蛋白表达和共定位使用复用免疫组织化学染色和多光谱成像定量

该方法的总体目标是使用多光谱成像客观定量蛋白质表达和共定位。这种方法可以帮助回答基础研究和诊断病理学领域的关键问题，例如蛋白质在治疗后或疾病进展中如何改变表达和定位。该技术的主要优点是它消除了传统定量方法固有的作员主观性。

要开始定量过程，请打开多光谱成像软件，从先前制备的用单个显色剂染色的对照载玻片和苏木精染色载玻片构建光谱库。接下来，打开从对照玻片采集的图像立方体，并选择 4 到 5 个阳性染色区域以光学定义色原。对来自其他对照玻片的图像立方体重复这些步骤，直到创建代表所有色原的完整光谱库，然后保存光谱库。

通过选择多光谱或 im3 作为图像格式选项，并选择 Brightfield 作为样品格式，在多光谱成像软件中开始新项目。通过选择 segment tissue、find features、phenotyping、score 和 export 来配置项目。如果需要，更改图像分辨率以加快分析时间。

导入先前创建的光谱库并选择要包含在分析中的所有色原。通过选择 Open Image Cube 选项，打开要包含在训练数据集中的图像立方体。选择至少 18% 的 Image 总数进行分析，以确保训练的准确性。

接下来，选择图像的训练集。代表所有疾病状态的图像，以提高分割准确性。在训练集中包含丰富的负染色图像，以避免此步骤中的偏差。

通过选择吸管工具，并在一张图像中选择一个白色区域，对训练集中的图像进行白平衡。选择高级按钮以移动组织分割。然后使用组织类别面板选择要分析的组织类型，以便更准确地定位蛋白质组织，选择可以使用的组织类别。

通过使用钢笔工具开始创建算法并定义组织类别，并在训练图像中的单元格组周围绘制。完成一个组织类别后，对其他组织类别重复此步骤。确保在图像中选择具有组织类别类型特征的单元格组。

选择要包含在组织分割器训练中的组分。选择合适的模式量表来训练组织分割器。然后选择 trained tissue segmenter 按钮。

观察一个弹出框，该框显示正确分类的训练区域内像素比例的准确性。单击 Segment images 来分割整个训练图像集。完成后，查看训练集以查找使用当前训练算法错误分类的组织。

如果对组织分割算法结果有信心，请选择高级按钮。确保已经选择了细胞核以选择细胞质和/或膜。选择 nuclei （细胞核） 选项卡，然后为 nuclear segmentation （核分割） 选择适当的设置。

然后选择是单个组织类别还是所有组织类别都包含在分割中。选择基于复染对象的阈值方法，以获得获得良好结果的简化方法。接下来，选择基于可靠核复染剂的基于对象的阈值方法。

通过选择 cytoplasm （细胞质） 选项卡来选择细胞质形状的参数。接下来，选择 outer distance to nucleus（到细胞核的外部距离）。然后选择 最小大小.

选择下一个选项组件，其中包含 primary、secondary 并选择 tertiary 作为 secondary 选项。移动到 membrane 选项卡。首先为使用的膜特异性标记物选择。

调整满量程光密度或 OD 以找到细胞膜上每个标记物的最小阈值或阳性值。继续在 membrane 选项卡下选择最大细胞大小。选择所有选项后，选择 segment all （全部细分）。

将设置应用于图像并观察它们。选择 Advance （高级） 进入评分 IHC 步骤，然后选择要评分的组织类别。选择所需的评分类型，然后选择要在评分分析中使用的单元格隔离舱。

接下来，选择 view component data 并将光标移动到训练图像上，以找到感兴趣的组分的阳性细胞的适当光密度最小染色阈值。导出训练集的数据以测试通过组织分割创建的算法，单元格分割和评分值按照提示为导出目录创建新文件夹。选择要创建并包含在分析中的图像和表格。

接下来，通过选择 Export for all （导出全部） 来执行分析。分析完成后，查看具有高染色和低染色的图像的细胞分割和评分数据，以评估设置的准确性。对设置感到满意后，单击 batch analysis 选项卡，将算法复制到活动项目。

然后选择新的导出目录，并选择要包含在分析中的图像和表。在 input files 选项下，选择要包含在批处理分析中的所有图像。选择 run 选项以执行分析。

完成后，前进到"查看合并"选项卡。选择"全部包括"，然后选择"合并"以创建包含摘要数据的数据工作表以进行分析。对前列腺组织进行训练，将图像分割成上皮和基质部分。

以及一个非组织隔室。将一组训练图像导入多光谱成像软件中，代表整组图像的组织类型和疾病状态。创建了组织类别，包括基质、上皮细胞和非组织，并通过在训练图像上手动绘制来定义类别。

创建了一个组织分割算法，并将其应用于图像的训练集。准确分割组织。使用多重免疫组织化学技术，尽管颜色和度量信号重叠，但鉴定出 ER-α 核表达阳性的细胞（显示为红色）和 AR （显示为棕色）通过使用被视为黑色的 E-catherine 作为标记蛋白来定量 CD-147 的细胞膜特异性表达。

观看此视频后，您应该对如何定量蛋白质表达和共定位、告知和固定石蜡包埋组织有很好的了解。