Name: 基于乙二醇玻璃化冷冻小鼠胚胎的超低温保存 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学习基于乙二醇玻璃化冷冻技术保存小鼠胚胎的方法，该方法毒性低且适用于多种品系。解冻后胚胎存活率超过90%，出生率达30%至70%，为生殖生物学研究提供可靠方案。

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本研究与日本文部科学省国家生物资源项目合作开展。

实验的整体方案如图1所示。
1. 试剂制备
<ol>
 <li>根据下表，在100 ml玻璃瓶中配制基础培养基（以下简称PB1）：
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
<td> </td>
 <td>分子量</td>
 <td>毫摩尔浓度（mM）</td>
 <td>每100 ml含毫克数（mg/100ml）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>58.4</td>
 <td>136.98</td>
 <td>800.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>74.6</td>
 <td>2.68</td>
 <td>20.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>136.1</td>
 <td>1.47</td>
 <td>20.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO4·12H2O</td>
 <td>358.14</td>
 <td>8.04</td>
 <td>288.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2·6H2O</td>
 <td>203.3</td>
 <td>0.49</td>
 <td>10.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>葡萄糖</td>
 <td>180.2</td>
 <td>5.56</td>
 <td>100.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>丙酮酸钠</td>
 <td>110</td>
 <td>0.33</td>
 <td>3.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2·2H2O</td>
 <td>147</td>
 <td>0.9</td>
 <td>13.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>青霉素G</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>6.0（约）</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>配制Ficoll-蔗糖（FS）溶液：
 <ol>
 <li>在50 ml离心管中，向14 ml PB1溶液中加入以下化学试剂：
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Ficoll 70</td>
 <td>6.0 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>蔗糖</td>
 <td>3.424 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>42.0 mg</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>将Ficoll 70和蔗糖加入PB1溶液中，充分振荡直至完全溶解。</li>
 <li>确认上述物质完全溶解后，将BSA加至溶液表面，并于4°C静置，直至BSA完全溶解（>4小时或过夜）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>在50 ml离心管中配制平衡溶液（EFS20）和玻璃化冷冻溶液（EFS40）：
 <ul>
 <li>EFS20：含20%（v/v）乙二醇、24%（w/v）Ficoll和0.4 mol/L蔗糖的PB1溶液（含BSA）</li>
 <li>EFS40：含40%（v/v）乙二醇、18%（w/v）Ficoll和0.3 mol/L*蔗糖的PB1溶液（含BSA） 
 *对于来自BALB/c或ICR品系的胚胎，因其对冷冻损伤更为敏感，需将蔗糖浓度提高至0.9 mol/L6。</li>
 </ul>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
<td> </td> 
<td>EFS20溶液</td>
 <td>EFS40溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>乙二醇</td>
 <td>1 ml</td>
 <td>2 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FS溶液</td>
 <td>4 ml</td>
 <td>3 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>使用0.45 μm滤膜过滤除菌。分装至5 ml聚苯乙烯管中，4°C保存。可使用约6个月。</li>
 <li>配制含0.75 M蔗糖的胚胎解冻溶液（TS1）：
 <ol>
 <li>将7.7 g蔗糖溶解于步骤1.1中配制的PB1溶液中，并定容至30 ml。轻轻振荡混匀，直至蔗糖完全溶解。</li>
 <li>将90 mg BSA加至溶液表面，静置至完全溶解。</li>
 <li>通过过滤除菌。</li>
 <li>分装并储存于4°C。可使用约1个月。</li>
 </ol>
 
