Name: 蛋白表达和共定位使用复用免疫组织化学染色和多光谱成像定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学习多重免疫组织化学染色结合多光谱成像技术，用于客观定量蛋白质表达和共定位分析。该方法消除传统定量中的人为主观性，提高神经科学和病理学研究的可重复性与准确性。

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作者感谢威斯康星大学麦迪逊分校转化病理学研究计划实验室提供的设施与服务，该实验室部分由威斯康星大学病理学与实验室医学系以及UWCCC资助项目P30 CA014520支持。

&#160; &#160; &#160;注意：本方案描述了组织芯片（TMA）的染色与分析方法，此前已有相关报道12,17,18。4 µm 厚的 TMA 切片是使用标准切片机从石蜡包埋块中获取的。&#160;
&#160; &#160; &#160;注意：应为4种显色剂和复染剂建立光谱库，以进行图像定量分析。为此，需对每种抗体分别优化实验方案，并在每张切片上单独使用一种抗体，但省略最后的复染步骤。另需使用苏木精染色第五张切片&#160;，以获得创建光谱库所需的5张图像。
1. 多重免疫组织化学
<ol>
	<li>将载玻片置于 60 °C 烤箱中烘烤 20 分钟。在化学通风橱中，将载玻片浸入 100% 二甲苯中，更换新鲜二甲苯重复一次。</li>
	<li>将载玻片浸入 100% 乙醇中 5 分钟，更换新鲜 100% 乙醇重复一次。再将载玻片浸入 95% 乙醇中 3 分钟，更换新鲜 95% 乙醇重复一次。将载玻片浸入 70% 乙醇中 3 分钟，随后浸入蒸馏水中 3 分钟，更换新鲜蒸馏水重复一次。垂直轻敲载玻片以排干水分。在载玻片上加入 200 µl 即用型内源性过氧化物酶阻断剂，孵育 5 分钟。</li>
	<li>排干过氧化物酶阻断剂，将载玻片浸入 45 ml 即用型修复缓冲液（pH 小于 7.0）中。将盛有载玻片的容器放入压力锅中，设定程序为 124 °C 加热 4 分钟。加热结束后，静置压力锅冷却 20 分钟后再打开。</li>
	<li>取出修复缓冲液容器，继续冷却 10 分钟。用蒸馏水冲洗载玻片 10 分钟。排干水分后，用疏水屏障笔在载玻片上清晰圈出组织区域。</li>
	<li>加入 200 µl 磷酸盐缓冲液（PBS）。将载玻片转移至含有湿润纱布、带盖的平底孵育容器（孵育室）中。</li>
	<li>通过将 50 ml 20x&#160;Tris 缓冲盐水（含 1% Tween-20）与 950 ml 蒸馏水混合，配制 1 升 1x Tris-吐温缓冲盐水（TBST）。</li>
	<li>排干载玻片上的 PBS，加入 200 µl 1x TBST，孵育 2 分钟。排干 TBST 后将载玻片放回孵育室。加入 200 µl 即用型通用蛋白阻断剂，封闭孵育室，孵育 7 分钟。</li>
	<li>排干蛋白阻断剂，将载玻片放回孵育室。将抗 ERα 抗体按 1:400 稀释，即取 0.6 µl 抗体加入 239.4 µl 抗体稀释液中。向载玻片上加入 200 µl 稀释后的抗体，封闭孵育室。</li>
	<li>室温孵育 2 小时。排干抗体后用 TBST 冲洗，随后将载玻片浸入 TBST 中 5 分钟。</li>
	<li>排干 TBST，将载玻片放回孵育室。加入 200 µl 即用型山羊抗兔辣根过氧化物酶聚合物，封闭孵育室，室温孵育 30 分钟。用 TBST 冲洗载玻片，并将其浸入 TBST 容器中 5 分钟。</li>
	<li>通过将 8 µl DAB 显色剂加入 250 µl DAB 底物缓冲液中并充分混匀，配制棕色辣根过氧化物酶-3,3'-二氨基联苯胺（HRP-DAB）显色液。</li>
	<li>排干 TBST，将载玻片放回孵育室，加入 200 µl 棕色 HRP-DAB 显色液，孵育 6 分钟。用蒸馏水彻底冲洗载玻片，并将其放入盛有蒸馏水的容器中。</li>
	<li>将 50 µl 第一洗脱试剂与 150 µl 第二缓冲试剂混合，配制变性溶液。排干载玻片上的水分，加入稀释后的变性溶液，室温作用 3 分钟。倾去变性液，用 TBST 冲洗，随后将载玻片浸入 TBST 中 5 分钟。</li>
	<li>通过将 4.2 µl 抗 AR 抗体和 2.8 µl 抗 CD147 抗体加入 203 µl 抗体稀释液中，配制 AR/CD147 抗体混合液。排干 TBST，将载玻片放回孵育室，加入 200 µl AR/CD147 抗体混合液。封闭孵育室，室温孵育 1 小时。用 TBST 冲洗载玻片，并将其浸入 TBST 中 5 分钟。</li>
	<li>排干 TBST，将载玻片放回孵育室，加入 200 µl 即用型山羊抗兔碱性磷酸酶聚合物。封闭孵育室，室温孵育 30 分钟。用 TBST 冲洗载玻片，并将其浸入 TBST 中 5 分钟。</li>
	<li>通过将 3.2 µl 红色显色剂加入 250 µl 红色显色缓冲液中并充分混匀，配制红色碱性磷酸酶显色液。</li>
