中性粒细胞蛋白的分离和消化

从装有中性粒细胞的试管开始。加入含有蛋白酶抑制剂的缓冲液以防止蛋白质降解。

添加合适的洗涤剂使中性粒细胞膜透化

在冰浴中，用高频声波对样品进行超声处理，破坏细胞膜，释放细胞内内容物，包括各种蛋白质。

短暂离心以从管壁收集内容物并将它们转移到合适的管中。

引入还原剂并在高温下孵育，以促进二硫键裂解，使蛋白质变性。

冷却并引入烷化试剂，使巯基烷化。

加入冷丙酮诱导蛋白质沉淀。

心以沉淀蛋白质和细胞片段。除去上清液，风干。

引入含有变性剂的缓冲液并超声处理以重新溶解蛋白质沉淀。

最后，添加可切割蛋白质的蛋白酶混合物。储存样品以供进一步处理。

首先，将中性粒细胞分化的HL60细胞收集在15毫升管中，将样品以400倍g 离心5分钟。

通过加入 15 毫升 PBS 洗涤细胞沉淀两次，并以 400 倍 g 再次离心 5 分钟。

每个样品中加入300微升冰冷的100毫摩尔盐酸Tris pH 8.5，其中含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒片剂，并短暂涡旋。

然后，加入 1 x 10 体积的 20% SDS 至最终浓度为 2%，并在冰浴中对样品进行探针超声处理 30 秒，关闭 30 秒，以 10% 的功率进行五个循环。

要收集管壁上的喷雾，请以最大速度离心样品 5 至 10 秒，不要让细胞碎片形成沉淀。

样品从 15 毫升管转移到 2 毫升管中，并加入 1 x 100 体积的 1 摩尔储备液二硫苏糖醇至终浓度为 10 毫摩尔。

短暂涡旋后，将样品在 95 摄氏度下孵育 10 分钟，并以 800 rpm 摇动。然后，将样品放在冰上，将其冷却至室温。

接下来，在黑暗条件下，加入 1 x 10 体积的 0.55 摩尔碘乙酰胺至终浓度为 55 毫摩尔，并涡旋试管，然后在室温下在黑暗中孵育 20 分钟。

孵育结束时，加入 100% 冰冷丙酮至终浓度为 80%。将样品在零下 20 摄氏度下储存过夜。将它们存放长达两周以备后用。

第二天，将样品在 4 摄氏度下以 13,500 rpm 离心 10 分钟，以沉淀细胞沉淀。通过加入 500 微升 80% 冰冷丙酮洗涤细胞沉淀两次，然后在 13,500 rpm 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。

在风干的细胞沉淀中，在40毫摩尔HEPES中加入100微升8摩尔尿素，并在4摄氏度水浴中水超声处理30秒，关闭30秒，持续15个循环，以在定量蛋白质之前重新溶解蛋白质沉淀。

接下来，加入 300 微升碳酸氢铵，将样品稀释至终浓度为 2 摩尔尿素。要消化 50 微克蛋白质，请将胰蛋白酶和赖氨酸 C 以 1 比 50 的酶与蛋白质比例添加到冰上的样品中。

轻轻敲击混合样品，并在室温下孵育过夜以进行消化。然后，继续进行肽纯化方案。