Name: 用于玻璃化和变暖步骤中囊胚行为客观评估的形态学协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 了解用于评估囊胚玻璃化和复温过程中形态学变化的形态测量学方案。该方案利用延时显微镜技术监测囊胚收缩与再扩张，为体外受精实验室优化玻璃化方法提供可靠依据。

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本工作由斯洛文尼亚科学研究基金会资助，属于研究项目P3-0327和研究计划J3-7177的一部分。

本研究中所述所有方法均已于2016年4月19日获得国家医学伦理委员会批准（编号：0120–204/2016–2）。
1. 显微镜记录系统的设置
<ol>
	<li>关闭显微镜的加热板。</li>
	<li>在进行任何处理之前，使用配备相机的倒置显微镜拍摄一个囊胚的图像。请务必记录下拍摄囊胚时所使用的放大倍数。</li>
</ol>
2. 囊胚的筛选与玻璃化冷冻前准备
<ol>
	<li>选择第5天或第6天完全扩张的囊胚进行冷冻保存，囊胚应至少含有少量内细胞团（ICM）细胞，并具有连贯的滋养层。</li>
	<li>对于经激光处理、囊胚腔已塌陷的囊胚，对囊胚施加短暂的激光脉冲（0.4 - 0.7 ms），在透明带处形成直径为4.3至9.4 µm的孔，激光方向应与透明带相切，并对准两个相邻滋养层细胞的交界处。让囊胚完全或部分塌陷，持续5分钟。</li>
	<li>对于囊胚腔完整的未经处理囊胚，在玻璃化冷冻前不进行特殊处理。 
	注：此类囊胚被视为完整囊胚。</li>
</ol>
3. 平衡阶段冷冻保护剂和培养皿的准备
<ol>
	<li>使用用于卵母细胞去核的移液管（直径135 µm），将平衡液（含7.5% DMSO、7.5%乙二醇和20% DSS的M-199 HEPES缓冲液）无菌加入专为延时显微镜观察和记录设计的9孔培养皿的微滴区域孔中。 
	注意：卵母细胞去核是指去除包围卵母细胞的卵丘细胞的过程。使用用于卵母细胞去核的移液管有助于避免产生气泡。</li>
	<li>在微滴区域上覆盖30 µL平衡液。</li>
</ol>
4. 平衡溶液中囊胚的转移
<ol>
	<li>将经激光处理或完整的囊胚浸入微滴培养皿微滴区域底部的平衡液中，在室温下放置10分钟（平衡阶段）。</li>
	<li>一旦将囊胚转移至平衡液中，立即开始10分钟倒计时。</li>
</ol>
5. 囊胚平衡阶段的记录
<ol>
	<li>将含有囊胚的微滴培养皿转移至配备摄像头的显微镜下。使用与之前相同的放大倍数，对同一囊胚拍摄快照。调整微滴培养皿的位置，使囊胚大致位于录像视野的中央。</li>
	<li>启动显微镜的录像软件开始记录，并记录下开始录像时的倒计时时间。 
	注意：参见囊胚在10分钟平衡溶液暴露期间的代表性录像结果，分别为完整囊胚（图1，视频1）和塌陷囊胚（图2，视频2）。</li>
</ol>
6. 囊胚玻璃化冷冻
<ol>
	<li>在倒计时结束前2分钟，于培养皿中无菌滴加50 µL玻璃化冷冻液（含15% DMSO、15%乙二醇、20% DSS和0.5 M蔗糖的M-199 HEPES缓冲液）。</li>
	<li>当10分钟倒计时结束时停止记录，并迅速将囊胚转移至玻璃化冷冻液中，在室温下处理30秒。</li>
	<li>在玻璃化冷冻液中轻轻吹打囊胚，至少1次。</li>
	<li>使用玻璃化冷冻吸管装载囊胚。自初次接触玻璃化冷冻液起80秒内完成吸管的装载、封口并浸入液氮（LN）中，最长不得超过110秒。</li>
</ol>
7. 囊胚在平衡阶段录像的视频编辑
<ol>
	<li>将录制的视频文件导入视频编辑软件。</li>
	<li>将时间轴滑块移动至 20 s，记录此时的帧编号。 
	注意：该编号将用于删除不必要的视频帧，仅保留每隔 20 s 的帧。</li>
	<li>点击 Video 选项卡，然后选择 Frame rate...。在 Frame rate conversion 下，勾选 Decimate by 选项，并输入之前记录的帧编号。点击 OK 确认。然后点击 File → Export → Image sequence。</li>
	<li>选择 JPEG 作为输出格式，设置保存图像序列的目录，然后点击 OK。 
	注意：这将创建一个目录，其中包含最多 30 张按顺序排列的胚胎囊胚在玻璃化冷冻平衡阶段的图像。</li>
</ol>
8. 囊胚在平衡阶段所获图像中的横截面积测量
<ol>
	<li>打开视频分析软件。点击 窗口 选项卡，然后选择 时间轴。</li>
	<li>在时间轴面板中，点击胶片图标并选择 添加媒体...，以添加囊胚在玻璃化冷冻平衡阶段之前（以及若有激光操作，则在激光干预之前）的图像。 
