Name: 皮层组织和动态可视化的微生物，利用全内反射荧光显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学习使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层蛋白质动态定位的方法。该技术适用于细菌和真菌细胞，可实现高对比度、高时间分辨率的活细胞成像，为研究膜蛋白动态行为提供重要工具。

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本工作由马克斯·普朗克学会资助。

1. 样品制备
<ol class="lalpha">
 <li>准备盖玻片
 应清除盖玻片上的灰尘颗粒，因为全内反射荧光显微镜（TIRF）对来自盖玻片的背景信号非常敏感（图 1A，视频 1）。
 <ol>
 <li>使用镊子将盖玻片放入带盖的陶瓷 holder 中。</li>
 <li>在玻璃容器中加入 1 M NaOH（可多次重复使用）。</li>
 <li>在缓慢连续旋转（轨道摇床）条件下孵育 2 小时。过度孵育（> 8 小时）会导致盖玻片变浑浊。</li>
 <li>在缓慢连续旋转条件下，用蒸馏水洗涤两次，每次 5 分钟。</li>
 <li>将盖玻片储存在盛有 100% 乙醇的陶瓷 holder 中。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>准备 Bacillus subtilis 细胞 
 <ol>
 <li>将菌液稀释至 OD600 为 0.01 - 0.05，加入 5 ml 合适的培养基中，培养至对数生长期（OD600 为 0.3-0.7）。</li>
 <li>配制 1.25% 琼脂糖水溶液或培养基溶液。建议使用合成培养基以减少背景荧光。在 95°C 条件下于 1.5 ml 塑料离心管中溶解粉末，并保存在 72°C 加热块中。</li>
 <li>在载玻片中央滴加少量琼脂糖，用另一张载玻片压成平整的垫片。至少静置 2 分钟后或在使用前小心分离两片载玻片。</li>
 <li>取 500 μl 细胞悬液，在微量离心机中以 12,000 rpm 离心 1 分钟。</li>
 <li>弃去上清液，将沉淀重悬于 50 μl 培养基中。</li>
 <li>取 2–4 μl 细胞悬液加至琼脂糖垫中央。</li>
 <li>用镊子从盛有乙醇的容器中取出一块已清洁的盖玻片，用加压空气吹干，小心地覆盖在样品上。</li>
 <li>显微观察前让细胞沉降至少 2 分钟。</li>
 <li>如需长时间成像，可用 VALAP（凡士林、羊毛脂和石蜡，按等质量比加热混合）密封盖玻片边缘（用小刷子或刮刀涂抹）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>准备 Saccharomyces cerevisiae 细胞 
 <ol>
 <li>将预培养物稀释后，在合适的培养基中生长至少 5 小时至对数生长期（OD600 为 0.2–0.8）。</li>
 <li>用镊子从容器中取出盖玻片，用加压空气吹干。</li>
 <li>用移液器在盖玻片上滴加 5 μl 刀豆蛋白 A 溶液（ConA，2 μg/ml 溶于蒸馏水中），然后用加压空气吹干。ConA 可结合酵母细胞壁中的碳水化合物，从而固定酵母细胞。</li>
 <li>将 4.5 μl 酵母细胞悬液转移至 ConA 涂覆的盖玻片一侧，小心地将盖玻片放置在显微镜载玻片上。从一侧开始，缓慢放下，以避免产生气泡。</li>
 <li>显微观察前让细胞沉降至少 2 分钟。</li>
 <li>如需长时间成像，可用 VALAP（见上文）密封盖玻片边缘。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. 图像采集
<ol class="lalpha">
 <li>显微镜设置
 
