使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层结构与动态

本实验的总体目标是获取具有细胞壁的微生物的高质量全内反射、荧光或TURF图像。首先需要准备盖玻片和细胞，然后精确调整显微镜系统，以获得最佳的图像质量。

接下来，选择正确的事件、角度和成像条件以采集图像或视频。最后一步是对所获得的图像进行成像后处理。最终，利用草坪显微技术研究蛋白质在细胞皮层的定位动态。

与传统的或共聚焦显微镜等常规金属技术相比，该技术的主要优势在于其显微成像的对比度非常高，能够实现快速成像并使用低光照条件。因此，该方法有助于回答膜研究领域中的关键科学问题，例如膜蛋白侧向分隔的机制，或膜蛋白的流动性问题。用于全内反射显微镜的盖玻片在使用前应清除灰尘颗粒。

由于草坪对脏盖玻片上灰尘产生的背景信号敏感，因此在开始盖玻片清洗程序前，需要使用背景较低的洁净盖玻片。用镊子将盖玻片放入带盖的陶瓷 holder 中。

接着，用一个玻璃容器装入一摩尔的氢氧化钠。该氢氧化钠可多次重复使用。将装有盖玻片的陶瓷架放入氢氧化钠中，并在缓慢持续旋转条件下孵育盖玻片两小时。

孵育时间不得超过八小时，因为这将导致两小时后盖玻片变得不透明。在缓慢连续旋转下，用蒸馏水清洗盖玻片，每次五分钟，共清洗两次。将清洁后的盖玻片存放在盛有100%乙醇的陶瓷架中。为进行菌苔显微镜观察，将枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）细胞用适当的生长培养基稀释至OD600为0.01至0.05，总体积为五毫升，并培养至对数生长期。在合成培养基中制备1.25%琼脂糖：将琼脂糖粉末置于1.5毫升塑料管中，于95摄氏度溶解，随后置于72摄氏度加热块中保存。

在载玻片中央加入一小滴 aros，再用另一张载玻片在至少两分钟后将 aros 压成扁平状，然后小心地将两张载玻片分开。取 500 µL 枯草芽孢杆菌（bacillus subtlest）细胞，在微型离心机中以 12,000 RPM 离心一分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 50 µL 培养基中。

向凹孔载物台中央加入 2 至 4 微升细胞。接着，用镊子从盛有乙醇的容器中取出一块已清洁的盖玻片，并用加压空气吹干。小心地将盖玻片放置在样品上。

在显微观察前，让细胞静置至少两分钟。对于长期成像，用加热的凡士林、羊毛脂和石蜡混合物或Val app密封盖玻片边缘。为进行草坪显微观察，需将预培养物稀释，并在适当的培养基中培养至少五小时。

进入对数生长期后，从盛有乙醇的容器中取出一张盖玻片，用移液管吹散的加压空气将其吹干。取5 µL凝集素Con A或Con A溶液滴加到盖玻片上，再用加压空气吹干。Con A可结合酵母细胞壁中的碳水化合物，从而固定酵母细胞。

接下来，将 4.5 µL 酵母细胞悬液转移至凹面载玻片的一侧，该载玻片为经过涂层处理的盖玻片。将盖玻片的样品面向下，从一侧边缘开始小心地放置在显微镜载玻片上，并让液体缓慢滴落。这样可避免产生气泡。

在显微成像前，让细胞静置至少两分钟，然后用凡士林封固盖玻片边缘以进行长期成像。本视频中展示的所有实验均在一个定制的透射光显微成像系统上完成，该系统基于全自动 IMEX 显微镜平台，并配备 Olympus 100 倍、1.45 数值孔径（NA）的物镜。所使用的光源为 75 毫瓦的半导体泵浦固体（DPSS）激光器，波长分别为 488 纳米和 561 纳米。

草坪角度与荧光。通过两个检流计可即时调节光漂白后的恢复或frat位置。第三个检流计用于在落射光、荧光、frap和turf之间切换。

通过实时采集软件直接控制的检流计，可对草坪图像中追踪的对象进行简单的定位动力学测量。这些图像由 EM CCD 相机配合相机前部的 2 倍放大镜采集。采集过程同样由实时采集软件控制。在使用激光器之前，需佩戴激光防护眼镜，将激光器在草坪模式下投射到天花板上，并校准零度位置，使激光处于一条直线。

为实现最佳效果，通过优化调节将激光光斑聚焦至最小尺寸，此时激光轮廓应形成一个边界清晰、大致呈圆形的光斑。每次实验前均需进行校准。为获得最优图像质量， turf 显微镜的准直调节对该实验的成功至关重要。

为了获得最佳的图像质量，必须仔细调整图像采集的入射光位置、角度和参数。开始图像采集时，使用明场照明确定细胞的位置。红光LED尤其适用，因为其不会引起显著的光损伤。