	注意：该图像将显示囊胚最扩张状态，其横截面积将作为参考值。</li>
	<li>添加此前使用视频编辑软件生成的对应囊胚图像序列（即玻璃化冷冻的平衡阶段图像）。</li>
	<li>进入 图像 → 分析 → 选择数据点 → 自定义，以打开 选择数据点 窗口。</li>
	<li>取消选中所有数据点，仅保留 面积 被选中，然后点击 确定 进行确认。</li>
	<li>在时间轴窗口中移动时间轴滑块至第一张图像。</li>
	<li>点击 窗口 选项卡并选择 工具。 
	注意：这将在左侧激活工具面板。</li>
	<li>选择 快速选择工具。</li>
	<li>将工具标记置于囊胚内部并接触囊胚边缘。通过将工具标记放置在囊胚外缘，按下并按住鼠标左键，沿囊胚外缘拖动工具标记，直至整个囊胚的横截面积被选中。 
	注意：透明带不属于测量范围，必须排除（图5）。</li>
	<li>在时间轴窗口中，点击 测量日志，然后按下 记录测量值 按钮。 
	注意：这将记录所选面积。</li>
	<li>返回时间轴，右键点击图像，选择 取消选择。</li>
	<li>将时间轴滑块移至下一张图像，并点击其下方对应的图块。</li>
	<li>使用快速选择工具在新图像中勾勒囊胚轮廓，并重复测量过程。</li>
	<li>逐张重复此操作（步骤8.9–8.13），直至所有图像的横截面积均被测量并记录。</li>
	<li>最后，进入测量日志，选中 面积 变量下的所有测量值，并将其导出为 .txt 文件。 
	注意：横截面积的单位为平方像素。</li>
</ol>
9. 利用平衡阶段生成的图像中记录的囊胚横截面积编辑数据文件
<ol>
	<li>将记录的囊胚横截面积数据从 .txt 文件转移至电子表格编辑软件中。</li>
	<li>将第一个横截面积值作为参考值1，并将所有其他数值转换为相对于该参考值的分数形式。</li>
	<li>创建一个新变量 Area_r，并将转换后的面积值（不包括参考值）粘贴至其下方。</li>
	<li>在 Area_r 变量旁创建一个 Time 变量，并输入第一个时间值。 
	注：第一个时间值表示从囊胚暴露于平衡溶液开始，到在配备摄像头的显微镜下开始记录之间所经过的时间。</li>
	<li>通过在前一个时间值上增加 20 s 来计算每一个后续连续的时间值。 
	注：此时间间隔用于剔除记录过程中产生的多余视频帧。</li>
</ol>
10. 胚泡的复温
<ol>
	<li>准备用于复苏的培养基。
	<ol>
		<li>在复苏囊胚的前一天，无菌操作将三滴150 µL复苏培养基加入4孔培养皿中。同时，无菌操作将复苏培养基加入专为延时显微成像和记录设计的9孔微滴培养皿中。用石蜡油覆盖复苏培养基，并在37 °C、6% CO2 和5% O2 条件下预孵育。 
		注意：复苏培养基是一种适用于囊胚期胚胎的培养液，添加了人血清白蛋白（HSA），其中HSA浓度应为12 mg/mL。向9孔板的孔中加样时，使用卵母细胞去丘注射用移液管，以避免产生气泡，随后在微滴区域上方覆盖30 µL复苏培养基。</li>
		<li>在复苏囊胚当天，无菌操作将500 µL解冻液（TS）加入4孔培养皿的一个孔中，并将其置于不含CO2 的培养箱中，使其升温至37 °C。</li>
		<li>在室温下，无菌操作在无菌培养皿中分别加入一滴50 µL稀释液（DS）和两滴50 µL洗涤液（WS）。用石蜡油覆盖DS、WS1和WS2液滴。 
		注意：可使用4孔培养皿代替普通培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复苏囊胚。
	<ol>
		<li>确认需从液氮（LN）储存中取出的玻璃化冷冻囊胚所在的HSV吸管，迅速将其转移至盛有液氮的便携式储存罐中，以准备进行复苏操作。</li>
		<li>用镊子夹起吸管，仅需抬高至露出彩色操作杆即可。使用自调节式剥线钳在彩色操作杆高度处剪断吸管。</li>
		<li>抓住操作杆，以迅速但受控的动作将其从吸管中抽出，并立即将操作杆的弯曲铲状端浸入37 °C的解冻液（TS）中。</li>
		<li>轻轻旋转操作杆，使囊胚脱离，并在TS中总共停留1分钟。</li>
		<li>在室温下，将囊胚依次转移至DS、WS1和WS2中，每种溶液中各停留4分钟。</li>
		<li>完成复苏操作后，将囊胚转移至含有复苏培养基的4孔培养皿中，通过轻柔吹打的方式在全部三滴培养基中进行清洗。 
		注意：清洗过程约持续1分钟。</li>
		<li>将囊胚转移至含有复苏培养基的延时成像9孔培养皿中。将9孔培养皿置于培养箱内的延时成像显微镜下（37 °C、6% CO2 和5% O2 条件）。 