	<li>排干 TBST，将载玻片放回孵育室。加入 200 µl 稀释后的红色碱性磷酸酶显色液，封闭孵育室，孵育 7 分钟。</li>
	<li>排去显色液，用蒸馏水彻底冲洗载玻片。将载玻片放入盛有蒸馏水的容器中 5 分钟。排干水分，用 TBST 冲洗后放回孵育室。向载玻片上加入 200 µl 山羊抗小鼠-HRP 聚合物，封闭孵育室。室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>排去聚合物，用 TBST 冲洗。将载玻片浸入 TBST 中 5 分钟。通过向 250 µl 缓冲液中加入 3.2 µl 稳定剂并充分混匀，再加入 3.2 µl 紫色显色剂混匀，最后加入 3.2 µl 过氧化氢试剂并充分混匀，配制 200 µl 紫色 HRP 连接显色液。</li>
	<li>排干 TBST，向载玻片上加入 200 µl 配制好的紫色显色液，室温孵育 7 分钟。用蒸馏水冲洗载玻片，并将其放入盛有蒸馏水的容器中 5 分钟。</li>
	<li>将 50 µl 第一洗脱试剂与 150 µl 第二缓冲试剂混合，配制变性溶液。排干载玻片上的水分，加入稀释后的变性溶液，室温作用 3 分钟。</li>
	<li>用 TBST 冲洗去除变性试剂。将载玻片浸入 TBST 容器中 5 分钟。将抗 E-cadherin 抗体按 1:200 稀释，即取 1.1 µl 抗体加入 218.9 µl 抗体稀释液中。排干 TBST，将载玻片放回孵育室，加入 200 µl E-cadherin 抗体稀释液。封闭孵育室，室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 TBST 冲洗载玻片，并将其浸入 TBST 容器中 5 分钟。排干 TBST，将载玻片放回孵育室，加入 200 µl 山羊抗小鼠 HRP 聚合物。室温孵育 30 分钟。用 TBST 冲洗载玻片，并将其浸入 TBST 容器中 5 分钟。</li>
	<li>通过将 8 µl 显色剂加入 250 µl 缓冲液中，配制黑色 HRP 连接显色液。向载玻片上加入 200 µl 显色液，显色 2 分钟。用蒸馏水彻底冲洗载玻片，并将其浸入盛有蒸馏水的容器中。</li>
	<li>将 40 µl 苏木精加入 200 µl 蒸馏水中进行稀释。排干载玻片上的水分，加入 200 µl 稀释后的苏木精染液，染色 30 秒。用流动自来水彻底冲洗 2 分钟，再用蒸馏水冲洗 30 秒。将载玻片放入 60 °C 烤箱中烘烤 15–30 分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入新配制的 100% 二甲苯中 30 秒，擦去多余二甲苯，滴加一滴永久性封片剂，用 1.5 号盖玻片封片。</li>
</ol>
2. 自动化图像采集与分析
<ol>
	<li>将染色后的切片装载到自动切片扫描仪上。根据组织微阵列（TMA）核心的直径、间距和数量，依照制造商的操作手册创建自动扫描程序。</li>
	<li>打开多光谱成像软件，利用经单一发色剂染色的对照切片和苏木精染色切片构建光谱库。从一个对照切片获取的图像立方体中打开图像，选择四到五个阳性染色区域，以光学方式定义该发色剂。对其他对照切片的图像立方体重复此步骤，直至建立包含所有发色剂的完整光谱库，然后保存该光谱库。</li>
	<li>在多光谱成像软件中创建一个新项目。选择 &#34;多光谱（.im3）&#34; 用于图像格式选项以及 &#34;明场&#34; 样本格式。首先，通过选择所需的选项来配置项目： &#34;组织切段&#34;, &#34;查找特征&#34;, &#34;表型分析&#34;, &#34;评分&#34; 和 &#34;导出&#34;此时，可根据需要更改图像分辨率以加快分析速度。</li>
</ol>
3. 组织分割
<ol>
	<li>导入先前创建的光谱库，并选择所有要包含在分析中的发色团。</li>
	<li>通过选择打开要包含在训练数据集中的图像立方体 &#34;打开图像立方体&#34; 选项。为确保训练准确性，应选择至少占图像总数18%的图像用于分析。所选图像应涵盖所有疾病状态，以提高分割准确性。这部分图像称为图像训练集。</li>
	<li>通过选择训练集图像中的吸管工具，并点击某一图像中的白色区域来校正白平衡。</li>
	<li>选择 &#34;推进&#34; 按钮以进入组织分割。使用 &#34;组织分类&#34; 面板以选择待分析的组织类型（即 &#34;组织&#34; 和 &#34;非组织&#34;）。为了更精确地进行蛋白质组织定位，可以使用多种组织类别（即. &#34;上皮组织，&#34; &#34;基质，&#34; 和 &#34;非组织&#34;).</li>
	<li>开始创建算法并定义组织类别时，需在训练图像中围绕具有该组织类别特征的细胞群进行绘制。完成一个组织类别后，对其他组织类别重复此过程。务必选择图像内能够代表该组织类别类型的典型细胞群。</li>
	<li>对训练集中的所有图像重复此过程。</li>