所有实验均在定制的全内反射荧光（TIRF）显微镜系统上进行，该系统基于完全自动化的iMIC显微镜支架（Till Photonics），配备奥林巴斯100倍、数值孔径（NA）为1.45的物镜。使用488 nm（Coherent Sapphire）和561 nm（Cobolt Jive）的75 mW半导体泵浦固体（DPSS）激光器作为光源。通过声光可调滤波器（AOTF）选择激光，并经由宽带光纤导入iMIC系统。采用由伺服电机驱动的双轴扫描头调节入射角度或荧光漂白后恢复（FRAP）的位置。额外的一个伺服电机用于在落射荧光、FRAP和TIRF模式之间切换。图像由Andor iXON DU-897 EMCCD相机采集，并在相机前加装2倍放大镜。图像采集由Live Acquisition（Till Photonics）软件包控制。 
以下几点需特别注意： 
<ol>
 <li>照明光源（激光线）和TIRF角度的可编程控制对于获得可重复的结果至关重要，尤其是在多色TIRF实验中，需要针对每种激发波长调节入射角，以确保倏逝波具有相同的穿透深度。在我们的系统中，可通过两个伺服电机即时调节TIRF角度，这两个电机由Live Acquisition软件直接控制。</li>
 <li>我们定制的系统还通过第三个伺服电机实现落射荧光、TIRF和FRAP之间的快速切换，从而可简便地测量在TIRF中追踪对象的定位动力学。</li>
 <li>物镜型TIRF要求高数值孔径（NA&gt;1.4）。我们使用了奥林巴斯100倍、NA 1.45的物镜。</li>
 <li>由于具有高信噪比，EMCCD相机非常适合TIRF成像。为了实现最佳灵敏度的成像，我们使用了512×512像素、背照式EMCCD相机，像素尺寸为16 μm。为保持最大分辨率，在相机前加装了2倍放大镜。</li>
 <li>由于TIRF是一种宽场技术，激光束强度被分散。因此，较强功率的激光通常有助于改善成像效果。我们使用了488 nm和561 nm的75 mW半导体泵浦固体（DPSS）激光器。</li>
 <li>为在成像过程中维持细胞的最佳生长条件，应使用适当的环境控制系统。我们使用自制的加热腔室（图1B）研究酵母温度敏感型突变体。在采集过程中进行培养基更换时，可使用简单的流动腔室或玻璃底培养皿，后者可在倒置显微镜上从上方方便地操作。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>参数调节 
 <ol>
 <li>使用明场照明确定细胞位置。红光LED尤为合适，因其不会引起显著的光损伤。</li>
 <li>切换至激光照明，并选择适当的激光和滤光片组合以激发目标荧光团。确保TIRF角度处于临界角以下，否则将无法检测到GFP融合蛋白产生的信号。如有疑问，可先将TIRF角度设为0°，以获得垂直入射的激光束。找到细胞的顶部区域（即靠近盖玻片的一侧）。调整激光束的入射角直至信号消失，然后缓慢增加角度，直到细胞表面荧光重新出现（视频2）。再次调节z轴焦距，使表面成像位置达到最佳。合适的TIRF角度应在细胞边缘不产生模糊的光晕（图1C）。若在设置过程中发生明显光漂白，应保存当前TIRF角度，并在开始正式采集前移动至未漂白的视野区域。</li>
 <li>调节激光强度和相机增益，以最大化动态范围（在不使像素饱和的前提下获得高信噪比）。通常，EMCCD相机最适合检测极低信号下的高信噪比图像；而对于较强信号，常规CCD相机噪声更低且动态范围更宽。</li>
 <li>TIRF显微镜对盖玻片微小的高度差异极为敏感，导致通常只能同时对少数几个细胞进行成像（图1D）。对于较小的细胞，采集区域（感兴趣区域，ROI）通常可缩小至包含目标对象的子区域。这也有助于减少数据从芯片传输到硬盘所需的时间，该过程往往是高帧率成像中的速率限制步骤。</li>
 <li>进行双色TIRF实验时，应尽量减少荧光串色。对于RFP/GFP组合，应使用独立的发射滤光片，因为RFP可被488 nm光微弱激发（图2A）。大多数滤光片之间并非完全对齐。可通过将荧光微珠与细胞混合来校正滤光片偏移。为实现相近的穿透深度，需针对每条激光线分别调节TIRF角度。典型工作流程见图2B。</li>
 <li>影响图像质量的一个关键参数是激光准直和物镜清洁度。进行激光准直时，首先聚焦至用于TIRF成像的z轴位置。然后移除样品，并彻底清除物镜上的所有浸油（残留油渍会导致激光衍射并在光束轮廓中产生散斑）。在TIRF模式下将激光投射到天花板上，校准0°位置，使激光与物镜保持直线对齐（使用参考光斑，务必佩戴激光防护眼镜，并避免光路中出现任何反射）。将激光光斑聚焦至最小尺寸。我们的系统在伺服电机与显微镜之间设有可移动透镜，便于快速校准。在最佳调节状态下，激光轮廓应形成一个边界清晰、大致呈圆形的光斑。每次实验前均应执行校准，以获得最优图像质量。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. 代表性结果