		注意：复苏操作从开始至将9孔培养皿置于延时成像显微镜下的培养箱中，全程约需17分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. 囊胚解冻后复苏过程中重新扩张的延时成像记录
<ol>
	<li>运行延时成像记录软件。</li>
	<li>选择一个记录用摄像头。</li>
	<li>按下 实时模式 按钮。</li>
	<li>将鼠标光标置于图像上，使用滚轮按钮放大图像。点击并按住鼠标左键，移动光标，使含有囊胚的孔位于屏幕中央。</li>
	<li>在 聚焦 选项下，使用上下绿色箭头调节囊胚记录平面的焦距。在 光照强度 选项下，设置光照强度。</li>
	<li>点击 显微镜参数 按钮，设置曝光时间和伽马值。</li>
	<li>按下 关闭实时模式 按钮。</li>
	<li>按下 启动项目 按钮，输入项目信息，选择培养皿类型（3 × 3 或 4 × 4），并取消勾选除待记录位置外的所有其他位置。</li>
	<li>设置采集时间间隔为每 5 分钟拍摄一张图像。</li>
	<li>按下 确认 按钮开始记录。记录时间至少持续 150 分钟。</li>
	<li>按下 停止项目 按钮以结束记录。 
	注：参见复温后恢复期间完整囊胚（图3）和塌陷囊胚（图4）记录的代表性结果。</li>
</ol>
12. 冷冻复苏后囊胚重新扩张过程的录制视频编辑
<ol>
	<li>前往项目文件夹，找到大小约为 80 KB 的已录制图像。</li>
	<li>创建另一个文件夹，并将这些图像转移至该文件夹中。根据图像创建时间按数字顺序重命名。随后将其作为图像序列导入视频编辑软件。</li>
	<li>进入 视频选项卡 → 滤镜 → 添加，并选择 无变换 滤镜。</li>
	<li>点击右侧的 裁剪 按钮，对图像进行裁剪，仅保留记录的囊胚区域可见。先点击 确定，再点击一次 确定 以确认操作。</li>
	<li>点击 文件 → 导出 → 图像序列。选择 JPEG 作为输出格式，设置保存图像序列的目录，然后点击 确定。 
	注：此操作将生成已调整大小（裁剪后）的图像，用于后续在视频分析软件中进行测量。</li>
</ol>
13. 在延时录像软件生成的图像中，于视频分析软件内设置测量标尺
<ol>
	<li>运行延时录像软件的分析器。</li>
	<li>打开包含已记录囊胚的项目。</li>
	<li>在包含已记录囊胚的区域点击 分析 按钮。 
	注意：将打开一个新的分析窗口。点击 测量 按钮以显示测量工具。</li>
	<li>使用测量工具测量整幅图像的宽度。</li>
	<li>右键单击图像并将其保存。在属性中，检查图像的像素宽度。</li>
	<li>用图像的实际宽度除以其像素宽度。 
	注意：此操作可计算该图像中单个像素的实际长度。</li>
	<li>运行视频分析软件。</li>
	<li>点击 窗口 选项卡并选择 时间轴。</li>
	<li>在时间轴窗格中，点击胶片条图标并选择 添加媒体...，以添加复温后重新扩张囊胚的图像序列。</li>
	<li>点击 图像 → 分析 → 设置测量尺度 → 自定义，打开测量尺度窗口。在“像素长度”中输入 1；在“逻辑长度”中输入先前计算出的像素实际长度（步骤 13.6）；在“逻辑单位”中输入 µm。保存预设。</li>
</ol>
14. 复温后囊胚重新扩张期间所获图像中囊胚横截面积的测量
<ol>
	<li>设定测量尺度并导入图像序列后，以与步骤 8 中所述相同的方法测量囊胚的横截面积，唯一不同之处在于，这些测量中的横截面积单位为 µm2。</li>
</ol>
15. 编辑记录解冻后囊胚重新扩张过程中所获图像的囊胚横截面积数据文件
<ol>
	<li>将记录的囊胚横截面积数据从 .txt 文件转移到电子表格编辑软件中。</li>
	<li>在面积变量旁创建一个时间变量，并输入第一个时间值。 
	注意：本例中，第一个时间值设为 0 分钟，即延时成像记录的起始时刻。每个后续时间值通过在前一个时间值上增加 5 分钟计算得出。5 分钟是两次连续延时成像记录之间的时间间隔。</li>
</ol>
16. 创建线图
<ol>
	<li>在统计分析软件中导入电子表格数据文件，以创建囊胚在玻璃化冷冻平衡阶段或复温后重新扩张过程中横截面积随时间变化的时间曲线图。</li>
</ol>

<ol><li>Trounson, A., Mohr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pregnancy+following+cryopreservation%2C+thawing+and+transfer+of+an+eight-cell+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo.</a> Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).</li>
