在复杂的临床和环境样本使用寡核苷酸加上荧光微多元检测细菌
October 23rd, 2011
我们描述了一个复用的微生物样本内使用寡核苷酸耦合的荧光珠的检测方法。从样本内的所有生物体的扩增杂交的探针耦合珠小组。一个Luminex公司或生物复杂的仪器是用于查询每个珠珠型和杂交信号。
大家好，我是加拿大农业和农业食品部的 Tim Duso。在本视频中，我们将演示一种使用 bio plex 仪器确定复杂临床或环境样品中特定微生物的存在和丰度的方案。该方案使用荧光聚苯乙烯珠子，这些珠子与物种特异性寡核苷酸探针化学偶联。
使用通用 PCR 引物从样品中生成扩增子，并将扩增子与探针偶联珠杂交。使用 bio plex 仪器生成两个信号。一个识别磁珠，一个量化杂交信号。
该程序的总体目标是以快速和半定量的方式确定感兴趣的微生物群的概况。我们应用这项技术来确定阴道拭子中的细菌谱，并使用生成的数据来诊断细菌性阴道病，这是一种以微生物群变化为特征的临床病症，其中乳酸菌微生物变得不那么普遍，而其他生物体（如 Gardnerella、vais 和 apoian vae）在阴道拭子中变得可检测到。然而，重要的是要记住，该技术可以应用于需要快速多重检测的任何其他微生物群。
让我们首先描述该过程的工作原理。通过扩增蛋白质并在拭子 DNA 提取物中存在的所有生物体中包被基因伴侣 60 来生成微生物谱。其中一种通用扩增引物通过添加生物素以及加入磷酸化修饰碱基进行修饰。
在五个主要末端，扩增子使用 T 7 外显子核酸酶制成单链，它仅降解反义链。由于正义链受到磷酸化修饰的 PCR 引物的保护，因此与剩余链互补的寡核苷酸探针与荧光聚苯乙烯珠共价偶联。由于每种独特的微珠颜色都包含一个检测不同生物体的探针，因此单个样品可以使用多达一百种不同的微珠。
将阴道拭子的单链 PCR 产物与包含所有目标生物体探针的探针偶联珠混合物杂交。加入荧光报告基因 FICO ethin，该基因通过 strep din 偶联物与生物素化探针结合。最后，在 luminex 或 bio plex 仪器上分析杂交混合物，该仪器单独检查每个微珠的鉴定和杂交信号。
该分析的结果表明存在特定微生物，并且杂交信号的强度与该生物体的丰度相关。在样本中，BV 相关生物体的存在可用于诊断 bv。与大染色等现有方法相比，该技术的主要优点是可以生成有关特定微生物的存在及其丰度的信息。
演示该程序的是研究助理 Jennifer Town，在我们的实验室中，Re 通过涡旋约 20 秒来悬浮微球。将 400 微升微球转移到 14， 000 倍 G 的 einor 管离心机中，离心 1 分钟，取出并丢弃 snat Resus。将微球悬浮在 50 微升 0.1 摩尔 MES pH 4.5 中。
向微球中加入一个捕获寡核苷酸的 animo，并通过涡旋混合。向微球中加入 2.5 微升新鲜的 EDC 溶液。将反应物在室温下避光孵育 30 分钟。
丢弃之前制备的 EDC 溶液，并在水中制备 10 毫克/毫升 EDC 的新鲜样品。如上所述，向微球中再加入 2.5 μL 新鲜 EDC 溶液，涡旋 5 秒钟。在室温下避光再次孵育 30 分钟。
通过加入 1 毫升 0.02%Tween 20 涡旋洗涤珠子，以 14， 000 次 G 离心重悬珠子，一分钟，取出并丢弃上清液。加入 1 毫升 0.1% SDS Resus 再次洗涤珠子。将磁珠悬浮在 100 μL te 缓冲液中。
在血细胞仪中计数珠子以确定原液浓度。通过将每个珠子稀释至终浓度为每微升 100 个珠子，制备微球预混液，根据所需的测定复合度，在缓冲池中混合偶联的珠子将微球预混液在黑暗中储存在 4 度。如果在这些条件下保存，这种混合物可以储存数月，为每个样品生成 PCR 产物。
在 PCR 完成后立即包括磷酸酸盐和生物素修饰的五引物组。向每个 PCR 管中加入 2 μL T 7 核酸外切酶，在室温下孵育 40 分钟。在此孵育结束时，加入 12.5 微升 0.5 摩尔 E-D-T-A-P-H 8.0 混合物。
这得到了总共约 64.5 μL 的单链 PCR 产物。使用移液器的 Resus Bend Microsphere 预混液。取适量分装到酒管中。
盖上试管，在水浴 sonica 中超声处理 2 分钟。将 17 μL 单链 PCR 产物分配到低容 96 的相应孔中。孔板向每个孔板中加入 33 微升重悬超声珠混合物。
用硅胶盖和水龙头盖住板。轻轻地将板放入热循环仪中，程序为 95 度 5 分钟，60 度 10 分钟，60 度保持或暂停 60 度 5 分钟。结束，启动程序。
制作新鲜的链球菌 Aden FICO Ethin 溶液。每孔需要 25 μL。以每毫升 1 毫克稀释茎秆，制成链球菌和 FICO ethin。
50 至 20 μg/mL，含 1 倍 tmac 缓冲液。当热循环仪达到 60 度保持步骤时，打开盖子，取下硅胶盖，然后将 strep din FICO ethin 溶液直接添加到每个步骤中。好，装回硅胶盖，盖上热循环仪盖，然后继续程序。
程序完成后，取出板并快速将其转移到 bio plex 机器上进行读取。应在 10 分钟内读取板。以 60 度读取板。
确保 bio plex 已预热至此温度。这显示了在时间零时来自单个个体的纵向样品的相应革兰氏染色和发光曲线的结果。革兰染色与 bv 的临床诊断一致，Fiveplex Luminex 检测证实了这一点，该检测显示 BV 相关生物体（包括 Gardner Relic、vais 和 Apoian Vae）的阳性杂交信号。
随着时间的推移，乳酸菌 Iners 也被检测到低水平。如革兰氏染色所示，该个体从 BV 微生物群转变为正常微生物群。对这些相同样品的 Luminex 分析表明，Gardnerella vaginalis 丰度达到顶峰和减弱，而乳酸菌 iners 增加，在最后时间点成为优势生物。
使用这种方法来分析微生物群，可以生成有关特定生物体的存在及其丰度的信息。由于该方法是基于序列的，因此可以通过深度测序分析来了解探针设计，并且可以通过下一代测序方法以快速、相对低成本的方式在样品中跟踪鉴定的微生物。观看此视频后，您应该已经很好地了解如何使用 Luminex 或 Bio Plex 仪器从样品中生成微生物谱。
我们向您展示了如何将寡核苷酸探针偶联到荧光珠上，从临床或环境样品中生成单链 alicon，进行杂交，并在 Luminex 或 Bio Plex 仪器上确定结果。祝你的实验好运。
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概述
本文介绍了一种使用寡核苷酸耦合荧光珠检测复杂样品中微生物的协议。该方法使用Bio-Plex仪器分析珠子的杂交信号。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 临床诊断
- 环境科学
背景
- 微生物的检测在各个领域中至关重要。
- 传统方法可能耗时且特异性较低。
- 该方法提高了特异性和灵敏度。
- 荧光珠允许多重分析能力。
研究目的
- 开发一种快速高效的微生物检测方法。
- 使用寡核苷酸探针以获得特异性。
- 展示Bio-Plex仪器在此背景下的应用。
使用的方法
- 使用与特定物种相关联的探针耦合的荧光聚苯珠。
- 使用通用PCR引物生成扩增子。
- 扩增子与探针耦合的珠子进行杂交。
- 使用Bio-Plex仪器分析珠子类型和杂交信号。
主要结果
- 成功在单次检测中检测到多种微生物。
- 证明了杂交信号的定量分析。
- 协议已针对临床和环境样品进行验证。
- 该方法实现了高特异性和高灵敏度。
结论
