中性粒细胞蛋白质的分离与消化

从含有中性粒细胞的试管开始。加入含有蛋白酶抑制剂的缓冲液，以防止蛋白质降解。

加入适当的去垢剂以透化 中性粒细胞膜 

将样品置于冰浴中，用高频声波进行超声处理，以破坏细胞膜，释放细胞内含物，包括各种蛋白质。

短暂离心以收集管壁上的内容物，并转移至合适的试管中。

加入还原剂并在高温下孵育，以促进二硫键断裂，导致蛋白质变性。

冷却后加入烷基化试剂，使巯基发生烷基化。

加入冷丙酮以诱导蛋白质沉淀。

离心以沉淀蛋白质和细胞碎片。去除上清液，并风干。

加入含有变性剂的缓冲液，并进行超声处理，以重新溶解蛋白质沉淀。

最后，加入可切割蛋白质的蛋白酶混合物。将样品保存以用于后续处理。

首先，通过在400 × g条件下离心，将中性粒细胞分化的HL60细胞收集至15毫升离心管中 g 5 分钟。

加入15毫升PBS重悬细胞沉淀，洗涤两次，每次在400 × g 条件下离心5分钟。

向每个样品中加入 300 微升含蛋白酶抑制剂混合片的预冷 100 毫摩尔/升 Tris HCl（pH 8.5）溶液，并短暂涡旋混匀。

然后，逐滴加入总体积十分之一的20% SDS，使终浓度为2%，将样品置于冰浴中进行探头超声处理，每次超声30秒，间隔30秒，共循环5次，超声功率为10%。

为收集管壁上的液滴，将样品以最高速度离心5至10秒，注意不要使细胞碎片形成沉淀。

将样品从15毫升离心管转移至2毫升离心管中，并加入1/100体积的1摩尔储备液二硫苏糖醇，使其终浓度为10毫摩尔。

短暂涡旋振荡后，将样品在95摄氏度孵育10分钟，同时以800 rpm速度振荡。随后，将样品置于冰上冷却至室温。

接着，在避光条件下，逐滴加入终体积 1/10 的 0.55 M 碘乙酰胺，使终浓度为 55 毫摩尔/升，涡旋混匀管内溶液，然后在室温下避光孵育 20 分钟。

孵育结束后，加入100%的冰冷丙酮，使终浓度为80%。将样品在-20 °C下保存过夜。如需后续使用，可保存长达两周。

第二天，在 4 摄氏度条件下以 13,500 rpm 离心样品 10 分钟，以沉淀细胞沉淀物。加入 500 微升 80% 的预冷丙酮，洗涤细胞沉淀物一次，随后在 13,500 rpm 和 4 摄氏度条件下离心 10 分钟，重复此步骤两次。

向空气干燥的细胞沉淀中加入 100 微升含有 8 M 尿素的 40 毫摩尔 HEPES 溶液，在 4 摄氏度水浴中超声处理，每次超声 30 秒，间隔 30 秒，共进行 15 个循环，以重新溶解蛋白沉淀，随后进行蛋白定量。

接下来，加入 300 微升碳酸氢铵，将样品稀释至终浓度为 2 M 尿素。为消化 50 微克蛋白质，将胰蛋白酶和赖氨酰肽内切酶（Lys-C）按酶与蛋白质质量比 1:50 加入冰上的样品中。

通过轻轻敲击混匀样品，并在室温下孵育过夜以进行消化。随后，进行肽段纯化方案。