Name: 嗜中性粒细胞的分离协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 了解使用密度梯度分离技术从人全血中分离嗜中性粒细胞的标准化方法。该方案为免疫学和细胞生物学研究提供了可靠的实验基础，有助于深入分析炎症反应中的免疫细胞功能。

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美国国立卫生研究院（NIH）R01 HL56621 项目资助。

&nbsp;中性粒细胞分离方案
<ol>
<li>将所有试剂恢复至室温。</li>
<li>在离心管中加入 5.0 ml 中性粒细胞分离介质。小心地将 5.0 ml 血液缓慢铺加在分离介质上方。操作时应缓慢且轻柔，移液器吸头应靠近介质表面，以避免血液与介质混合。</li>
<li>在 20–25°C 条件下，以 500 RCF 离心 35 分钟。血液应分为 6 个清晰的条带：血浆、单核细胞、分离介质、中性粒细胞、更多的分离介质以及红细胞沉淀（图 1）。如果条带不清晰，说明分离过程不彻底，需重复该步骤。</li>
<li>使用移液器小心移除最上层的三层（血浆、单核细胞和分离介质），并弃去。</li>
<li>小心吸取中性粒细胞层以及其下方全部的分离介质，将溶液转移至一支干净的离心管中。</li>
<li>用不含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS 将中性粒细胞悬液稀释至 10 ml。轻轻颠倒混匀数次，使细胞充分悬浮。</li>
<li>以 350 RCF 离心 10 分钟。管底应出现红色沉淀，其中含有中性粒细胞及残留的红细胞（RBCs）。小心用移液器吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
<li>为裂解残留的红细胞，向管中加入 2 ml 红细胞裂解缓冲液。为重悬沉淀，将管在涡旋振荡器上以 3–4 档涡旋。避免将涡旋档位调至 4 以上，以免激活中性粒细胞。可能需要涡旋数秒，或采用“脉冲”方式涡旋以充分溶解沉淀。</li>
<li>以 250 RCF 离心 5 分钟。用移液器吸除上清液。如有需要，可重复裂解步骤。</li>
<li>向每支管中加入 500 μl 不含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS。再次以 3–4 档涡旋重悬沉淀。然后用不含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS 稀释至 10 ml。</li>
<li>以 250 RCF 离心 5 分钟。吸除上清液并弃去。</li>
<li>将沉淀重悬于 250 μl HBSS/HSA 溶液（2% HSA）中。随后可对细胞进行计数，并调整至所需浓度。</li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

密度梯度分离法利用偏重酸钠和右旋糖酐500的混合物从全血中分离人中性粒细胞。该方法基于Boyum（1968年）提出的单个核白细胞分离法，并由Ferrante和Thong（1980年）针对中性粒细胞分离进行了改良。
从供体采集全血后，可用EDTA、柠檬酸盐或肝素进行抗凝处理。由于中性粒细胞寿命较短，应在采集后2-4小时内使用。该操作步骤包括将全血叠加于密度梯度介质上，离心，分离中性粒细胞层，以及裂解残留的红细胞。随后将细胞洗涤、计数，并重悬至所需浓度。
如果第一次离心后未出现清晰的六条带，则说明分离过程不彻底，需要重复操作。为获得清晰的分离效果，请确保分离介质未过期且未被污染。若献血者在采血前72小时内摄入过酒精或药物，也可能导致分离失败。
为防止中性粒细胞在分离过程中被激活，最好使用不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 HBSS，因为这些离子已被证明可使细胞致敏。沉淀物的重悬操作也应缓慢进行，涡旋振荡的设置应保持在低至中等范围，以避免细胞被激活。<p class="jov...

<table><tbody><tr><td>淋巴细胞分离液 Poly(R)</td><td>试剂</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>可使用 PolymorphprepTM 作为替代</td></tr><tr><td>不含氯化钙的 Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>试剂</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>试剂</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管及吸头</td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>试剂</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>淋巴细胞分离液 Poly(R) 的替代试剂</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>其他</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV，0.22 &amp;#x03BC;m，PVDF，33 mm，可伽马射线灭菌</td></tr><tr><td>含氯化钙的 Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