<li>Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+observation+of+intracellular+ice+formation+in+unfertilized+mouse+ova+as+a+function+of+cooling+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate.</a> Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).</li>
<li>Cohen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+after+replacement+of+hatching+blastocyst+cryopreserved+at+expanded+blastocyst+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage.</a> Lancet. 1 (8429), 647(1985).</li>
<li>Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+baby+following+vitrification+of+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+Sterility%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts.</a> Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).</li>
<li>Vanderzwalmen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Births+after+vitrification+at+morula+and+blastocyst+stages%3A+effect+of+artificial+reduction+of+the+blastocoelic+cavity+before+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification.</a> Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).</li>
<li>Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+blastocoel+collapse+of+human+blastocysts+before+vitrification+and+its+effect+on+re-expansion+after+warming+-+a+prospective+observational+study+using+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy.</a> Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).</li>
<li>Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cumulative+live+birth+rate+after+GnRH+agonist+trigger+and+elective+cryopreservation+of+all+embryos+in+high+responders%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders.</a> Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).</li>
<li>Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+outcome+of+human+blastocyst+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99(2009).</li>
<li>Ebner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphokinetics+of+vitrified+and+warmed+blastocysts+predicts+implantation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).</li>
<li>Coello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+morphological+dynamics+of+blastocysts+after+vitrification%2Fwarming%3A+defining+new+predictive+variables+of+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+Sterility%22%5BJournal%5D)">Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation.</a> Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).</li>
<li>Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphokinetics+of+human+blastocyst+expansion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro.</a> Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).</li>
<li>Vanderzwalmen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+intracellular+concentration+of+cryoprotectants+after+vitrification+than+after+slow+freezing+despite+exposure+to+higher+concentration+of+cryoprotectant+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions.</a> Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

用于观察囊胚在冷冻保存期间及之后形态动力学的实验方案，也可使用其他厂商的类似仪器和软件工具来实施。适用于胚胎学研究的延时成像系统可实现对胚胎发育过程的连续监测。本研究的目的是引入一种量化方法，用于评估囊胚在玻璃化冷冻前准备阶段以及复温后的行为变化。该方法通过在时间尺度上对形态学变化进行客观测量来实现。这些测量所得结果可进行数学分析，并与其他结果进行比较。本方案可追踪的参数包括：在特定时间段内囊胚本身的大小、内细胞团、囊胚腔或透明带的变化。囊胚大小可表示为囊胚最大横截面的表面积、囊胚周长或直径，经过计算后亦可表示为其体积。
在以往使用延时成像系统的研究中，囊胚腔扩张速度的测量仅针对新鲜胚胎进行11。对于玻璃化冷冻/复温后的囊胚，仅在复温后立即及胚胎移植前测量其大小，或分析复温后囊胚重新扩张至透明带所需的时间9,10。更为详细的囊胚再扩张动态分析仅见于我们之前的研究8。在该研...

如今，在大多数体外受精（IVF）实验室中，对来自体外受精项目的人类着床前胚胎进行冷冻保存已成为常规操作。in vitro 胚胎慢速冷冻方法自1985年开始进入临床应用，当时引入了特定的冷冻保护剂和计算机控制的冷冻仪，可将胚胎在受控条件下逐步降温至-7 °C，并在此时诱导周围冷冻保护液中发生冰晶成核（即“播种”）1。随着持续降温，冰晶逐渐生长，导致剩余液相部分出现高渗状态，从而引起胚胎细胞脱水和收缩。当温度降至-30 °C或-80 °C时，胚胎被投入液氮中进行长期保存。在降温过程中胚胎或卵母细胞所发生的变化，只能通过特制的冷冻显微镜进行观察，这些设备有助于优化冷冻保存方案2。在当时，囊胚阶段的胚胎由于体积较大且含有较多液体，其冷冻效果临床结果并不理想3。
囊胚冷冻保存领域的突破在于玻璃化冷冻方法的引入，该方法在降温前通过使用高浓度的冷冻保护剂实现细胞脱水4。在玻璃化冷冻前，也可通过在两个滋养层细胞之间制造机械性开口来排出囊胚腔内的液体5。尽管玻璃化冷冻与复温后囊胚的即刻存活率超过90%，且将玻璃化冷冻/复温后的囊胚移植入子宫腔后的临床结局几乎与新鲜胚胎移植的结果相当，但该冷冻保存方法尚未实现标准化6,7。玻璃化冷冻方案在以下方面存在差异：（a）冷冻保护剂的种类和浓度；（b）玻璃化前处理步骤的数量；（c）各步骤的持续时间；（d）是否在玻璃化前人工塌陷囊胚腔；（e）塌陷方法；（f）囊胚的扩张阶段；以及（g）胚胎进行玻璃化冷冻时的平衡/玻璃化温度8。由于冷冻保护剂可能对细胞具有毒性，因此必须明确限定囊胚在这些溶液中的暴露时间。然而，一些冷冻保存培养基制造商提供的操作流程具有较大的灵活性。
