基于乙二醇玻璃化冷冻小鼠胚胎的超低温保存

本实验的总体目标是将小鼠胚胎在液氮中进行冷冻保存，并通过解冻复苏获得活体小鼠。该过程首先将小鼠胚胎浸入平衡液中，随后转移至冷冻管内的玻璃化冷冻液中，再放入液氮罐中保存。之后可将胚胎在高渗透压溶液中解冻，并在培养液中孵育，直至移植到受体雌鼠体内。

最终结果显示，胚胎在玻璃化冷冻解冻后的存活率超过90%，胚胎移植后的妊娠率在30%至70%之间。该技术的主要优势在于，所使用的可渗透性冷冻保护剂——乙二醇，对胚胎的毒性低于传统冷冻保护剂。在开始本方案之前，将由我实验室的一名技术人员演示该操作流程。

将通过自然交配或常规体外受精技术获得的两个细胞小鼠胚胎置于培养液中，并转移至冻存管中以备最终保存，加入50微升胚胎冷冻液EF S 40。然后准备一个35毫米或60毫米的塑料培养皿，内含50微升室温的EFS 20。

使用玻璃毛细管将最多30个胚胎转移至培养皿中。注意避免将培养基一并转移。为确保胚胎脱水，将其置于液滴底部。

约 60 至 90 秒后，使用毛细管吸取脱水的胚胎。这些胚胎呈皱缩形态。将这些胚胎转移至冻存管中的 EFS 溶液中，尽可能少地带入 EFS 20。

胚胎转移后，先在EFS 40中静置1分钟，然后再放入液氮中冷冻。解冻胚胎前，先在培养皿中加入至少两滴10 µL高渗胚胎培养液（如M 16培养基），然后用硅油或矿物油完全覆盖液滴，并将培养皿置于二氧化碳培养箱中备用。

接下来，在佩戴口罩和冷冻手套的情况下，将 TS 一溶液预热至 37 摄氏度。从液氮罐中取出胚胎。迅速打开冻存管，将残留的液氮倒回液氮罐或其他合适的容器中。

然后等待30秒。现在向冻存管中加入850 µL温热的TS one溶液。轻柔地吹打溶液约10次，使其均匀溶解。

然后将全部体积转移至一个塑料的60毫米培养皿中。或者将胚胎置于表面皿上，静置3分钟，使胚胎适应室温，并在后续操作步骤中保持在室温下。切勿使用加热装置。

在开始孵育时，立即在体视显微镜下快速观察培养皿中的胚胎，以了解其初始状态。孵育约两分钟后，轻轻摇晃培养皿，使胚胎沉降，直至培养液均匀覆盖皿底表面。在孵育的最后1分钟内，分别在培养皿中滴加三滴50微升的TS two溶液。

三分钟结束后，使用体视显微镜确认胚胎是否已略微收缩。如果胚胎仍然肿胀，继续孵育额外一到三分钟。现在，用玻璃毛细管吸取胚胎，并将其转移至第二滴TS溶液的第一滴中。

等待三分钟后，将胚胎转移至第二滴液滴中，随后转移至第三滴液滴。最后，取出孵育箱中预先准备好的胚胎培养基培养皿，使用玻璃毛细管将胚胎转移至培养基的第一滴液滴中。

若在体视显微镜下观察，胚胎应逐渐恢复其正常形态。随后，将培养皿放回培养箱中孵育约10分钟，以洗去从TS2步骤中带入的蔗糖。

将胚胎转移至下一滴培养液中。继续在CO2培养箱中培养胚胎，直至移植到受体雌性动物的子宫颈（uc）内。在对三个不同小鼠品系的300至480枚胚胎进行玻璃化冷冻及复苏后，胚胎存活率非常高。

解冻后，胚胎中形态正常的比率为 93% 至 99%，其中至少 84% 能发育为囊胚。请务必注意，液氮泄漏可能带来极高危险，应采取预防措施以避免直接接触，并尽量减少短距离暴露于泄漏氮气中。进行此操作时应始终小心取用液氮。