	<li>选择要包含在训练中的组分（显色剂） &#34;组织分割器&#34;在进行明场免疫组化图像分析时，训练过程中通常应包含所有组分。训练集中应纳入大量阴性染色图像，以避免此步骤中产生偏差。</li>
	<li>选择合适的 &#34;模式量表&#34; 用于训练组织分割器。在20倍放大倍数下，通常选择较大的模式尺度较为合适。当在更高放大倍数下处理具有精细结构的组织时，选择较小的模式尺度更为合适。</li>
	<li>选择 &#34;训练组织分割器&#34; 单击按钮以开始训练组织分割器。观察弹出窗口中显示的准确率，该准确率反映的是训练区域内被正确分类的像素所占的比例。 
	注意：该软件会持续尝试提高算法的准确性，直至手动停止。我们先前已证明，在18%的图像上进行训练可达到97%的训练准确率 12.</li>
	<li>组织分割器训练完成后，选择合适的分割分辨率。分割分辨率与图像分割所需时间相对应，分辨率越粗糙，分割耗时越短；分辨率越精细，分割耗时越长。</li>
	<li>通过点击分割整个训练集图像 &#34;分割图像&#34;. 让软件有足够时间将算法应用于所有训练图像。完成后，检查训练集，查找当前训练算法下任何分类错误的组织。</li>
	<li>为优化组织分割过程，可添加、编辑或删除组织训练区域。使用 &#34;修剪边缘&#34; 如果像素从一种组织类别的边缘延伸至另一种组织类别，可选择此选项。若小群像素被错误分类，请调整最小片段大小的阈值。</li>
	<li>当编辑完成后，选择 &#34;分割图像&#34;这将重新训练组织分割器，以创建新的组织分割算法。先前的算法会自动保存，如有需要可随时恢复使用。</li>
	<li>当对组织分割算法结果满意后，选择进行细胞分割 &#34;推进&#34; 按钮</li>
</ol>
4. 细胞分割
<ol>
	<li>选择要包含在细胞分割中的亚细胞区室。确保 &#34;细胞核&#34; 已选中以进行选择 &#34;细胞质&#34; 或 &#34;膜&#34;. 
	注意： &#34;膜&#34; 仅当免疫组化（IHC）中包含膜特异性蛋白标志物（如 E-cadherin）时，才应选择进行细胞分割。</li>
	<li>在……之内 &#34;细胞核&#34; 选项卡中有多个选项。首先，选择合适的核分割设置（参见步骤 4.3）。选择在分割中包含单个组织类别还是全部组织类别。</li>
	<li>选择一种核分割方法
	<ol>
		<li>选择复染剂 &#34;基于像素（阈值）&#34; 一种简化的方法，可在不了解图像处理设置的情况下获得良好结果。 
		注意：这通常是较好的首选方案。在选择方法时， &#34;基于像素的（阈值）&#34; 在存在可靠的细胞核复染剂时更为合适，而 &#34;基于对象的&#34; 如果核复染不一致，则应使用。</li>
		<li>选择 &#34;基于像素的（阈值）&#34; 当存在可靠的细胞核复染时的处理方法。 
		注意：该方法完全基于像素。此方法也可用于其他可通过简单阈值满足的图像分析需求，例如检测组织类别中所有对免疫组化染色呈阳性的像素。</li>
		<li>如果核复染未能对核对象提供一致且特异的染色，则需选择基于对象的方法，并采用更高级的基于形态测量学的方法来检测细胞核。</li>
		<li>选择 &#34;细胞核分割组件&#34;, &#34;细胞核大小&#34;，以及 &#34;纯化&#34; 如果用户希望进一步定义细胞核分割设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择细胞质形态参数
	<ol>
		<li>选择 &#34;推进&#34; 点击按钮进入细胞质分割步骤。 
		注意：细胞质分割包含多种可选方案。其中称为 &#34;细胞核内距离&#34; 基于像素，反映细胞核外缘与细胞质内缘之间的距离。增大该值可降低核信号渗入细胞质区域的概率。</li>
		<li>接下来选择， &#34;细胞核外距离&#34;. 
		注意：此参数也为基于像素的测量。细胞核外距离反映的是细胞核外缘与细胞外缘之间的距离。根据需要，可将该值设置得较大或较小，以包含或排除膜信号。</li>
		<li>接下来选择， &#34;最小尺寸&#34;. 
		注意：基于像素的最小尺寸反映了可纳入分析的最小细胞质样本尺寸。若特定细胞的细胞质尺寸更小（例如细胞紧密堆积时），则该细胞质分割结果将被排除在分析之外。</li>
		<li>选择下一个选项， &#34;组分&#34; 与 &#34;初级&#34;, &#34;继发性&#34;，并选择 &#34;三级&#34; 作为次要选择。 
		注意：此处可选择特定的细胞质标记物。类似于核分割，如果使用了特定的细胞质免疫组化标记物，可通过寻找最小阈值来定义细胞质区域。这有助于更准确地界定细胞质，但对于达到可接受的准确性并非必需。</li>
		<li>进入三个选项卡中的最后一个选项 &#34;膜&#34;在此处，用户使用蛋白质标记物定义膜区室。选择 &#34;初级&#34;, &#34;继发性&#34;，和/或 &#34;三级&#34; 针对每种膜特异性标记物进行调整。 &#34;全量程光密度&#34; 确定细胞膜上每种标志物的最小阈值或阳性标准。</li>