 注：TS1也可使用市售M2培养基配制。 
 <ol start="6">
 <li>将7.7 g蔗糖溶解于M2培养基中，并定容至30 ml。</li>
 <li>轻轻振荡混匀，直至蔗糖完全溶解。</li>
 <li>通过过滤除菌。</li>
 <li>分装并储存于4°C。可使用约1个月。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>TS2（含0.25 M蔗糖的解冻溶液）：
 <ol>
 <li>根据需要，用PB1或M2将10 ml TS1稀释至总体积30 ml。</li>
 <li>分装并储存于4°C。可使用约1个月。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. 小鼠2细胞胚胎的玻璃化冷冻
<ol>
 <li>通过自然交配或常规方法制备小鼠2细胞期胚胎 体外 授精技术</li>
 <li>等分试样 50 μl 将EFS40转入冻存管中。此后，其余玻璃化冷冻步骤均在室温下进行。</li>
 <li>等分试样 50 μl 在35 mm或60 mm塑料培养皿底部加入EFS20。</li>
 <li>使用玻璃毛细管将最多30个胚胎转移至EFS20中，仅携带最小量的培养液。启动计时器，持续2分钟。 
 注意：将胚胎放置在液滴底部，以实现胚胎的高效脱水。使用体视显微镜检查胚胎形态。脱水后的胚胎呈现皱缩形态，如图所示。 图 2A如果脱水不充分，需再等待1至2分钟。</li>
 <li>约1.5分钟时，用最小量溶液从EFS20液滴中拾取胚胎，转移至步骤2.1中准备好的冻存管内的EFS40溶液中。注意：为获得最佳效果，应调整拾取胚胎的时间，使所有胚胎均能在约2分钟时转移至EFS40溶液中。</li>
 <li>等待 1 分钟。</li>
 <li>将冻存管直接放入液氮（LN₂）中2).</li>
</ol>
3. 解冻玻璃化保存的2细胞期小鼠胚胎
<ol>
 <li>解冻前，准备一个培养皿，内含 10 μl 用于回收胚胎的胚胎培养液滴（参见步骤 3.13）。用油覆盖培养皿后置于 CO₂ 培养箱中2 孵育器中保存至使用。注意：尽管本实验可使用任何常规胚胎培养培养基，但我们推荐使用渗透压较高的培养基，例如 M16 培养基。</li>
 <li>将TS1预热至 37°C.</li>
 <li>戴上口罩和低温手套。打开液氮罐2 将冻存管从液氮罐中取出，管内含有胚胎。</li>
 <li>迅速打开管盖，弃去液氮2等待30秒，以防止TS1在下一步骤中冻结。</li>
 <li>使用1000 μl移液器加入 850 μl TS1 的37°C将溶液加入管中，轻轻吹打约10次（25秒内），混匀，直至溶液完全均匀溶解。</li>
 <li>将试管中的全部液体转移至一个塑料60 mm培养皿（或表面皿）中（图 3A）。注意：胚胎应在室温（22-25°C）直至将其放入 CO2 步骤 3.14 中的培养箱</li>
 <li>启动计时器，计时3分钟。</li>
 <li>在TS1阶段约2分钟时，轻轻摇晃培养皿，直至含有胚胎的培养基均匀铺展在培养皿表面（图 3B注意：这有助于胚胎沉降到管底，因为胚胎在转移到TS1时会漂浮在液面附近。</li>
 <li>放三个 50 μl 将TS2滴加到培养皿中（图 3C).</li>
 <li>在TS1中孵育3分钟后，使用体视显微镜检查胚胎形态；此时胚胎应略微收缩。参见早期胚胎的形态（图 2B）以及之后（图 2C) 在TS1中。注意：如果胚胎仍然肿胀，需在TS1中继续放置1至3分钟。</li>
 <li>挑取胚胎并将其转移至第一滴 TS2 中（图 3D）。启动计时器，计时3 min</li>
 <li>3分钟后，将胚胎转移至第二滴液滴，随后转移至第三滴液滴（图 3E).</li>
 <li>将胚胎转移至第3.1步准备的培养基中。胚胎的形态如图所示 图 2D.</li>
 <li>将培养皿放入 CO₂ 培养箱中2 培养箱中。约10分钟后，将胚胎转移至下一滴培养液中，以洗去从TS2带出的蔗糖。</li>
 <li>在CO2培养箱中继续培养，直至胚胎移植。 
 注意：在解冻当天将胚胎移植至受体雌性动物的输卵管中。长时间培养 体外 可能会降低某些小鼠品系胚胎的存活率。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
体外- 和 体内解冻后胚胎发育情况见表1和表2。该方案的优点在于胚胎解冻后存活率高，且适用于多种小鼠品系。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>品系</td>
 <td>总管数</td>
 <td>玻璃化冷冻胚胎数</td>
 <td>复苏数（数量（%））</td>
 <td>形态正常数（数量（%））</td>
 <td>发育至囊胚数（数量（%））</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6J</td>
 <td>20</td>
 <td>400</td>
 <td>397 (99)</td>
 <td>394 (99)</td>
 <td>342 (87)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BALB/cA</td>
 <td>15</td>
 <td>300</td>
 <td>296 (99)</td>
 <td>282 (95)</td>
 <td>238 (84)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ICR</td>
 <td>24</td>
 <td>480</td>
 <td>474 (99)</td>
 <td>443 (93)</td>
 <td>398 (90)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 体外常用小鼠品系玻璃化冻融胚胎的发育
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>胚胎状态</td>
 <td>受体雌性数量</td>
 <td>移植胚胎数</td>
 <td>着床位点（数量（%））</td>
 <td>存活后代（数量（%））</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>新鲜</td>
 <td>12</td>
 <td>180</td>
 <td>141 (78.3)</td>
 <td>110 (61.1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>玻璃化冷冻</td>
 <td>16</td>
 <td>242</td>
 <td>202 (83.5)</td>
 <td>125 (51.7)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. C57BL/6J小鼠玻璃化冻融胚胎的体内发育情况。
<img alt="玻璃化冷冻过程示意图：胚胎玻璃化、液氮储存、解冻复苏步骤。" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 实验的整体流程，包括胚胎的平衡、玻璃化冷冻和解冻过程。
<img alt="双细胞胚胎解冻过程示意图，从玻璃化冷冻至M16培养基，TS1蔗糖溶液。" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 胚胎在解冻各步骤中的形态。
<img alt="显示液体转移过程和反应序列的培养皿静态平衡示意图。" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 胚胎解冻操作流程。所有步骤均在室温下进行。（A）将850 μl TS1溶液（37°C）加入冻存管中，并将冻存管内的全部液体转移至塑料培养皿中。此时胚胎呈现肿胀状态，如图2B所示。（B）轻轻振荡培养皿，使液体均匀铺展于皿表面。（C）在塑料培养皿中放置三滴TS2溶液，每滴50 μl。（D）将胚胎转移至第一滴TS2溶液中。3分钟后，胚胎呈现皱缩状态，如图2C所示。（E）依次将胚胎转移至其余TS2液滴中，最后转移至培养液中。