切换至激光照明，并选择合适的激光器和滤光片组合以激发目标荧光染料，确保光束入射角为亚临界角。否则将无法检测到GFP融合蛋白产生的信号。找到细胞的顶部区域，即朝向盖玻片一侧的细胞表面。

逐渐增大激光束的入射角，直至信号消失，然后缓慢减小角度，直到细胞表面荧光重新出现。再次调节Z轴焦距，以获得细胞表面的最佳成像位置。可接受的入射角应不会在细胞边缘产生模糊光晕，酵母蛋白的此示例即展示了这一情况。

从左上到右下，入射角逐渐减小，对PMA上的GFP进行成像。图像显示在临界角处信号突然消失，并且结构信息以及信噪比逐渐降低。调节激光强度和相机增益以最大化动态范围。通常，E-M-C-C-D相机最适合在高信噪比条件下检测极低信号。

表面显微镜对微小高度非常敏感。盖玻片的微小差异会导致仅有少数几个细胞能够同时成像。这幅荧光微珠浓悬浮液的图像就是一个视野不均匀的例子，其中只有部分视野处于焦点范围内。

因此，对于较小的细胞，采集区域通常可以缩小至包含目标对象的子区域。在双色草坪实验中，必须尽量减少R-F-P-G-F-P组合的荧光染料串色。由于RFP可被488纳米光微弱激发，应使用独立的发射滤光片。

为避免串色和实现双色成像，典型的实验流程如上所示。在使用不同的滤光片组分别对细胞成像后，需利用荧光微球对图像进行拆分与校准，然后再进行合并。在分析过程中，影响图像质量的一个关键参数是激光的准直以及物镜的清洁。在完成激光校准并聚焦至用于成像的Z轴位置后，取出样品，并将物镜上的所有镜油清理干净。

残留的油污会导致激光发生衍射，并在光束轮廓中产生散斑。草坪显微技术可用于观察细菌细胞中肌动蛋白同源物和细胞壁酶的分布情况。在此代表性结果中，表达肌动蛋白同源物 MreB 或转肽酶 PBP2 的绿色荧光蛋白融合蛋白的枯草芽孢杆菌细胞，分别通过草坪显微和常规落射荧光显微技术进行成像。

此处的图像代表了时间序列的平均投影，用以指示运动性 MBL 菌斑所覆盖的区域，该菌斑通过不同成像模式进行监测。叠加图像中的蓝色轮廓表示从明场图像中观察到的细胞边界。

每周表达的转肽酶 PBPH 定位于皮层斑块，这些斑块通过落射荧光难以观察，但可通过 TURF 清晰分辨。在箭头所示的隔膜处，P-B-P-H-G-F-P 信号的穿透性降低最为明显：在落射荧光中呈现为线条状，而在 TURF 中则呈现为点状。下一组图像展示了 TOR 复合物组分 Bit61 在酿酒酵母（Saccharomyces visi）中落射荧光与 TURF 照明的对比情况。

该蛋白表达较弱，仅形成少量皮层斑块，每斑块中仅有少数几个蛋白拷贝。在落射荧光成像中，仅有少数斑块能从强烈的背景信号中显现；而在TURF成像中，斑块的信噪比非常高，可清晰观察。通过多种图像处理步骤，例如减去高斯模糊或中值模糊图像，可进一步提升图像对比度；而局部背景扣除则可去除噪声并增强高亮度结构的清晰度。

这通常会以丢失精细结构和过度放大高强度区域为代价。如箭头所示，更优的方法是二维去卷积，可使用免费或商业软件包完成。去卷积后对比度的提升通过这段 GFP RAs two 的延时电影得以展示，该影片交替显示了原始图像和去卷积后的图像。

由于GFP RAs two是一种快速移动的蛋白质，快速采集时间对于解析其动态行为至关重要。图像处理在共定位分析中尤为重要，这一点在此处酵母蛋白FET3G FP和PMA1 RFP的时间推移双色电影中得到了说明。

前 10 帧为原始图像，其余帧为去模糊处理后的图像。为了实现有效分析，最大限度地增强对比度并锐化模糊的原始图像是至关重要的。Turf 和 frap 提供了一种强大的组合方法，可用于研究皮层蛋白的动力学行为。利用该技术对表达 G-F-P-M-B-L 的 B 细微细胞进行分析，排除了“踏车”机制作为含 MBL 斑块运动的可能解释。

移动区域的 chm 图及其沿虚线所示 chm 图的强度分布，以类似于酵母细胞质膜 turf frap 的方式展示。TPAs PMA 1 揭示了酵母细胞质膜蛋白的缓慢重排现象，这些蛋白在细胞表面发育完成后分布成网络状结构域。该技术为细菌细胞生物学领域研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）细胞壁合成机制的研究奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何获取酵母和细菌等微生物的皮层蛋白动态特性研究中所需的菌落图像，以及该技术在研究皮层蛋白动态特性方面的应用。