科学家们通常关注研究囊胚的再扩张能力，旨在寻找能够更准确预测着床潜能的新生物标志物6,9,10。然而，人类囊胚在玻璃化冷冻前添加不同冷冻保护剂步骤中的脱水过程，以及在玻璃化冷冻和复温后、当需要将冷冻保护剂从细胞中去除时囊胚所发生的变化，还有复温后囊胚如何重新吸水并再扩张，这些过程目前尚未被充分描述和阐明。因此，建立一种对囊胚在不同冷冻保存步骤中行为进行客观且量化监测的方法学具有合理性。
利用不同制造商的延时显微镜，现在可以监测囊胚在玻璃化冷冻前和冷冻后的行为变化。结合额外的计算机工具，还可对囊胚的大小进行测量（形态计量）。通过测量胚胎在特定时间内的体积缩小或增大，可对胚胎在脱水和再水化过程中的形态动力学变化进行客观评估。

<table><tbody><tr><td>倒置显微镜 Eclipse TE2000-U&amp;nbsp;</td><td>Nikon, 日本</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Saturn 5 激光系统</td><td>Research Instruments, Origio, 丹麦</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>数码相机 DC1</td><td>Research Instruments, Origio, 丹麦</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>数码相机 DC2</td><td>Research Instruments, Origio, 丹麦</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Cronus 3.7</td><td>Research Instruments, Origio, 丹麦</td><td>/</td><td>显微镜记录软件</td></tr><tr><td>含 6% CO2、5% O2 的培养箱</td><td>Binder, 德国</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Primo Vision 显微镜</td><td>Vitrolife, 瑞典</td><td>16600</td><td></td></tr><tr><td>Primo Vision Capture 软件</td><td>Vitrolife, 瑞典</td><td>16608</td><td>延时成像记录软件</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS6 扩展版软件</td><td>Adobe Systems Incorporated, 美国</td><td>/</td><td>视频分析软件</td></tr><tr><td>VirtualDub&amp;nbsp;</td><td>Avery Lee</td><td>/</td><td>视频编辑软件</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel&amp;nbsp;</td><td>Microsoft, 美国</td><td>/</td><td>电子表格编辑器</td></tr><tr><td>PrimoVision 培养皿</td><td>Vitrolife, 瑞典</td><td>16604</td><td></td></tr><tr><td>G2-plus 培养基</td><td>Vitrolife, 瑞典</td><td>10132</td><td>囊胚阶段胚胎的培养基</td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>Vitrolife, 瑞典</td><td>10064</td><td></td></tr><tr><td>石蜡油</td><td>Vitrolife, 瑞典</td><td>10029</td><td></td></tr><tr><td>平衡液培养基</td><td>Irvine Scientific, 爱尔兰</td><td>90131</td><td></td></tr><tr><td>玻璃化冷冻液培养基</td><td>Irvine Scientific, 爱尔兰</td><td>90132</td><td></td></tr><tr><td>解冻液培养基</td><td>Irvine