别的标注后，对其他组织类别重复此步骤。务必选择图像中能够代表该组织类别类型的典型细胞群。

选择要包含在组织分割器训练中的组件。选择合适的模式尺度以训练组织分割器，然后点击已训练的组织分割器按钮。

观察弹出窗口中显示的训练区域像素分类准确率。单击“分割图像”以对整个训练图像集进行分割。完成分割后，检查训练集，查找当前训练算法下任何分类错误的组织区域。

当对组织分割算法结果满意后，点击“下一步”按钮。确保已选择细胞核，以进一步选择细胞质和/或细胞膜。选择“细胞核”选项卡，并为细胞核分割选择适当的设置。

然后选择在分割中包含单个或全部组织类别。选择基于计数染色对象的阈值方法，以简化操作并获得良好结果。接下来，选择基于可靠核计数染色的对象阈值方法。

通过选择“细胞质”选项卡来选取细胞质形态参数。接着，选择细胞核外距离。然后选择最小尺寸。

选择下一个组件选项，其中主选项为 primary，次选项为 secondary 和 select tertiary。转到膜组分标签页，选择用于膜特异性标记物的第一个选项。

调整全量程光密度（OD），以确定细胞膜上每种标记物的最低阈值或阳性信号。在膜选项卡下继续操作，选择最大细胞尺寸。完成所有选项设置后，选择“分割全部”。

应用设置到图像并进行观察。选择“下一步”进入免疫组化评分步骤，并选择待评分的组织类别。选择所需的评分类型，并选择用于评分分析的细胞区域。

接下来，选择查看组分数据，并将光标移至训练图像上，以确定目标组分阳性细胞染色的合适光学密度最低阈值。将训练集数据导出，以检验通过组织分割、细胞分割和评分值所创建的算法；按照提示为导出目录创建新文件夹。选择需生成并包含在分析中的图像和表格。

接下来，选择“全部导出”以执行分析。分析完成后，查看染色程度高和低的图像的细胞分割与评分数据，以评估参数设置的准确性。当对设置结果满意后，点击批量分析选项卡，将算法复制到当前项目中。

然后选择新的导出目录，并选定要包含在分析中的图像和表格。在输入文件选项下，选择所有要包含在批量分析中的图像。选择运行选项以执行分析。

完成后，进入审核合并标签页。选择包含全部并点击合并，以生成包含汇总数据的数据表用于分析。训练在前列腺组织上进行，以将图像分割为上皮和间质部分。

同时包含非组织区域。一组训练图像被导入多光谱成像软件中，用以代表整套图像中的组织类型和疾病状态。通过在训练图像上手动绘制，创建了包括间质、上皮和非组织在内的组织类别，并对这些类别进行了定义。

创建了一种用于组织分割的算法，并将其应用于图像训练集。对组织进行精确分割。利用多重免疫组织化学技术，尽管存在颜色和形态信号的重叠，仍可识别出细胞核表达ER-alpha阳性（呈红色）和AR阳性（呈棕色）的细胞。通过使用E-cadherin（呈黑色）作为标记蛋白，定量分析了CD-147在细胞膜上的特异性表达。

观看本视频后，您应能充分掌握如何对石蜡包埋组织中的蛋白质表达与共定位进行定量分析，并了解相关的固定方法。