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

自1985年Rall和Fahy首次报道小鼠胚胎玻璃化冷冻技术以来2，已有多种技术改进被提出，以提高胚胎解冻后的存活率。其中最成功的改进之一是使用乙二醇作为冷冻保护剂，因其具有较低的毒性和较高的细胞膜通透性。这些优势使我们能够在室温下操作胚胎的冷冻过程4；而其他玻璃化冷冻方法则需在较低温度下操作，且并不总是适用于包括BALB/c在内的某些小鼠品系6。基于乙二醇的首项玻璃化冷冻技术由Kasai等人于1990年建立5,7。由于原始方法是针对塑料吸管作为容器进行优化的，我们对该方案进行了轻微修改，改用实验室更易获得且更耐物理损伤的冻存管。因此，本文所述的玻璃化冷冻方法可能适用于众多以小鼠为研究模型的实验室。该方法同样可用于桑葚胚和囊胚阶段的小鼠胚胎8以及大鼠胚胎9。然而，我们最近发现冻存管的质量可能影响胚胎冻融后的存活率。因此，在进行胚胎玻璃化冷冻前，必须检查冻存管内表面的光滑程度（例如：参见试剂与设备表）。
玻璃化冷冻方法相较于传统的慢速冷冻方法具有诸多优势，但在运输方面存在固有的缺点。由于玻璃化冷冻的胚胎必须保存在-120°C以下才能维持其活性，因此通常使用干式液氮运输罐（dry shippers）进行安全运输。然而，干式液氮运输罐重量大、体积大，往返运输成本高昂，尤其是在国际运输中更为显著。目前我们正在开发一种新型玻璃化冷冻方法，可使玻璃化冷冻的胚胎在干冰温度（约-80°C）下至少保存7天10。该方法有望成为下一代玻璃化冷冻技术。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>12657</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>058-00986</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 70</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0310-10</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>041-00595</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>500-04195</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;#183;2H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>031-00435</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4687</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8574</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>M16 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>M2 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>住友电木株式会社</td><td>MS-4501</td><td>&amp;#8220;冷冻小瓶&amp;#8221;</td></tr></tbody></table>