		<li>继续在以下条件下 &#34;膜&#34; 标签页并选择相应选项 &#34;最大细胞尺寸&#34;. 
		注意：此为距膜距离值，单位为像素，用于指定细胞的最大尺寸。对于20倍放大倍数下拍摄的图像，通常设置为12较为合适。</li>
		<li>选择所有选项后，点击 &#34;图像分割&#34; 或 &#34;分割所有&#34;应用设置到图像并进行观察 &#34;单独地&#34; 或在 &#34;图集&#34; 模式。 
		注意：如有必要，调整设置和阈值，并重新进行分割，直至对训练集图像中的细胞分割结果满意为止。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞表型分析
&#160; &#160; &#160; &#160;注意：为获得准确的细胞表型分析结果，必须进行精确的细胞分割，且该表型分析功能具备可训练性。
<ol>
	<li>使用 &#34;添加&#34; 按钮将表型添加到 &#34;表型&#34; 列表中。用户可为表型选择颜色。</li>
	<li>点击 &#34;编辑表型&#34; 以将表型分配给细胞。点击特定细胞可弹出下拉菜单，用户可从中选择表型，然后继续操作。为继续下一步，每种表型至少需识别五个（5）个细胞。为获得最佳结果，每种表型需选择 25 个或更多细胞。</li>
</ol>
6. 免疫组化评分与共定位分析
<ol>
	<li>选择&#34;Advance&#34;进入&#34;Score IHC or IF&#34;步骤。选择一个&#34;Tissue Category&#34;进行评分。 
	注意：单次分析中仅能对一个组织类别进行评分，但如果需要获取其他组织类别的评分结果，可后续使用不同设置重复分析。</li>
	<li>选择所需的&#34;Scoring&#34;类型。 
	注意：阳性（Positivity）将目标组分分为两个区间（阳性与阴性），而双阳性（double positivity）用于共定位分析。其他选项包括针对所选标志物的4区间、10区间和50区间分析。</li>
	<li>选择用于评分分析的细胞&#34;Compartment&#34;。</li>
	<li>与确定主要核组分的最低阈值类似，选择&#34;View Component Data&#34;，并将光标移至训练图像上，以确定目标组分阳性细胞染色的适当光密度最低阈值。</li>
	<li>若需排除强烈染色的细胞，请将最大阈值调低至适当水平；否则，使用自动按钮为分析选择最大阈值。</li>
	<li>选择用于评分的训练图像，以验证阈值设定。 
	注意：特定区间内细胞的百分比将被返回，可通过视觉检查或手动计数进行比较。完成后，选择&#34;Advance&#34;进入&#34;Export&#34;步骤。</li>
</ol>
7. 应用算法与批量分析
<ol>
	<li>通过导出训练集数据来测试经组织分割、细胞分割和评分值所创建的算法。根据提示为导出目录创建新文件夹。选择要生成并包含在分析中的图像和表格。通过选择执行分析 &#34;全部导出&#34;.</li>
	<li>表格以制表符分隔的文本文件格式导出，可在大多数数据分析程序中打开。</li>
	<li>分析完成后，查看染色程度高和低的图像的细胞分割与评分数据，以评估参数设置的准确性。</li>
	<li>当对设置满意后，通过批量分析将从图像训练集创建的算法应用于全部图像。点击 &#34;批量分析&#34; 标签页，已打开的算法将从当前项目中复制。</li>
	<li>选择新的导出目录，并选择要包含在分析中的图像和表格。在输入文件选项下，选择 &#34;添加图片&#34; 并选择所有图像&#160;纳入批次分析。</li>
	<li>通过选择以下选项执行分析 &#34;运行&#34; 选项。与训练集的分析相同，此步骤所需时间长短不一，具体取决于分析中包含的图像数量及特定设置。</li>
	<li>完成后，进入下一步 &#34;审阅/合并&#34; 标签。批处理目录默认为批处理分析的导出目录，可根据需要进行更改。选择 &#34;包含全部&#34; 并选择 &#34;合并&#34; 创建包含汇总数据的数据表以供分析。</li>
</ol>
8. 导出数据的分析
<ol>
	<li>在数据分析软件中打开导出的表格，删除或隐藏与分析无关的数据列，例如各组分的最小值和最大值。分析所使用的主要数据位于每种组分的平均光密度列中。</li>
	<li>查看导出的分割图谱和原始图像，以确定哪些样本或组织芯片核心应从分析中排除。组织百分比值有助于判断是否纳入样本，通常以小于&#60;5% 作为排除标准。</li>
	<li>从数据分析中删除无关数据或包含应排除样本的行。</li>
	<li>利用蛋白质定量数据研究疾病状态的变化，或其与疾病临床病理特征之间的关系12,18-21。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