<ol class="lalpha">
 <li>肌动蛋白同源物及细胞壁酶在细胞中的分布 Bacillus subtilis. 我们通过全内反射荧光显微镜（TIRF）和常规落射荧光显微镜对表达肌动蛋白同源物 Mbl 或转肽酶 PbpH 的 GFP 融合蛋白的细胞进行了成像。TIRF 中的穿透深度明显降低，仅限于面向盖玻片的表面区域。图 3A、B）。弱表达的转肽酶 PbpH 定位于皮层斑块，通过落射荧光难以观察，但可通过全内反射荧光（TIRF）清晰分辨图 3B）。PbpHGFP 信号在隔膜处的穿透减少最为明显，在落射荧光显微镜下呈现为线条状，而在全内反射荧光显微镜（TIRF）下则呈现为点状图3B，箭头).</li> 
 <li>酵母细胞质膜中的蛋白质结构域 酵母中由质膜蛋白形成的网络样模式的示例已在 图 1C 和 2除了TIRF显微镜提供的增强对比度可清晰区分这些网状结构外，某些微弱信号有时仅能通过TIRF显微镜检测到。例如，我们对TORC2复合物组分Bit61的GFP融合蛋白进行了成像，该蛋白来源于 Saccharomyces cerevisiae该蛋白表达较弱，形成的小型皮层斑块中每斑块仅含少量蛋白拷贝9在落射荧光显微镜下，仅能观察到少数斑点位于强烈的背景之上，而在全内反射荧光显微镜（TIRF）中，斑点可被清晰成像，信噪比非常高。图 3C因此，TIRF 特别适用于研究细胞表面弱荧光的结构和蛋白质。 
 TIRF 提供的高轴向分辨率已能降低背景荧光。通过多种图像处理步骤可进一步提高图像对比度。一种简单的标准技术是局部背景均衡化，即从原始图像中减去一幅模糊图像。模糊可通过多种低通滤波器实现，包括中值滤波器或高斯滤波器（图 3D）。局部背景减除可去除噪声并增强高强度结构的清晰度，但通常会以丢失精细结构为代价，并导致高强度区域被过度放大图 3D，箭头）。更优的方法是二维去卷积，可使用免费或商业软件包（如 ImageJ、Matlab 或 Huygens（Scientific Volume Imaging b.v.））实现。TIRF 图像具有极佳的轴向分辨率，因此其点扩散函数（PSF）几乎呈二维分布。我们通过使用与实际成像相同的设置（物镜、相机、激发和发射波长）采集 40 nm 荧光微球的图像，实验测定该 PSF。随后在 Huygens 软件中采用经典的极大似然算法，利用实验测得的 PSF 进行去卷积处理。GFPRas2 或 Fet3GFP 与 Pma1RFP 的延时成像视频（视频 3 和 4) 展示去卷积后对比度的增强。在双色图像中，最大化对比度至关重要，以便能够量化共定位值。视频 4).</li> 
 <li>细胞皮层蛋白质周转分析 全内反射荧光显微镜（TIRF）与荧光漂白恢复技术（FRAP）相结合，为研究皮层蛋白动态提供了强大工具。然而，为高效利用这些技术，需快速调控激光角度与位置。在TIRF这一宽场技术中，激光必须聚焦于物镜的后焦平面，并以较小的入射角入射，以实现所需的全内反射。相比之下，FRAP要求激光直接聚焦于样品，并具备高空间精度，以便对特定结构或区域进行漂白。本研究中所采用的Till Photonics系统可对上述参数实现快速且直观的控制。系统使用两个由检流计驱动的反射镜，用于调节FRAP在x、y方向的位置或设定TIRF的入射角；另有一个反射镜用于切换TIRF与FRAP各自的光路（在TIRF光路中，激光通过附加透镜被展宽）。所有参数均由LA（live acquisition）软件控制，且可在每次实验前快速完成校准，以达到最佳成像条件。该软件还支持在图像采集过程中定义漂白位置，这对于运动结构的FRAP实验至关重要。 
利用这一特性，我们可以排除Mbl纤维的踏车行为作为含Mbl斑块运动的来源图 3E这一观察结果促使我们寻找其他运动机制，最终导致我们发现了一种完全出乎意料的运动方式：细胞内的蛋白质复合物（包括Mbl）通过位于细胞外侧的细胞壁合成酶的活性被推动移动4以类似的方式，我们能够观察到酵母细胞质膜蛋白的缓慢重排，这些蛋白分布形成网状结构域，覆盖整个细胞表面（图 3F). 
这些实例展示了如何通过结合全内反射荧光显微技术（TIRF）和荧光漂白恢复技术（FRAP）直接评估皮层蛋白的动力学行为与空间分布模式。</li>
</ol>














4. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/3982/3982fig1.jpg" alt="显微镜图像分析灰尘和乳胶颗粒，用于光学实验的光谱学装置。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 参数调节。A. 污染与清洁盖玻片的对比。盖玻片上的灰尘产生的背景信号会干扰潜在的GFP/RFP信号，清洁后的盖玻片背景较低。B. 自制电加热控制器，显示设定温度（a）、探针处温度（b）和样品台温度（c）。C. 酿酒酵母蛋白Pma1GFP在入射角逐渐减小条件下成像（从左上到右下）。图像显示在临界角处信号突然消失，并且结构信息和信噪比逐步下降。D. 视场不均匀。对高密度荧光微球悬浮液成像，显示仅有部分视场处于焦点范围内。A、B中的标尺：2 μm，C中的标尺：10 μm。

<img src="/files/ftp_upload/3982/3982fig2.jpg" alt="使用红/绿激光通道对齐进行细胞成像；示意图显示去卷积与细胞检测过程。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 双色成像。A. Pil1RFP的串色现象。使用488 nm和561 nm激光激发Pil1RFP，并通过双通道带通滤光片记录荧光信号。Pil1RFP信号在GFP通道中微弱可见。比例尺：2 μm B. 在双色成像中避免串色的典型步骤。分别使用不同的滤光片组对细胞成像后，通过荧光微珠对图像进行去卷积和对齐，然后合并用于分析。

<img src="/files/ftp_upload/3982/3982fig3.jpg" alt="使用TIRFM、Epi、DIC的荧光显微镜；GFP融合蛋白定位；高斯、中值、去卷积处理。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 代表性结果。A. 使用全内反射荧光（TIRF）或常规落射荧光（Epi）显微镜观察B. subtilis中GFPMbl分布的比较。蓝色：明场图像中的细胞边界。图像代表时间序列的平均投影，用于显示通过不同成像模式监测到的运动性MreB斑块所覆盖的区域。B. 对B. subtilis中转肽酶PbpHGFP进行TIRF成像所获得的轴向分辨率和对比度的提升。箭头指示在落射荧光下呈环状、而在TIRF下呈斑块状的隔膜染色。曝光时间：100 ms。C. 对酿酒酵母（S. cerevisiae）中TOR复合物组分Bit61在落射荧光与TIRF照明下的成像比较。Bit61表达水平极低9。曝光时间：250 ms。D. 不同图像处理方法的比较。图示为Pma1GFP的原始TIRF图像，以及高斯模糊或中值模糊图像相减结果，还有使用Huygens软件中最大似然算法进行去卷积的结果。E. 单个GFPMbl斑块（星号上方）在B. subtilis细胞上移动时的TIRF-FRAP实验。该斑块无恢复的明暗图及其沿明暗图的强度分布（虚线）排除了“踏车”运动作为其运动来源的可能性。F. 表达Pma1GFP的酵母细胞的TIRF-FRAP实验。注意皮层染色模式中缺口呈扩散性闭合。比例尺：2 μm。时间为秒。
视频 1. 在脏的盖玻片上表达 RFP 融合蛋白的 B. subtilis 细胞的动态成像。请注意，RFP 信号几乎无法与背景噪声区分。循环时间为 100 ms。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3982/3982_Movie1.mp4" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
视频 2. Pma1GFP 在不同入射角度下的成像视频。入射角度从低于临界角逐渐调整至临界角，直至信号消失。注意，在低于临界角时，内部信号可见，导致图像噪声较大；仅当达到临界角时，细胞膜（PM）上的蛋白信号才清晰可见。循环时间为 200 ms。比例尺：2 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3982/3982_Movie2.mov" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
视频 3. 酵母 GFPRas2 的动态视频，显示交替的 RAW 图像与去卷积 TIRF 图像。GFPRas2 是一种快速移动的蛋白质（半衰期为 2 秒，未发表数据），因此快速采集时间对于解析其动态行为至关重要。循环时间为 150 毫秒。比例尺：2 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3982/3982_Movie3.mov" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
视频 4. 酵母蛋白 Fet3GFP 和 Pma1RFP 的双色成像。前 10 帧为原始图像，最后的帧为去卷积处理后的图像。该视频展示了图像处理在共定位分析中的重要性。模糊的原始图像经处理后变得清晰，从而使分析成为可能。循环时间 5 s。比例尺：2 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3982/3982_Movie4.mov" target="_blank">点击此处查看视频</a>。