基于乙二醇的玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

小鼠胚胎的冷冻保存是一项支持生物医学科学研究的技术基础，因为通过基因改造已培育出大量品系的小鼠，且每年数量持续增加。该技术的发展始于20世纪70年代的慢速冷冻方法1，随后在80年代末发展出玻璃化冷冻方法2。通常情况下，后一种技术具有操作快速、简便以及解冻后胚胎存活率高的优势。然而，所使用的冷冻保护剂具有高度毒性，可能影响后续胚胎发育。因此，即使在胚胎操作过程中将溶液冷却至4°C以减轻毒性作用，该技术仍不适用于某些小鼠品系。在理化学研究所生物资源中心，保存着超过5000种具有不同遗传背景和表型的小鼠品系3，为此我们优化了一种玻璃化冷冻技术，能够对多种不同品系的小鼠胚胎进行冷冻保存，并在室温下解冻（或更准确地说，融化）后实现较高的胚胎存活率4。
本文介绍了一种在本中心已成功应用的小鼠胚胎玻璃化冷冻方法。该冷冻保存溶液采用乙二醇代替二甲基亚砜（DMSO），以降低对胚胎的毒性5。同时含有Ficoll和蔗糖，分别用于防止复玻璃化和调节渗透压。胚胎可在室温下操作，并可在5分钟内转移至液氮中。由于原始方法针对塑料细管作为容器进行了优化，我们对该方案进行了轻微修改，以适用于实验室更易获得且更耐物理损伤的冻存管。我们还详细描述了玻璃化冷冻胚胎的复苏操作步骤，因为这是高效获得活体小鼠的关键环节。这些技术方法将有助于需要以安全、经济的方式保存小鼠品系以供后续使用的科研人员和技术人员。

本文介绍了一种基于乙二醇的小鼠胚胎玻璃化冷冻方法。该方法具有操作简便、胚胎毒性低的优点，因此可广泛适用于多种小鼠品系，包括近交系和基因修饰小鼠。

小鼠胚胎冷冻保存是支持生物医学科学的一项技术基础，因为许多小鼠品系是通过遗传修饰技术产生的……

本实验的总体目标是将小鼠胚胎在液氮中进行冷冻保存，并通过解冻复苏获得活体小鼠。该过程首先将小鼠胚胎浸入平衡液中，随后转移至冷冻管内的玻璃化冷冻液中，再放入液氮罐中保存。之后可将胚胎在高渗透压溶液中解冻，并在培养液中孵育，直至移植到受体雌鼠体内。最终结果显示，胚胎在玻璃化冷冻解冻后的存活率超过90%，胚胎移植后的妊娠率在30%至70%之间。该技术的主要优势在于，所使用的可渗透性冷冻保护剂——乙二醇，对胚胎的毒性低于传统冷冻保护剂。在开始本方案之前，将由我实验室的一名技术人员演示该操作流程。将通过自然交配或常规体外受精技术获得的两个细胞小鼠胚胎置于培养液中，并转移至冻存管中以备最终保存，加入50微升胚胎冷冻液EF S 40。然后准备一个35毫米或60毫米的塑料培养皿，内含50微升室温的EFS 20。使用玻璃毛细管将最多30个胚胎转移至培养皿中。注意避免将培养基一并转移。为确保胚胎脱水，将其置于液滴底部。约 60 至 90 秒后，使用毛细管吸取脱水的胚胎。这些胚胎呈皱缩形态。将这些胚胎转移至冻存管中的 EFS 溶液中，尽可能少地带入 EFS 20。胚胎转移后，先在EFS 40中静置1分钟，然后再放入液氮中冷冻。解冻胚胎前，先在培养皿中加入至少两滴10 µL高渗胚胎培养液（如M 16培养基），然后用硅油或矿物油完全覆盖液滴，并将培养皿置于二氧化碳培养箱中备用。接下来，在佩戴口罩和冷冻手套的情况下，将 TS 一溶液预热至 37 摄氏度。从液氮罐中取出胚胎。迅速打开冻存管，将残留的液氮倒回液氮罐或其他合适的容器中。然后等待30秒。现在向冻存管中加入850 µL温热的TS one溶液。轻柔地吹打溶液约10次，使其均匀溶解。然后将全部体积转移至一个塑料的60毫米培养皿中。或者将胚胎置于表面皿上，静置3分钟，使胚胎适应室温，并在后续操作步骤中保持在室温下。切勿使用加热装置。在开始孵育时，立即在体视显微镜下快速观察培养皿中的胚胎，以了解其初始状态。孵育约两分钟后，轻轻摇晃培养皿，使胚胎沉降，直至培养液均匀覆盖皿底表面。在孵育的最后1分钟内，分别在培养皿中滴加三滴50微升的TS two溶液。三分钟结束后，使用体视显微镜确认胚胎是否已略微收缩。如果胚胎仍然肿胀，继续孵育额外一到三分钟。现在，用玻璃毛细管吸取胚胎，并将其转移至第二滴TS溶液的第一滴中。等待三分钟后，将胚胎转移至第二滴液滴中，随后转移至第三滴液滴。最后，取出孵育箱中预先准备好的胚胎培养基培养皿，使用玻璃毛细管将胚胎转移至培养基的第一滴液滴中。若在体视显微镜下观察，胚胎应逐渐恢复其正常形态。随后，将培养皿放回培养箱中孵育约10分钟，以洗去从TS2步骤中带入的蔗糖。将胚胎转移至下一滴培养液中。继续在CO2培养箱中培养胚胎，直至移植到受体雌性动物的子宫颈（uc）内。在对三个不同小鼠品系的300至480枚胚胎进行玻璃化冷冻及复苏后，胚胎存活率非常高。解冻后，胚胎中形态正常的比率为 93% 至 99%，其中至少 84% 能发育为囊胚。请务必注意，液氮泄漏可能带来极高危险，应采取预防措施以避免直接接触，并尽量减少短距离暴露于泄漏氮气中。进行此操作时应始终小心取用液氮。

