基于乙二醇玻璃化冷冻小鼠胚胎的超低温保存

该程序的总体目标是在液氮中冷冻保存小鼠胚胎并解冻它们以回收活小鼠。这是通过首先将小鼠胚胎浸入平衡培养基中，将它们转移到冷冻管中的玻璃化培养基中，然后将它们放入液氮罐中来实现的。稍后的胚胎可以在高渗透培养基中解冻并在培养基中孵育，直到它们被转移到受体雌性体内。

最终，结果显示玻璃体化解冻后超过 90% 的胚胎存活，胚胎移植后出生率在 30% 到 70% 之间。该技术的主要优点是可渗透性冷冻保护剂乙二醇对胚胎的毒性低于传统冷冻保护剂。在开始此协议之前，我实验室的技术人员将演示该程序。

将通过自然交配或常规 IVF 技术获得的培养物中的两个细胞小鼠胚胎准备到冷冻管中以最终储存，加入 50 微升胚胎冷冻溶液 EF S 40。然后准备一个室温为 50 微升的 35 毫米或 60 毫米塑料培养皿。EFS 20 的。

使用玻璃毛细管将多达 30 个胚胎转移到培养皿中。小心避免转移培养基。此外，为了确保胚胎脱水，将它们放在液滴的底部。

大约 60 到 90 秒后，使用毛细管抽取脱水的胚胎。形态缩小。将这些胚胎移入冷冻管中的 EFS 溶液中，尽可能少地转移 EFS 20。

胚胎转移后，让它们在 EFS 40 中沉淀 1 分钟，然后用液氮冷冻。在解冻胚胎之前，将胚胎放入培养皿中，至少滴入两滴 10 μL 高渗透压胚胎培养基，例如 M 16 培养基。然后用硅或矿物油完全覆盖滴剂，并将培养皿放入二氧化碳培养箱中直至使用。

接下来，戴上口罩和冷冻手套，将 TS one 溶液加热至 37 摄氏度。从液氮罐中取出胚胎。现在快速打开冷冻管，将任何液氮丢弃到水箱或任何合适的容器中。

然后等待 30 秒。现在向冻存管中加入 850 μL 温热的 TS one 溶液。轻轻吸起并压迫溶液约 10 次，使其均匀溶解。

然后将整个体积转移到 60 毫米塑料培养皿中。或者观察眼镜等待三分钟，让胚胎平衡到室温，它们应该在手术的剩余时间内保持在那里。不要使用加热装置。

在立体显微镜下快速检查培养皿中的胚胎，以了解它们在孵化开始时的样子。孵育约两分钟后，轻轻摇动培养皿，直到培养基散布在培养皿表面，使胚胎沉入水中。在孵育的最后一分钟，在培养皿中喷射三滴单独的 50 μL TS Two 溶液。

三分钟结束后，使用体视显微镜确认胚胎已略微缩小。如果胚胎仍然肿胀，请继续孵育一到三分钟。现在，用玻璃毛细管吸取胚胎并将它们转移到 TS 2 的第一滴中。

等待 3 分钟，然后将胚胎转移到第二滴。紧随其后的是第三滴。最后，取回储存在培养箱中的准备好的胚胎培养基培养皿，并使用玻璃毛细管将胚胎转移到培养基的第一滴中。

如果在立体镜下检查，胚胎应该会慢慢恢复其正常形态。现在，将培养皿放回培养箱中约 10 分钟。然后洗掉从 TS 2 中带过来的蔗糖。

将胚胎移至下一滴培养基中。继续在 CO2 培养箱中培养胚胎，直到它们转移到受体雌性的 uc 中。玻璃化并回收 300 至 480 个三种不同小鼠品系的胚胎后，存活率非常高。

解冻后，显示正常形态的胚胎比例在 93% 到 99% 之间，其中至少 84% 发育成原始囊肿。不要忘记，使用泄漏的氮气可能非常危险，并采取预防措施避免直接接触并尽量减少短距离泄漏。应始终通过执行此程序来获取氮气。