使用染料标记的磁性微球进行多重定量细菌检测

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取一个测定板,其中含有磁性聚苯乙烯微球的混合物,内部用光谱不同的荧光团染色。

每个微球组都与不同的病原菌特异性捕获抗体共价偶联。

加入热杀死的病原菌混合物。孵化。

捕获抗体结合靶细菌抗原,形成微球-细菌复合物。

使用磁选机沉降复合物。丢弃未结合的细菌并用缓冲液洗涤。

添加缓冲液和生物素化检测抗体,它们与微球结合的细菌特异性结合。

磁性分离复合物并用缓冲液洗涤。

复合物重悬于缓冲液中。移液报告分子,包括荧光团偶联链霉亲和素,与生物素化检测抗体结合。

磁性分离并清洗复合物。重悬于缓冲液中。

在基于流动的分析过程中,第一个激光激发微球的内部荧光团,产生独特的光谱特征并识别独特的微球组。

第二激光激发与微球上细菌结合的荧光团报告基因,定量各种微球组上的细菌,实现多重定量细菌检测。

对于样品捕获,首先将 50 微升微球或偶联以捕获抗体的珠子添加到 96 孔板中。然后,将 50 微升病原菌和 50 微升 PBS-TBN 加入背景孔中。

用铝箔板密封盖住板,并在板摇床上以八百转/分孵育一小时。

然后,将板放在磁选机上 1 分钟以分离珠子。排出剩余的溶液,同时将板保持在磁板分离器上。然后,在实验室纸巾上轻拍擦干三到四次。用PBS-TBN彻底清洗孔两次。

对于样品检测,将 50 微升测定缓冲液和 50 微升浓度为每毫升 4 微克的生物素化检测抗体加入孔中。

将板在黑暗中孵育一小时,以允许细菌和检测抗体之间有效相互作用。随后,使用磁选机分离珠子并用PBS-TBN洗涤珠子,如前所述。

珠子重悬于50微升测定缓冲液中,并加入50微升链霉亲和素-R-藻红蛋白或SAPE,一种荧光报告分子。用铝箔板密封盖住板,并在摇板器上孵育30分钟。

涤孔后,将珠子重悬于 100 微升 PBS-TBN 中,并将板加载到基于流量的分析仪上。

使用适当的软件记录读数。可以通过标准曲线评估每种生物体的净荧光强度中位数值,以确定样品中存在的细菌载量。

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Last updated: 4 July 2026