用于表视胞吐事件的全内反射荧光显微镜

从在全内反射荧光或 TIRF 显微镜载物台上包含胚胎皮质神经元的玻璃底培养皿开始。

这些神经元表达 pH 敏感的绿色荧光蛋白或 GFP 标记的囊泡标记物，该标记物在中性细胞外 pH 值下发出荧光，但在酸性囊泡中保持无荧光。

泡与质膜融合后，暴露于细胞外 pH 值会诱导荧光，标志着胞吐作用事件。

选择物镜并设置折射率以匹配神经元。

激光束与玻璃成一定角度对准，从而产生全内反射并产生倏逝波。该波选择性地激发质膜附近的 GFP 标记物。

设置TIRF穿透深度以排除倏逝场上方的GFP标记。

首先，使用宽场落射荧光照明来定位表达 GFP 的神经元。

然后，切换到 TIRF 照明进行膜特异性激发。

获取延时图像以记录囊泡融合事件并可视化胞吐作用。

设置好TIRF显微镜和样品，根据文本协议找到神经元焦平面后，启动激光软件并连接到激光控制软件。将照明设置为宽视野，然后选择物镜。然后设置样品的折射率，并通过取消选中 491 激光器的 TTL 来调整激光强度。

对地板完整胞外囊泡进行成像过程中，成像参数优化非常重要，以避免焦点漂移和光毒性，同时产生足以进行分析的高信噪比图像。

滑块调整为 100，然后将其调回 20 到 40 之间的值。然后重新检查 TTL。接下来，在透射光照明下再次聚焦样品。

然后在成像软件中，选择491激光照明，打开快门。将聚光镜倒置在光学台上，以免划伤镜头。微调天花板上激光的焦点。

下冷凝器后，将点居中到闭场振膜的中心。然后更换冷凝器。并在TIRF软件中，将穿透深度设置为110纳米。然后从宽场照明切换到 TIRF 照明模式进行成像。

现在，使用宽视场落射荧光，通过眼睛找到表达 VAMP2 florin 的细胞。然后，为了减少光漂白和光毒性，调整成像参数，以使用最短的曝光时间和激光强度最大限度地提高信噪比和动态范围。设置每个单元格的连续自动对焦。然后采集一组延时图像，每 0.5 秒采集一次，持续 5 分钟。