Scientific, 爱尔兰</td><td>90134</td><td></td></tr><tr><td>稀释液培养基</td><td>Irvine Scientific, 爱尔兰</td><td>90135</td><td></td></tr><tr><td>洗涤液培养基</td><td>Irvine Scientific, 爱尔兰</td><td>90136</td><td></td></tr><tr><td>HSV 玻璃化冷冻吸管</td><td>CryoBio System, 法国</td><td>025246, 025249, 025250, 025248</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo vessel Biosafe 120 MD &amp;beta;</td><td>Cryotherm, 德国</td><td>229286</td><td></td></tr><tr><td>冷冻罐</td><td>Cryotherm, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>/</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>/</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>囊胚操作移液管</td><td>Gynetics, 比利时</td><td>ID275/10</td><td>直径 275 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>卵母细胞去颗粒细胞移液管</td><td>Vitromed, 德国</td><td>V-DEN-135</td><td>直径 135 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>移液器 EZ-Grip</td><td>Research Instruments</td><td>7-72-2802</td><td></td></tr><tr><td>数字间隔计时器 Assistent</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td><td>41977010</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics 21</td><td>IBM, 美国</td><td>/</td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>自调节导线剥皮钳</td><td>Knipex, 德国</td><td>1262180</td><td></td></tr></tbody></table>

囊胚玻璃化冷冻与复温过程中行为客观评估的形态计量学方案

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

本文介绍了一种基于延时显微摄影技术的囊胚形态测量非侵入性方法，用于精确监测囊胚在玻璃化冷冻前后各个阶段体积的动态变化。该方法可通过观察囊胚在不同冷冻前和冷冻后阶段的收缩与再扩张过程，有助于寻找囊胚暴露于不同浓度冷冻保护剂的最优时机，从而优化囊胚玻璃化冷冻方案。为更好地展示该形态测量法的应用价值，本文比较了两种不同的囊胚冷冻前处理方案：一种在冷冻前进行人工囊腔塌陷处理，另一种则不进行此干预。两种情况下囊胚的体积变化均通过延时显微摄影进行追踪，并利用图像编辑软件工具进行测量。测量在冷冻前阶段每20秒进行一次，在复温后阶段每5分钟进行一次。囊胚尺寸随时间的变化以折线图形式直观呈现。结果显示，在较长的平衡预冷冻阶段，完整囊胚首先发生收缩，随后缓慢重新充盈囊腔，最终以含有液体的囊腔状态进入玻璃化冷冻程序；而经人工塌陷的囊胚在整个平衡阶段始终保持收缩状态，在玻璃化冷冻阶段其体积亦无明显变化。由于形态测量结果表明，人工塌陷囊胚在预冷冻阶段体积保持稳定，提示该阶段可能可以缩短。本研究所述方案可提供多种额外的比较参数，用于评估囊胚在冷冻保存过程中及之后的行为特征，包括体积变化的速度与强度、部分囊腔收缩次数或完全囊胚塌陷次数、完全囊腔再扩张所需时间以及孵化所需时间等。

在演示中，我们仅展示了一个玻璃化冷冻前和一个复温后的囊胚形态动力学过程。囊胚在平衡阶段结束时与在培养基中开始恢复时的体积差异，反映了胚胎收缩的程度，这实际上体现了胚胎抵抗冰晶形成的保存效果。