<ol><li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li>
<li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+it%2C+switch+it%2C+bounce+it%2C+pull+it%3A+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li>
<li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide%2C+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li>
<li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics%3A+Generating+randomness+by+formin%28g%29+and+moving%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li>
<li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li>
<li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li>
<li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

全内反射荧光显微镜（TIRF）是成像外周蛋白的首选技术。由于消逝场的穿透深度较浅，可最大程度减少离焦光，从而获得极佳的信噪比，使得能够以高帧率进行数据采集，或对表达量极低的蛋白进行成像。高对比度与高帧率的结合，使TIRF显微镜成为研究皮层局部化蛋白时空动态的理想工具。有趣的是，许多微生物周围较厚的细胞壁并不会阻碍TIRF对外周蛋白的成像。事实上，消逝场的实际产生位置很可能位于细胞壁与质膜之间的界面5,10。从细胞中出射的光可能发生反射，进而沿细胞壁传播，这或许可以解释在酵母细胞中能够成像较大表面积的原因8。
为了获得高质量的全内反射荧光（TIRF）图像，必须确保显微镜系统经过良好校准。每次成像前，应聚焦并校正激光光路。盖玻片需清洁（图1A），细胞必须被妥善固定。进行双色成像时，需考虑或通过使用可分离发射波段的滤光片组来消除光谱串色。但显然，由于机械滤光片切换，这将导致成像速度变慢。如有必要，可采用快速滤光轮或基于检流计驱动的照明光源以避免此类延迟。或者，可将关键荧光蛋白（RFP）用于表达水平较低的目标蛋白...

<table><tbody><tr><td>轨道摇床</td><td>UniEquip</td><td>UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER</td><td></td></tr><tr><td>全内反射荧光显微镜</td><td></td><td>定制装置</td><td></td></tr><tr><td>玻璃容器</td><td>Vitlab</td><td>340-232880353</td><td></td></tr><tr><td>陶瓷染色架</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 #1（18 × 18 mm）</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB018018A1</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Menzel-Glaser</td><td>AA00000102E</td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Immersol 518F</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8795</td><td></td></tr></tbody></table>

使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层结构与动态

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

全内反射荧光显微镜（TIRF）已成为一种强大的成像技术，用于研究体外及活细胞中荧光分子的空间-时间动态1。当光以大于某一特征临界角（即更接近与界面平行）的角度从折射率较高的介质进入折射率较低的介质时，会发生全内反射这一光学现象。尽管在此条件下所有光线均被反射回原介质，但仍会产生一种沿界面传播的隐逝波，该波随距离呈指数衰减，仅能穿透距界面约100–200 nm范围内的样品区域2。除了提供优异的轴向分辨率外，TIRF还能显著减少离焦荧光分子的激发，从而获得极高的信噪比，并最大限度地降低光漂白带来的损伤效应2,3。作为一种宽场成像技术，TIRF也比大多数基于扫描的共聚焦系统具有更快的图像采集速度。
从表面上看，全内反射荧光显微镜（TIRF）较浅的穿透深度似乎难以适用于成像具有厚细胞壁的细菌和真菌细胞。然而，我们发现酵母和细菌细胞的细胞壁实际上能够提升TIRF的可用性，并扩大可观测结构的范围4-8。因此，对于许多体积小、单细胞的微生物而言，TIRF可直接用于研究多种细胞过程，而这些微生物通常具备强大的遗传操作技术。这使得我们能够在活细胞中开展in vivo 生物化学实验，直接评估蛋白质相互作用和活性的动力学过程。
本文介绍了获取酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）细胞高质量全内反射荧光（TIRF）图像所需的各个步骤。我们指出了可能影响细胞中荧光探针TIRF成像效果的多种问题，并通过多个应用实例展示了实验流程。最后，我们演示了如何利用成熟的图像恢复技术进一步提升TIRF图像质量。

