使用寡核苷酸偶联荧光微球在复杂临床和环境样本中进行细菌多重检测

大家好，我是加拿大农业与农业食品部的 Tim Duso。在本视频中，我们将演示一种利用 Bio-Plex 仪器检测复杂临床或环境样本中特定微生物存在与否及其丰度的实验方案。该方案使用了经化学偶联至物种特异性寡核苷酸探针的荧光聚苯乙烯微球。

使用通用PCR引物从样本中扩增出扩增子，该扩增子与连接有探针的微球进行杂交。通过Bio-Plex仪器产生两个信号：一个用于识别微球，另一个用于定量杂交信号。

该实验方法的总体目标是以快速且半定量的方式确定目标微生物群的特征谱型。我们已应用此技术检测阴道拭子中的细菌谱型，并利用所获得的数据诊断细菌性阴道病——一种临床病症，其特征是微生物群发生变化，即乳杆菌类微生物减少，而加德纳菌（Gardnerella）、阴道加德纳菌（vais）和阿波安菌（apoian vae）等其他微生物在阴道拭子中变得可检出。然而需要明确的是，该技术也可适用于任何其他需要快速多重检测的微生物群。

首先让我们描述一下该实验流程的工作原理。通过扩增所有存在于拭子DNA提取物中的生物体的编码60种蛋白和伴侣基因的片段，来生成微生物谱。其中一种通用扩增引物经过修饰，添加了生物素以及磷酸化修饰的碱基。

在5'端，使用T7外切核酸酶使扩增产物变为单链，该酶仅降解反义链。由于正义链受到磷酸化修饰的PCR引物保护，因此可与剩余单链互补的寡核苷酸探针能够共价连接到荧光聚苯乙烯微球上。每种独特颜色的微球携带可检测不同生物体的探针，单个样本中最多可使用多达100种不同的微球。

将来自阴道拭子的单链PCR产物与含有所有目标生物体探针的探针偶联微球混合物进行杂交。加入荧光报告分子FICO ethin，该分子通过链霉亲和素-生物素复合物与生物素化的探针结合。最后，在Luminex或Bio-Plex仪器上分析杂交混合物，该仪器对每个微球分别进行身份识别和杂交信号检测。

该分析结果表明存在特定的微生物，且杂交信号的强度与该生物体的丰度相关。在样本中，可利用与细菌性阴道病（BV）相关微生物的存在来诊断BV。与革兰染色等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够提供特定微生物的存在信息及其丰度。

演示该实验步骤的是本实验室的研究助理 Jennifer Town。将微球通过涡旋振荡约 20 秒以重悬。取 400 µL 微球转移至离心管中，在 14,000 ×g 条件下离心 1 分钟，弃去上清液。用 50 µL 0.1 M MES 缓冲液（pH 4.5）重悬微球。

向微球中加入一条捕获寡核苷酸，并通过涡旋混合。向微球中加入2.5 µL新鲜EDC溶液。将反应体系于室温避光孵育30分钟。

弃去先前配制的 EDC 溶液，重新配制 10 毫克/毫升 EDC 的水溶液。如上所述，向微球中加入 2.5 微升新鲜 EDC 溶液，涡旋混匀 5 秒。再次于室温下避光孵育 30 分钟。

加入1毫升0.02% Tween 20，涡旋振荡以重悬珠子，在14,000 × g离心1分钟，移除并弃去上清液。再加入1毫升0.1% SDS重悬珠子，洗涤珠子一次。将珠子重悬于100微升TE缓冲液中。

使用血细胞计数板对珠子进行计数，以确定储存浓度。通过将每种珠子稀释至终浓度为每微升100个珠子，制备微球母液混合物，并根据检测所需的多重数将偶联珠子混合。将微球母液混合物置于4°C避光保存。若保持此条件，该混合物可保存数月。为每个样品制备PCR产物。

PCR 完成后立即加入磷酸化和生物素修饰的5'引物对。每个PCR管中加入2 µL T7外切酶，室温孵育40分钟。孵育结束后，向混合物中加入12.5 µL 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0。

这将得到约 64.5 µL 的单链 PCR 产物。用移液器重悬磁珠主混合液。取适量加入离心管中。

盖上管盖，并在水浴超声仪中进行超声处理，持续两分钟。将17 µL单链PCR产物加入低矮型96孔板的相应孔中，然后向每孔加入33 µL重悬的超声处理磁珠混合液。

用硅胶盖盖好培养板并轻弹。将培养板轻轻放入热循环仪中，运行以下程序：95°C 5分钟，60°C 10分钟，60°C 保持或暂停5分钟。结束，启动程序。

配制新鲜的链霉亲和素-FITC-乙胺溶液。每孔需要25 µL。通过将储存液稀释至1 mg/mL来配制链霉亲和素和FITC-乙胺溶液。

每50至20微克/毫升加入一倍体积的tmac缓冲液。当PCR仪运行至60摄氏度孵育步骤时，打开盖子，移去硅胶盖，直接向每个孔中加入链霉亲和素-藻红蛋白溶液，重新盖上硅胶盖，关闭PCR仪盖子，并继续运行程序。

程序完成后，取出培养板并迅速转移至 BioPlex 仪器进行读数。应在 10 分钟内完成读板。在 60 度下读取培养板。

确保生物plex仪已预热至该温度。此图显示了来自单个个体在时间零点的纵向样本对应的革兰染色和Luminex检测结果。革兰染色结果与细菌性阴道病（bv）的临床诊断一致，且通过五重Luminex检测得到证实，该检测显示与bv相关的微生物（包括Gardnerella、vais和Apoian Vae）呈阳性杂交信号。

随着时间的推移，惰性乳杆菌（Lactobacillus iners）的检出水平较低。该个体的阴道微生物群从细菌性阴道病（BV）型转变为正常型，革兰染色结果可证明这一点。对相同样本进行的Luminex分析显示，阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）的丰度先升高后下降，而惰性乳杆菌逐渐增加，并在最终时间点成为优势菌种。

使用该方法进行微生物群分析，可获得特定生物体的存在情况及其丰度信息。由于该方法基于序列，探针设计可依据深度测序分析结果，从而能够以快速、相对低成本的方式，对通过下一代测序方法鉴定出的微生物在样本中进行追踪。观看本视频后，您应已充分了解如何利用 Luminex 或 Bio Plex 仪器从样本中生成微生物谱型。

我们向您展示了如何将寡核苷酸探针偶联到荧光微球上，从临床或环境样本中制备单链扩增产物，进行杂交反应，并在Luminex或Bio Plex仪器上读取结果。祝您的实验顺利成功。