传统的免疫组织化学方法在评估蛋白质表达时，受限于主观的半定量分析手段22,23。为此，已开发出先进的平台，用于生物标志物表达及定位的高通量分析。通过对组织和亚细胞区域进行精细的分割，研究人员能够分析生物标志物的表达水平、定位情况以及与其他目标标志物的共定位关系。在先前的研究中，我们已证明免疫组织化学结合多光谱成像技术具有显著优势，尤其是在研究定位于相同细胞区域的蛋白质时18,20,21。当该技术与组织微阵列结合使用时24，相较于病理学家的手动分析，能够实现更快速、更客观的蛋白质表达定量。
使用免疫组织化学进行蛋白质定量的一个问题是，由于分析的主观性以及技术和试剂的固有差异，导致结果难以重复。采用多光谱成像等平台检测蛋白质表达的一个显著优势在于结果具有良好的可重复性。计算机化病理学平台所得数据与病理学家手工分析高度一致，同时以连续数值形式输出结果，并显著减少工作时间，尤其是在处理大样本量时12,16,25。研究表明，不同多光谱成像平台之间的结果总体具有高度一致性14。此外，我...

免疫组织化学（IHC）是一种在组织中检测蛋白质的标准实验技术，目前在科研和诊断病理学中仍被广泛使用。IHC染色结果的评估通常为半定量，这可能在结果解读中引入潜在的偏倚。已有多种半定量方法被开发出来，将染色强度和染色范围结合到最终诊断中1-4。其他评分系统还包括对染色强度和亚细胞定位进行评分，以更精确地确定蛋白表达位置5。为了减少单个观察者偏倚的影响，通常采用多位观察者评分的平均值6。尽管如此，分析过程中的主观性仍然存在，尤其是在评估染色范围时尤为明显7。因此，实现操作流程的标准化并尽量减少人为因素带来的主观性，对于获得准确且可重复的IHC结果至关重要。
除了免疫组织化学（IHC）外，还有其他方法可用于确定组织中的蛋白质表达。在研究环境中，免疫组织化学传统上被视为检测蛋白质定位的手段8，而其他技术如免疫印迹（immunoblotting）则被认为是研究蛋白质表达的金标准。若不结合细胞分馏或激光捕获显微切割等先进技术9,10，很难确定特定组织或细胞区室的表达情况。在组织切片上使用荧光抗体是一种较为合理的折中方案，但由于NADPH、脂褐素、网状纤维、胶原蛋白和弹性蛋白等引起的背景自发荧光，可能导致准确定量困难11。
自动化的计算病理学平台为更客观地定量病理染色提供了有前景的方向12-15。将多光谱成像与组织微阵列相结合，可实现对大样本量中蛋白质表达的高通量分析。利用这些技术，能够在显著减少分析过程中的固有偏差和所需时间的同时，对蛋白质共定位、染色异质性以及组织和亚细胞定位进行分析，并以连续形式而非分类形式返回数据16。因此，本研究的目的是展示利用多光谱成像软件进行多重免疫组织化学分析的应用价值及方法学。
本方案适用于单张组织切片的手动多重免疫组化染色，使用四种经过优化的单克隆抗体。以代表性实验为例，核定位的抗兔雌激素受体α（ERα）和雄激素受体（AR）与膜结合的抗小鼠CD147及膜结合的抗小鼠E-钙黏蛋白（E-cadherin）进行多重染色。文中所列抗体可用其他任意抗体替代，但每种抗体组合均需单独优化。所有抗体的预处理条件必须一致。AR和CD147抗体应先单独优化，再进行混合优化。每种抗体均采用非生物素聚合物系统检测，并分别结合四种不同的特异性显色剂。

