嗜中性粒细胞的分离协议

中性粒细胞分离方案。该程序将从全血样本设备、离心机和小瓶中提取白细胞。Vortex sir 针头和注射器注射器过滤器。

Milli pour 品牌 MX gv 0.22 微米材料。Hank spell 和盐溶液中性粒细胞分离需要两种 HBSS 溶液。含氯化钙的 HBSS 将用于制备与人血清白蛋白的溶液。

不含氯化钙的 HBSS 将用于悬浮和洗涤中性粒细胞。在此过程中，请特别小心使用适当的 HBSS 溶液。人血清白蛋白或 HSA 是血浆中的一种蛋白质，可维持 pH 值和 SMO 压力。

请勿使用牛血清汞齐红细胞裂解缓冲液。这是由 Roche Diagnostics 制造的中性粒细胞分离培养基 NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly 分离培养基避光保存并保存在冰箱中以获得最佳结果。使用时，所有试剂都应在室温下。

实验前 1 小时从冰箱中取出试剂。准备用于中性粒细胞分离的 H-B-S-S-H-S-A 溶液。将含氯化钙的 HBSS 移液到小瓶中。

将 HSA 吸入注射器中。避免积聚气泡。取下注射器针头并更换为过滤器。

准备好其他材料并在室温下获得约 15 毫升全血时，通过过滤器将 HSA 注入 HBSS 样品瓶涡旋二混合物中。这将产生 10 到 15 毫升的 10 到第八个中性粒细胞。捐献者在捐献血液样本前 24 小时内不应饮酒或服用非处方药。

这些可能会破坏分离过程。按照制造商的说明，通过将 9 份血液加入 1 份 K、3 份 EDTA 柠檬酸钠或肝素中，可以用 EDTA 柠檬酸盐或肝素对全血进行抗凝。此过程将介绍以下步骤。

分离并去除血浆和单核细胞。分离并获得一个中性粒细胞层，裂解红细胞游离，悬浮中性粒细胞，首先分离。在 NIM 层获得中性粒细胞。

在离心管中收集 5 mL 分离培养基。将隔离介质放在试管中较低的位置可以使其起到过滤器的作用，因为离心机会小心地迫使血液通过它。在 NIM 上铺上 5 毫升血液，以便进行清洁分离。

要非常小心，避免混合溶液。缓慢而小心地执行此步骤，并将移液器吸头靠近分离介质表面，以防止混合离心机。溶液在 500 RCF 下反应 35 分钟。

在 20 到 25 摄氏度时，血液应分离成六个不同的条带。这六个条带是血浆单核细胞、分离培养基、中性粒细胞、更多的分离培养基和底部的红细胞沉淀。如果这 6 条带不清晰，则分离过程不干净，需要重复。

分离不良的常见原因包括：旧的隔离培养基供体在过去 72 小时内饮酒或供体服用了其他药物，如泰诺或阿司匹林。小心去除并丢弃血浆单核细胞和分离培养基。将这些层放入可密封的试管中并小心丢弃，将嗜中性粒细胞层和嗜中性粒细胞下方的所有分离培养基移液到干净的离心文件中，以回收尽可能多的嗜中性粒细胞。

通常最简单的方法是也包含下面层的一些隔离介质。请勿打扰底部的托盘。第二次声明，精制中性粒细胞层。

用不含钙的 HBSS 将嗜中性粒细胞溶液稀释至 10 毫升。将试管倒置几次以悬浮细胞离心机。中性粒细胞溶液。

350 RCF 10 分钟。在 20 至 25 摄氏度时，管底部应存在含有中性粒细胞和残留红细胞的红色颗粒。用移液管取出 supra natin。

小心。扰乱底部的颗粒。裂解红细胞。

样品中的红细胞现在必须通过裂解来破坏。要裂解残留的红细胞，请在试管中加入 2 毫升红细胞裂解缓冲液进行复苏。悬浮沉淀物，以 3 到 4 的设置涡旋样品瓶。

避免将涡流设置增加到 4 以上，因为这可能会导致嗜中性粒细胞激活。可能需要涡旋几秒钟或脉冲涡旋以溶解上颚。将裂解液以 250 RCF 离心 5 分钟。

使用软启动选项可最大程度地减少对样品的损坏。用移液管取出 supra natin。重复裂解过程。

如果需要，释放中性粒细胞悬液，向每管中加入 500 微升不含钙的 HBSS。将沉淀涡旋 3 到 4 的设置，用 HPSS 稀释至 10 毫升，不含钙离心机。中性粒细胞在 250 RCF 下停留 5 分钟，吸出 snat 并丢弃。

将沉淀重新悬浮在 250 微升 HBSS 中，用 HSA 溶液，2 次 10 到 6 次。通常收集每毫升的中性粒细胞。