- 该多重方法对微生物检测有效。
- 使用寡核苷酸探针提高了特异性。
- Bio-Plex仪器是这种分析的有价值工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multiplex detection using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres enables rapid, semi-quantitative profiling of complex microbial communities in clinical and environmental samples. This approach enhances predictive confidence in microbial diagnostics by providing species-level resolution and abundance data, supporting critical inflection points in translational research and assay development. Its scalability and adaptability position it as a reusable platform for portfolio-wide microbial surveillance and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial community shifts relevant to disease mechanisms and therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional target validation by quantifying specific organism abundance in complex samples.
- Facilitates biological de-risking through high-specificity detection of clinically relevant taxa.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed detection systems for downstream diagnostic and screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and semi-quantitative microbial profiles for assay benchmarking.
- Enables scalable expansion to detect up to 100 organisms per sample, supporting platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by tracking disease-associated microbial shifts longitudinally.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling rapid, sequence-informed probe design.
- Reduces mechanistic ambiguity in disease models by delivering organism-specific abundance data.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplex platform integrates from early discovery through lead identification and translational research, supporting hypothesis-driven microbial profiling and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by profiling microbiota composition and abundance.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for reliable comparison across samples and conditions.
- Analytics: Provides hybridization signal intensity as a quantitative readout for organism abundance.
- Translational Research: Enables longitudinal tracking of disease-relevant microbial biomarkers.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse sample types and microbial targets, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by enabling species-level detection in complex samples.
- Operational Value: Standardizes and scales multiplex microbial profiling for high-throughput applications.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage risk by providing actionable microbial data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diagnostic and therapeutic programs targeting microbiome-associated conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular probe design and PCR-based workflows.
- Needs access to Luminex or Bio-Plex instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of probe sets and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable across clinical and environmental sample types with appropriate probe customization.
- Limited by the need for sequence information to inform probe design and potential cross-reactivity in highly diverse communities.