<table><tbody><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3F1GAL</td><td>NFPA 等级：健康 &amp;ndash; 2，易燃性 &amp;ndash; 3，反应性 &amp;ndash; 0</td></tr><tr><td>乙醇-200 证明</td><td>Fisher Scientific</td><td>4355223</td><td>NFPA 等级：健康 &amp;ndash; 0，易燃性 &amp;ndash; 3，反应性 &amp;ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>NFPA 等级：健康 &amp;ndash; 2，易燃性 &amp;ndash; 0，反应性 &amp;ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris 羟甲基氨基甲烷盐酸盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td>NFPA 等级：健康 &amp;ndash; 2，易燃性 &amp;ndash; 0，反应性 &amp;ndash; 0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Chem-Impex</td><td>1512</td><td>NFPA 等级：健康 &amp;ndash; 0，易燃性 &amp;ndash; 1，反应性 &amp;ndash; 0</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td>NFPA 等级：健康 &amp;ndash; 1，易燃性 &amp;ndash; 0，反应性 &amp;ndash; 0</td></tr><tr><td>Peroxidazed</td><td>Biocare Medical</td><td>PX968</td><td>避免与皮肤和眼睛接触。可能导致皮肤刺激和眼部损伤。</td></tr><tr><td>雌激素受体 α</td><td>Thermo Fisher Scientific-Labvision</td><td>RM9101</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>雄激素受体</td><td>SCBT</td><td>sc-816</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>CD147</td><td>Biodesign</td><td>P87535M</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白</td><td>Dako</td><td>M3612</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>Renoir 红抗体稀释液</td><td>Biocare Medical</td><td>PD904</td><td>专为与基于 Tris 的抗体配合使用而设计</td></tr><tr><td>去封闭室&amp;nbsp;</td><td>Biocare Medical</td><td>Model DC2002</td><td>使用时需采取与使用压力锅相同的常规预防措施</td></tr><tr><td>屏障笔-Immuno Edge&amp;nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>变性试剂盒-洗脱步骤</td><td>Biocare Medical</td><td>DNS001H</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>Mach 2 山羊抗兔 HRP 聚合物</td><td>Biocare Medical</td><td>RHRP520</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>Mach 2 山羊抗兔 AP 聚合物</td><td>Biocare Medical</td><td>RALP525</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>Mach 2 山羊抗鼠 HRP 聚合物</td><td>Biocare Medical</td><td>M3M530</td><td>未被归类为危险品</td></tr><tr><td>Betazoid DAB 显色试剂盒</td><td>Biocare Medical</td><td>BDB2004</td><td>1. DAB 被认为是疑似致癌物。&lt;br/&gt; 2. 不要将 DAB 组分暴露于强光或直射阳光下。&lt;br/&gt; 3. 佩戴适当的个人防护装备和防护服。&lt;br/&gt; 4. DAB 可能引起皮肤致敏。避免与皮肤和眼睛接触。&lt;br/&gt; 5. 遵守所有联邦、州和地方关于废弃物处置的环境法规</td></tr><tr><td>Warp 红显色试剂盒</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806</td><td>具有腐蚀性。为酸性物质，可能导致皮肤刺激或眼部损伤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vina 绿显色试剂盒</td><td>Biocare Medical</td><td>BRR807</td><td>吞咽有害</td></tr><tr><td>Bajoran 紫显色试剂盒</td><td>Biocare Medical</td><td>BJP807</td><td>易燃液体。远离热源、火焰和火花。经口摄入或吸收有害。避免与皮肤或眼睛接触，避免吸入。</td></tr><tr><td>Cat 苏木精</td><td>Biocare Medical</td><td>CATHE</td><td>呈紫色&amp;nbsp;溶液&amp;nbsp;，带有&amp;nbsp;轻微&amp;nbsp;的&amp;nbsp;醋酸&amp;nbsp;（醋）&amp;nbsp;气味&amp;nbsp;。&amp;nbsp;可能&amp;nbsp;对&lt;br/&gt;&amp;nbsp;皮肤&amp;nbsp;或&amp;nbsp;眼睛&amp;nbsp;造成&amp;nbsp;刺激&amp;nbsp;。&amp;nbsp;避免&amp;nbsp;与&amp;nbsp;皮肤&amp;nbsp;和&amp;nbsp;眼睛&amp;nbsp;接触&amp;nbsp;。避免摄入。</td></tr><tr><td>XYL 封片介质</td><td>Richard Allen</td><td>8312-4</td><td>NFPA 等级：健康 &amp;ndash; 2，易燃性 &amp;ndash; 3，反应性 &amp;ndash; 0</td></tr><tr><td>1.5 盖玻片</td><td>Fisher Brand</td><td>22266858</td><td>边缘锋利</td></tr><tr><td>孵育（保湿）室</td><td>已淘汰</td><td>已淘汰</td><td>多个供应商可提供</td></tr><tr><td>对流烘箱</td><td>Stabil- Therm</td><td>C-4008-Q</td><td></td></tr><tr><td>Background Punisher 封闭试剂</td><td>Biocare Medical</td><td>BP974</td><td>本产品未被归类为危险品。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>inForm 软件</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS135781</td><td>手稿中使用的主要多光谱成像软件</td></tr><tr><td>Nuance 软件</td><td>PerkinElmer</td><td>Nuance EX</td><td>用于在手稿中构建光谱库的软件</td></tr><tr><td>Vectra 显微镜和切片扫描仪</td><td>PerkinElmer</td><td>VECTRA</td><td>用于获取 IM3 图像立方体的自动化切片扫描仪和显微镜</td></tr></tbody></table>