中性粒细胞分离方案

Neutrophil Isolation Protocol

中性粒细胞（多形核粒细胞，PMN）是人体内最丰富的白细胞，也是炎症免疫反应发生时最早抵达反应部位的细胞之一。由于其在炎症过程中的关键作用，中性粒细胞的多种功能，如运动性、细胞因子产生、吞噬作用以及对肿瘤细胞的杀伤能力，均被广泛研究。为了体外研究中准确表征中性粒细胞的特定功能，亟需一种纯净、快速且可靠的分离方法，以将其与其他血细胞分离开来，尤其因为中性粒细胞寿命较短，采集后应在2–4小时内使用。本文展示了一种标准的密度梯度离心法，利用市售的分离介质（由甲泛影酸钠与右旋糖酐500组成）从全血中分离人中性粒细胞。该方法包括将全血叠加于密度梯度介质上、离心、收集中性粒细胞层以及裂解残留红细胞。随后对细胞进行洗涤、计数，并重悬于缓冲液中至所需浓度。若操作正确，该方法可获得纯度超过95%、活力高于95%的中性粒细胞样本。

关键词：中性粒细胞，多形核粒细胞，PMN，密度梯度离心，细胞分离，全血，甲泛影酸钠，右旋糖酐500，细胞活力，细胞纯度

中性粒细胞是炎症免疫反应发生时最早到达反应部位的细胞之一，其功能和作用机制已在体外得到广泛研究。本文展示了一种标准的密度梯度分离方法，利用 commercially available 分离介质从全血中分离人中性粒细胞。

中性粒细胞（多形核粒细胞，PMN）是人体内数量最多的白细胞，也是炎症发生时最早到达炎症部位的细胞之一……

中性粒细胞分离方案。该操作将从全血样本中提取白细胞，所需设备包括离心机和离心管。涡旋混匀器、移液针头和注射器、注射器滤器。使用孔径为0.22微米的Millipore品牌滤器过滤材料。Hank平衡盐溶液用于中性粒细胞分离，需要两种HBSS溶液。含氯化钙的HBSS将用于配制人血清白蛋白溶液。将使用不含氯化钙的HBSS悬浮和洗涤中性粒细胞。请特别注意在本实验步骤中使用正确的HBSS溶液。人血清白蛋白（HSA）是血浆中的一种蛋白质，可维持pH和SMO渗透压。请勿使用牛血清汞齐红细胞裂解缓冲液。该产品由罗氏诊断公司生产，中性粒细胞分离介质 NIM Cedar Line Labs 淋巴细胞分离液应避光保存，并置于冰箱中以获得最佳效果。所有试剂在使用时应达到室温。 实验前一小时从冰箱中取出试剂。配制用于中性粒细胞分离的H-B-S-S-H-S-A溶液。用移液器将含氯化钙的HBSS加入小瓶中。将HSA吸入注射器中，避免产生气泡。取下注射器针头，换上滤器。当其他材料准备就绪并处于室温时，将HSA通过滤器注入HBSS小瓶中，涡旋混匀。采集约15毫升全血，可获得10至15毫升浓度为10⁸的中性粒细胞。供血者在献血样前24小时内不应摄入酒精或非处方药物。这些因素可能干扰分离过程。全血可使用EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，按九份血液加一份K₃EDTA、枸橼酸钠或肝素处理，具体操作请遵循制造商说明书。以下步骤将在本实验流程中进行描述。分离并去除血浆和单核细胞。分离并获取中性粒细胞层，首先通过裂解红细胞获得游离的中性粒细胞，进行第一次分离。在NIM层中获取中性粒细胞。在离心管中加入五毫升分离培养基。将分离培养基置于管底部可使其起到过滤作用，离心时血液将被缓慢压过该层。小心地将五毫升血液叠加在NIM上，以实现清晰分离。务必小心避免溶液混合。进行此步骤时应缓慢而仔细操作，并将移液枪头靠近分离胶溶液的液面，以防止混合。在500 RCF条件下离心35分钟。在 20 至 25 摄氏度条件下，血液应分离成六个清晰的条带。这六个条带分别为血浆单核细胞、分离介质、中性粒细胞、更多的分离介质，以及底部的红细胞沉淀。如果这六个条带不清晰或不分明，则说明分离过程不彻底，需要重新进行。导致分离效果不佳的常见原因包括：供体在过去72小时内饮用过酒精，或服用过泰诺（Tylenol）、阿司匹林等其他药物。仔细移除并丢弃血浆单核细胞层及分离介质。将这些层转移至可密封的离心管中妥善丢弃，然后小心地用移液器将中性粒细胞层以及中性粒细胞层下方的所有分离介质转移至洁净的离心管中，以尽可能回收更多的中性粒细胞。通常最好同时加入一些下层的分离介质。不要扰动底部的沉淀物。第二次声明，提纯中性粒细胞层。用不含钙的HBSS将中性粒细胞溶液稀释至10毫升。轻轻颠倒离心管数次以混匀细胞悬液，然后离心中性粒细胞溶液。350 × g 离心 10 分钟。在 20 至 25 摄氏度条件下，含有中性粒细胞和残余红细胞的离心管底部应出现红色沉淀。用移液器吸走上清液。小心操作，避免扰动底部的沉淀。裂解红细胞。现在必须通过裂解破坏样本中的红细胞。为裂解残留的红细胞，向管中加入两毫升红细胞裂解缓冲液以重悬。将沉淀物重悬后，在3至4档的设置下涡旋振荡小瓶。避免将涡旋振荡器的转速调至4级以上，因为这可能导致中性粒细胞活化。可能需要涡旋数秒或脉冲式涡旋以溶解沉淀物。将裂解液在250 RCF下离心5分钟。使用软启动选项以尽量减少对样品的损伤。用移液器移除上清液。重复裂解过程。如有需要，释放中性粒细胞悬液，向每管中加入 500 微升不含钙的 HBSS。在 3 至 4 档涡旋振荡沉淀，用不含钙的 HPSS 稀释至 10 毫升后离心。在 250 ×g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液并弃去。将沉淀重悬于250微升含HSA的HBSS溶液中，浓度通常为每毫升收集2×10⁶个中性粒细胞。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