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于乙二醇玻璃化冷冻小鼠胚胎的超低温保存

在本视频文章中，我们逐步演示如何采集并冷冻保存仓鼠卵母细胞，以获得较高的解冻后存活率。该方法同样可成功用于冷冻和解冻不同着床前发育阶段的小鼠胚胎。...

仓鼠卵母细胞与小鼠胚胎的采集及冷冻保存

将植入前胚胎置于高渗冷冻保护剂溶液中，使其细胞脱水后，可进行冷冻保存。在平衡后，诱导胚胎周围溶液中形成冰晶。随着胚胎被缓慢冷却至零下温度，进一步脱水发生，随后将其浸入液氮中储存。...

牛、绵羊和山羊胚胎移植前胚胎的冷冻保存

本文展示了新开发的 I•Cryo 小鼠精子冷冻保存试剂盒。使用该试剂盒，在5种小鼠品系中，冻融精子获得的二细胞期胚胎发育率 consistently 得到提高。在1.5年期间，利用 I•Cryo...

小鼠精子冷冻保存与复苏——使用 I·Cryo 试剂盒

在本视频中，我们介绍了利用乙二醇和二甲基亚砜作为冷冻保护剂，以冷冻 straw...

使用冷冻麦管进行兔胚胎玻璃化冷冻：一种用于兔胚胎长期保存的超快速冷却技术

本视频演示了玻璃化冷冻兔胚胎的解冻程序，以及为实现最佳胚胎复苏效果所采取的预防性操作步骤。...

兔胚胎解冻：一种用于复苏冷冻保存兔胚胎以进行胚胎移植的升温操作程序

子宫-输卵管胚胎移植利用子宫-输卵管连接处作为屏障，防止胚胎在进行子宫移植时发生外流。获取用于胚胎移植的假孕受体需要使用输精管结扎的雄性动物。本文讨论了这两种技术。...

小鼠模型中的子宫-输卵管胚胎移植与输精管结扎术

MicroSecure玻璃化冷冻技术是一种非商业化、无菌封闭式玻璃化冷冻装置系统，符合美国食品药品监督管理局（FDA）的优良生产规范和组织处理规范。由于行业内已停用疏水性带塞胚胎...

改良型MicroSecure玻璃化冷冻：一种安全、简便且高效的人类囊胚冷冻保存方法

辅助生殖技术（ARTs）正处于持续评估中，以提高治疗效果并降低相关风险。本文描述了一种微创胚胎移植方法，并结合高效的冷冻保存方案，使得兔子可作为人类生殖研究的理想动物模型。...

兔模型中最佳胚胎阶段的微创胚胎移植与胚胎玻璃化冷冻

本文介绍了一种时间延时形态测量方案，用于追踪囊胚在玻璃化冷冻前干预过程中的收缩强度以及复温后重新扩张的过程。该方案可应用于 体外...

囊胚玻璃化冷冻与复温过程中行为客观评估的形态计量学方案

本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。...

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

本文介绍了用于玻璃化冷冻小鼠和绵羊植入前胚胎的蒙得维的亚刮铲法，该方法采用自制的刮铲和自制的溶液。胚胎在两种浓度递增的冷冻保护剂溶液中快速平衡后，被加载到刮铲上，浸入液氮中，最后用0.5...

用于哺乳动物胚胎玻璃化冷冻的蒙得维的亚刮铲装置

学习基于乙二醇玻璃化冷冻技术保存小鼠胚胎的方法，该方法毒性低且适用于多种品系。解冻后胚胎存活率超过90%，出生率达30%至70%，为生殖生物学研究提供可靠方案。

基于乙二醇的玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

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