使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

免疫组织化学是一种常用的临床和科研实验室检测技术，用于研究蛋白质在组织中的表达与定位。目前已开发出多种半定量系统，用于对免疫组织化学结果进行评分，但其固有的主观性限制了结果的可重复性和准确性。此外，利用现有的免疫组织化学技术，难以对空间上重叠的生物标志物（如细胞核转录因子）进行研究。我们开发并优化了一种系统，可结合高通量的多重免疫组织化学与多光谱成像技术，实现对多种蛋白质的同步分析。该多重免疫组织化学方法通过依次应用一抗，并使用与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的二抗来实现。针对每种目标蛋白，采用不同的发色底物进行检测。染色后的切片被载入自动切片扫描仪，并建立自动图像采集的程序。通过在一系列切片上分别使用单一发色底物染色，建立光谱库。选取部分代表性染色图像导入多光谱成像软件，通过在图像上定义组织区域，建立区分组织类型的算法。利用苏木精复染对亚细胞结构进行分割，并调整内置算法。应用阈值设定以确定阳性信号及蛋白共定位情况。最终的算法将应用于全部组织样本。所得数据使用户能够根据组织类型（例如上皮组织与间质）和亚细胞区域（细胞核、细胞质、质膜）评估蛋白质表达水平。共定位分析可用于研究双阳性、双阴性以及单阳性细胞类型。将多光谱成像技术与多重免疫组织化学及自动图像采集相结合，是一种客观、高通量的组织内生物标志物研究方法。

在图1中，使用前列腺组织进行训练，将图像分割为上皮和间质部分，以及非组织区域。通过使用上皮细胞膜标志物E-cadherin，进行了细胞分割，以区分细胞核、细胞质和细胞膜部分，如图2所示。
在一项实验中，我们采用多重免疫组化（IHC）技术检测了AR、ERα、E-钙黏蛋白和CD147的表达与定位情况，如图3所示。利用这些技术，尽管存在显色信号重叠，我们仍能够识别出同时在细胞核中表达ERα和AR的阳性细胞（如图3A中绿色箭头所示，对应图3B–图3C）。我们发现，在不同前列腺疾病状态下，间质细胞中双阳性细胞的比例存在显著差异（图3D）。我们以E-钙黏蛋白作为标记蛋白（图3A中红色箭头所示），对...

免疫组织化学是一种用于评估组织内蛋白质定位和表达的强有力实验技术。目前用于定量的半自动化方法往往引入主观性，并常导致结果不可重复。本文中，我们描述了多重免疫组织化学的方法，以及利用多光谱成像对蛋白质表达和共定位进行客观定量的技术。

