使用全内反射荧光显微镜进行细胞成像

从全内反射荧光（TIRF）显微镜设置开始，带有一个有盖的成像室，其中包含缓冲液中粘附的人神经母细胞瘤细胞的玻璃盖玻片。

这些细胞表达突触囊泡膜特异性的荧光团。

在落射荧光模式下，选择一个细胞进行成像。

在 TIRF 模式下，通过物镜，将激光对准样品，在盖子上显示为一个点。

调整角度以超过高折射率玻璃盖玻片和低折射率样品之间界面处的临界角，从而产生全内反射 （TIR），视为一条细线。

TIR 产生倏逝波，激发最近膜上的荧光团。

发射的荧光由物镜收集并由相机捕获。

调盖玻片附近细胞膜的高对比度图像。

优化采集设置以最大限度地减少光漂白并设置采样频率。

开始 TIRF 成像以可视化融合的突触小泡。

在落射荧光模式下，聚焦于盖玻片，并选择放置在腔室中心的转染细胞。在软件控制下，在实时模式下切换到草坪照明。要设置草皮配置，请检查样品盖上从物镜中伸出的光束的位置。当光束位于物镜中心时，在草皮样品盖的中心可以看到一个点，并且细胞以落射荧光模式成像。

要达到临界角，请使用草皮滑块上的角度调节螺钉沿 Y 方向移动聚焦点。当光束以大于临界角的角度会聚在样品平面上时，光斑消失，并且在样品盖的中间出现一条笔直、细、聚焦的线。要微调草皮角度，请使用细胞样本。

观看视频中的荧光图像。在这个阶段，类似落射荧光的图像仍然可见。轻轻移动螺钉，直到达到草皮状况。在这里，只有细胞的一个光学平面对焦，从而产生具有高对比度的平面图像。

要进行样品成像，请设置单通道延时实验。适当的曝光时间在 40 到 80 毫秒之间。以 1 或 2 赫兹采样频率采集图像。