0 次观看 • 2:51 分钟 • June 17th, 2025
从一个全内反射荧光（TIRF）显微镜系统开始，该系统配备一个带有盖玻片的成像室，盖玻片上附着有人神经母细胞瘤细胞，并置于缓冲液中。
这些细胞表达特异性针对突触小泡膜的荧光蛋白。
在落射荧光模式下，选择一个细胞进行成像。
在TIRF模式下，通过物镜将激光照射到样品上，在盖玻片上呈现为一个光斑。
调整角度，使其超过高折射率玻璃盖玻片与低折射率样品界面处的临界角，从而产生全内反射（TIR），表现为一条细线。
TIR 产生倏逝波，激发最邻近膜上的荧光分子。
发射的荧光由物镜收集，并通过相机捕获。
微调以获得盖玻片附近细胞膜的高对比度图像。
优化采集参数以最小化光漂白，并设置采样频率。
开始TIRF成像以观察融合的突触小泡。
在落射荧光模式下，聚焦于盖玻片，并选择位于腔室中央的转染细胞。在软件控制下，切换至光场照明的实时模式。设置光场构型时，需检查从物镜射出并投射到样品盖上的光束位置。当光束位于物镜镜头中心时，光场样品盖中心将出现一个光斑，此时细胞处于落射荧光成像模式下。
为达到临界角，使用草坪滑块上的角度调节螺钉沿 Y 方向移动聚焦光斑。当光束以大于临界角的角度在样品平面汇聚时，光斑消失，在样品盖的中央出现一条清晰、细直的聚焦线。为精细调节草坪角度，可使用细胞样品进行调整。
观察视频中的荧光图像。在此阶段，仍可见类似落射荧光的图像。轻轻调节螺丝，直至达到平顶光场条件。此时，细胞仅有一个光学层面处于焦点，从而获得高对比度的平面图像。
进行样品成像时，设置单通道时间序列实验。合适的曝光时间在 40 至 80 毫秒之间。以 1 或 2 赫兹的采样频率采集图像。