免疫组织化学是一种常用的临床和科研实验室检测技术，用于研究蛋白质在组织内的表达与定位……

本方法的总体目标是利用多光谱成像技术对蛋白质表达及共定位进行客观定量。该方法有助于解答基础研究和诊断病理学领域中的关键问题，例如蛋白质在处理干预后或疾病进展过程中表达和定位的变化情况。该技术的主要优势在于能够消除传统定量方法中固有的操作者主观性。开始定量分析时，打开多光谱成像软件，利用先前制备的对照切片建立光谱库，这些对照切片分别用单一发色剂以及苏木精染色。接着，打开从单个发色剂对照切片获取的图像立方体，选择四到五个阳性染色区域，以光学方式定义该发色剂的光谱特征。对其他对照切片的图像立方体重复上述步骤，直至建立包含所有发色剂的完整光谱库，然后保存该光谱库。在多光谱成像软件中创建一个新项目，选择 Multispectral 或 im3 作为图像格式选项，选择 Brightfield 作为样本格式。通过选择组织分割、特征识别、表型分析、评分和导出等步骤来配置项目。如有需要，可更改图像分辨率以加快分析速度。导入先前创建的光谱库，并选择所有要包含在分析中的显色剂。通过选择“打开图像立方体”选项，打开要包含在训练数据集中的图像立方体。为确保训练准确性，应选择至少占待分析图像总数18%的图像。接下来，选择图像的训练集。应包含代表所有疾病状态的图像，以提高分割的准确性。在训练集中纳入大量阴性染色图像，以避免此步骤中产生偏差。通过选择滴管工具，并在一幅图像中选取白色区域，对训练集中的图像进行白平衡。单击“下一步”按钮以进入组织分割。然后使用组织分类面板选择要分析的组织类型，以实现更精确的蛋白质组织定位，可使用组织分类功能。开始创建算法并定义组织类别：使用笔刷工具，在训练图像中围绕具有代表性的细胞群进行绘制。完成一个组织类别的标注后，对其他组织类别重复此步骤。务必选择图像中能够代表该组织类别类型的典型细胞群。选择要包含在组织分割器训练中的组件。选择合适的模式尺度以训练组织分割器，然后点击已训练的组织分割器按钮。观察弹出窗口中显示的训练区域像素分类准确率。单击“分割图像”以对整个训练图像集进行分割。完成分割后，检查训练集，查找当前训练算法下任何分类错误的组织区域。当对组织分割算法结果满意后，点击“下一步”按钮。确保已选择细胞核，以进一步选择细胞质和/或细胞膜。选择“细胞核”选项卡，并为细胞核分割选择适当的设置。然后选择在分割中包含单个或全部组织类别。选择基于计数染色对象的阈值方法，以简化操作并获得良好结果。接下来，选择基于可靠核计数染色的对象阈值方法。通过选择“细胞质”选项卡来选取细胞质形态参数。接着，选择细胞核外距离。然后选择最小尺寸。选择下一个组件选项，其中主选项为 primary，次选项为 secondary 和 select tertiary。转到膜组分标签页，选择用于膜特异性标记物的第一个选项。调整全量程光密度（OD），以确定细胞膜上每种标记物的最低阈值或阳性信号。在

quantitation-protein-expression-co-localization-using-multiplexed

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

蛋白表达和共定位使用复用免疫组织化学染色和多光谱成像定量

复杂的组织团块，从器官到肿瘤，均由多种细胞成分构成。我们利用多重荧光标记的转基因小鼠，结合多参数免疫荧光染色及光谱解混技术，解析了组织内不同细胞表型的贡献，从而根据蛋白质表达情况确定细胞来源及其特性。...

荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。...

用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

本文介绍了一种用于淋巴瘤组织中多种癌症相关抗原同时定位的多重荧光免疫组织化学染色与成像方案。该方案可推广应用于所有组织切片中生物标志物的共定位分析。...

淋巴瘤组织样本中多重荧光免疫组织化学染色、成像与分析

本文介绍一种简单且易于实施的策略，用于对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片中的免疫细胞进行可视化、定量和定位分析。该方法结合了现有的成像技术和数字分析手段，旨在拓展成像检测的多重检测能力和多参数分析水平。...

肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

多重条形码成像分析技术最近显著改进了对肿瘤微环境的表征，使得能够全面研究细胞组成、功能状态以及细胞间相互作用。本文中，我们描述了一种染色与成像方案，该方案利用寡核苷酸偶联抗体的条形码技术和循环成像，从而实现高维成像 分析技术的应用。...

用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析

本文介绍了一种手动酪胺信号放大（TSA）多重免疫荧光（mIF）染色结合图像分析与空间分析的实验方案。该方案可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，每张切片可检测两至六种抗原，具体数量取决于实验室所配备的切片扫描仪。...

多重免疫荧光结合空间图像分析用于肿瘤微环境的临床与生物学评估

本实验方案描述并优化了一种多重免疫组织化学（IHC）染色方法，主要通过优化单通道抗体孵育条件，并调整抗体与通道的设置，以解决来源于临床肺癌组织中的自发荧光和通道串扰问题。...

多重免疫组织化学染色法用于石蜡包埋的肺癌组织

本报告介绍了一种在自动化载片染色机上进行多重免疫荧光（mIF）检测的自动化方案。该方案展示了在标准高通量组织自动染色机和全片荧光成像系统上实现空间蛋白质组学的高度可重复性，非常适合在转化研究中对大量组织切片进行定制化的mIF检测。...

用于转化研究的高通量自动化多重免疫荧光检测方法

本方案详细介绍了在福尔马林固定石蜡包埋组织切片中进行多重 mRNA...

双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

学习多重免疫组织化学染色结合多光谱成像技术，用于客观定量蛋白质表达和共定位分析。该方法消除传统定量中的人为主观性，提高神经科学和病理学研究的可重复性与准确性。

使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

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