如从图中可观察到的那样 图1 和 视频 1，完整的囊胚在平衡液中并未完全塌陷。囊胚腔仅部分收缩，但在10分钟内缓慢重新扩张至原始体积的70%。与此相反，经人工激光塌陷的囊胚在激光处理后立即完全排空了囊胚腔，但在平衡液中其体积不再发生任何变化图2, 视频 2）。囊胚腔在复苏培养基中的重新扩张情况（图3 和 图4) 结合显微照片与线...

本文介绍了一种时间延时形态测量方案，用于追踪囊胚在玻璃化冷冻前干预过程中的收缩强度以及复温后重新扩张的过程。该方案可应用于 体外 配备延时显微镜的受精实验室，并建议将其用于优化囊胚玻璃化冷冻方法的开发。

本文介绍了一种基于延时显微摄影技术的囊胚形态测量非侵入性方法，用于对...进行精确监测

该形态测量方案可用于监测囊胚在玻璃化冷冻前收缩及复温后重新扩张过程中的强度变化，从而评估玻璃化冷冻方法的有效性。该技术的主要优势在于，可应用于配备有延时显微镜以及装有高级图像编辑软件计算机的体外受精实验室。在囊胚发育至第5天或第6天时，对至少含有数个内细胞团细胞且滋养层结构完整的囊胚，在透明带及两个相邻滋养层细胞交界处施加一次持续时间为0.4至0.7毫秒、孔径为4.3至9.4微米的切向激光脉冲。然后，让囊胚腔完全或部分塌陷，持续五分钟。接着，使用微量移液器无菌地将平衡液加入九孔培养皿的微滴区域孔中，该培养皿专为延时显微成像和记录设计。当全部培养基加入后，在微滴区域上覆盖约 30 µL 的平衡液。将激光处理后的囊胚浸入微滴培养皿中一个微滴孔底部的平衡培养基中。一旦囊胚转移完毕，立即启动10分钟的倒计时。随后将微滴培养皿转移至配备摄像头的显微镜载物台上。使用 200 倍放大倍数，调整微滴培养皿的位置，使囊胚大致位于记录视野的中央。随后，启动显微镜记录软件开始录像，并记录下开始录像的时间点。在将胚胎装入玻璃化冷冻 straw 后，需在装载后 80 至 110 秒内密封 straw，并将其迅速浸入液氮中，随后将囊胚保存于 -196 摄氏度条件下。为了在平衡阶段测量监测中的囊胚的横截面积，将快速选择工具标记置于囊胚内部，直至接触囊胚边缘，然后反复点击并按住鼠标左键，勾勒囊胚的外缘，直至整个囊胚的横截面积被选中。随后，在时间轴窗口中点击测量日志并记录测量值。对于囊胚再扩张，需迅速将装有玻璃化冷冻囊胚的HSV吸管从储存容器转移至装有液氮的便携式储存罐中。用镊子将吸管轻轻抬起至刚好露出彩色操作杆的位置。使用自调节剥线钳在彩色操作杆的高度处切断吸管。然后以快速而受控的动作将操作杆从吸管中取出。立即将操作杆的弯曲刮勺浸入盛有37摄氏度解冻液的容器中，并轻轻旋转操作杆以使囊胚脱离。一分钟后，用稀释液依次进行四次、每次四分钟的洗涤。洗涤液一和洗涤液二。接着，将已预热的囊胚转移至含有新鲜回收培养基的四孔培养皿中，并用移液器在全部三滴培养基中清洗囊胚。最后一次清洗后，将囊胚转移至含有回收培养基的九孔延时成像培养皿中。将九孔培养皿置于37摄氏度、6% CO2和5% O2培养箱中的延时摄影显微镜下。打开延时成像记录软件，选择记录用摄像头。选择实时模式，并将光标置于图像上。滚动以放大图像，并使用鼠标左键将含有囊胚的孔置于屏幕中央。在聚焦时，使用箭头键调整囊胚成像平面的焦距，在光照强度设置中调节图像的光照强度。单击显微镜参数以设置曝光时间和伽马值，然后单击关闭实时模式。单击“开始项目”以进入项目数据界面。选择培养皿类型，并取消勾选除待记录位置之外的所有位置。然后，将捕获时间设置为每五分钟拍摄一张照片，单击“批准”以至少记录150分钟的囊胚重新扩张过程。在此具有代表性的持续监测的完整胚胎中，完整的囊胚在平衡液中并未完全塌陷，经平衡液处理10分钟后重新扩张至原始大小的约70%。相比之下，经激光处理后人工塌陷的囊胚其囊胚腔立即完全排空，在接触平衡液的10分钟内未观察到明显的重新扩张。当使用含有高浓度冷冻保护剂的玻璃化冷冻液处理时，该已平衡的完整囊胚表现出囊胚腔逐步缩小的过程。复温后，该囊胚在接触复苏培养基时再次扩张。然而，经激光脉冲处理的囊胚在激光作用下囊胚腔立即塌陷，且在平衡或玻璃化冷冻步骤中未恢复，这引发了对于已塌陷囊胚是否需要如此长时间平衡阶段的质疑。该方案还揭示了囊胚在复温后重建囊胚腔的能力。例如，解冻后囊胚腔的重新扩张可能是线性的，也可能因多次较大或较小的收缩而中断。在进行该操作时，需注意胚胎在记录过程中必须尽可能短时间地停留在培养皿底部。请勿忘记，高浓度的冷冻保护剂可能对胚胎具有毒性。每次技术进步都为低温生物学领域的研究人员探索体外受精项目中冷冻保存方案的有效性铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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囊胚玻璃化冷冻与复温过程中行为客观评估的形态计量学方案

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