嗜中性粒细胞的分离协议

一种用于研究中性粒细胞与生物膜相互作用的体外实验方法

本视频展示了利用含有抗中性粒细胞胞质抗体的患者血清，在预标记的中性粒细胞中诱导并可视化中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的方法。此外，通过使用不可穿透细胞膜的DNA染料结合荧光显微镜，可实现对NETs的可视化观察。...

预标记中性粒细胞中中性粒细胞胞外诱捕网的诱导与可视化

在以下实验方案中，我们描述了一种使用常规试剂从人全血中分离中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）的极为简便的方法。随后，我们展示了如何将分离得到的NETs用于一项 体外...

简化的人类中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）分离与处理

中性粒细胞不仅在宿主防御侵入性微生物方面发挥重要作用，还参与对肿瘤细胞的免疫监视。本文描述了具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离技术，以及监测抗肿瘤中性粒细胞功能的方法。 体外 和 体内.

具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征

中性粒细胞是最丰富的白细胞类型。本文介绍了通过密度梯度分离法从人血液中分离中性粒细胞，以及将人早幼粒细胞（HL60）沿粒细胞途径进行分化的方法；用于检测它们在淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性中的作用。...

中性粒细胞分离与分析以确定其在淋巴瘤细胞对治疗药物敏感性中的作用

本文介绍了一种获取并鉴定新近表征的中性粒细胞来源巨噬细胞亚群的方法。这些细胞由新鲜的人类血液中性粒细胞在体外培养中发育而成，具有吞噬作用、自噬能力、体积巨大以及寿命显著延长等特征。该方法对于进一步研究这一独特的中性粒细胞来源亚群至关重要。...

一种新型人中性粒细胞来源的巨大吞噬细胞亚群的建立与鉴定 体外

本文介绍了一种生成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的实验方案，以及NETQUANT的操作方法；NETQUANT是一种用于定量免疫荧光图像中NETs的全自动软件工具。...

基于图像的中性粒细胞胞外诱捕网自动化定量分析：采用 NETQUANT 方法

本方案详细描述了一种从全血、血沉棕黄层或白细胞单采膜中分离中性粒细胞的方法，可获得较高的细胞得率、高纯度以及最低程度的细胞活化。我们采用梯度纯化、红细胞（RBC）沉降和红细胞裂解法，以获取高质量/高纯度的中性粒细胞制备物。...

从全血和血沉棕黄层中分离人中性粒细胞

本明确的实验方案描述了一种实时高通量显微镜技术，用于在体外可视化并定量人中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的释放。in vitro...

实时、高通量显微定量人中性粒细胞胞外诱捕网释放及拮抗剂药理学评估

本文提供了一种利用磁性分离法（阴性筛选）结合不连续密度梯度介质从全血中分离低密度和正常密度中性粒细胞的可靠方法。该方法可实现未受干扰的高纯度细胞分离（≥93%），有助于对中性粒细胞亚群进行准确的下游分析，对于理解其在健康与疾病中的作用至关重要。...

从全血中分离与鉴定低密度和正常密度中性粒细胞

低密度中性粒细胞（LDN）在多种疾病中显著增加。通常通过细胞分选来分离LDN。本文介绍一种获取高纯度且具有活性的LDN的实用方法。外周血经密度梯度离心后，细胞与磁性微珠孵育，随后通过磁性柱分离LDN。...

快速磁珠法高效纯化低密度中性粒细胞

了解使用密度梯度分离技术从人全血中分离嗜中性粒细胞的标准化方法。该方案为免疫学和细胞生物学研究提供了可靠的实验基础，有助于深入分析炎症反应中的免疫细胞功能。

中性粒细胞分离方案

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