全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种强大的技术，可用于高对比度和高时间分辨率地观察靠近细胞表面的结构。我们展示了如何利用TIRF研究细胞壁包被的细菌和真菌细胞皮层中的蛋白质动态。

全内反射荧光显微镜（TIRF）已成为一种强大的成像技术，用于研究体外及活细胞中荧光分子的空间-时间动力学1。

本实验的总体目标是获取具有细胞壁的微生物的高质量全内反射、荧光或TURF图像。首先需要准备盖玻片和细胞，然后精确调整显微镜系统，以获得最佳的图像质量。接下来，选择正确的事件、角度和成像条件以采集图像或视频。最后一步是对所获得的图像进行成像后处理。最终，利用草坪显微技术研究蛋白质在细胞皮层的定位动态。与传统的或共聚焦显微镜等常规金属技术相比，该技术的主要优势在于其显微成像的对比度非常高，能够实现快速成像并使用低光照条件。因此，该方法有助于回答膜研究领域中的关键科学问题，例如膜蛋白侧向分隔的机制，或膜蛋白的流动性问题。用于全内反射显微镜的盖玻片在使用前应清除灰尘颗粒。由于草坪对脏盖玻片上灰尘产生的背景信号敏感，因此在开始盖玻片清洗程序前，需要使用背景较低的洁净盖玻片。用镊子将盖玻片放入带盖的陶瓷 holder 中。接着，用一个玻璃容器装入一摩尔的氢氧化钠。该氢氧化钠可多次重复使用。将装有盖玻片的陶瓷架放入氢氧化钠中，并在缓慢持续旋转条件下孵育盖玻片两小时。孵育时间不得超过八小时，因为这将导致两小时后盖玻片变得不透明。在缓慢连续旋转下，用蒸馏水清洗盖玻片，每次五分钟，共清洗两次。将清洁后的盖玻片存放在盛有100%乙醇的陶瓷架中。为进行菌苔显微镜观察，将枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）细胞用适当的生长培养基稀释至OD600为0.01至0.05，总体积为五毫升，并培养至对数生长期。在合成培养基中制备1.25%琼脂糖：将琼脂糖粉末置于1.5毫升塑料管中，于95摄氏度溶解，随后置于72摄氏度加热块中保存。在载玻片中央加入一小滴 aros，再用另一张载玻片在至少两分钟后将 aros 压成扁平状，然后小心地将两张载玻片分开。取 500 µL 枯草芽孢杆菌（bacillus subtlest）细胞，在微型离心机中以 12,000 RPM 离心一分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 50 µL 培养基中。向凹孔载物台中央加入 2 至 4 微升细胞。接着，用镊子从盛有乙醇的容器中取出一块已清洁的盖玻片，并用加压空气吹干。小心地将盖玻片放置在样品上。在显微观察前，让细胞静置至少两分钟。对于长期成像，用加热的凡士林、羊毛脂和石蜡混合物或Val app密封盖玻片边缘。为进行草坪显微观察，需将预培养物稀释，并在适当的培养基中培养至少五小时。进入对数生长期后，从盛有乙醇的容器中取出一张盖玻片，用移液管吹散的加压空气将其吹干。取5 µL凝集素Con A或Con A溶液滴加到盖玻片上，再用加压空气吹干。Con A可结合酵母细胞壁中的碳水化合物，从而固定酵母细胞。接下来，将 4.5 µL 酵母细胞悬液转移至凹面载玻片的一侧，该载玻片为经过涂层处理的盖玻片。将盖玻片的样品面向下，从一侧边缘开始小心地放置在显微镜载玻片上，并让液体缓慢滴落。这样可避免产生气泡。在显微成像前，让细胞静置至少两分钟，然后用凡士林封固盖玻片边缘以进行长期成像。本视频中展示的所有实验均在一个定制的透射光显微成像系统上完成，该系统基于全自动 IMEX 显微镜平台，并配备 Olympus 100 倍、1.45 数值孔径（NA）的物镜。所使用的光源为 75 毫瓦的半导体泵浦固体（DPSS）激光器，波长分别为 488 纳米和 561 纳米。草坪角度与荧光。通过两个检流计可即时调节光漂白后的恢复或frat位置。第三个检流计用于在落射光、荧光、frap和turf之间切换。通过实时采集软件直接控制的检流计，可对草坪图像中追踪的对象进行简单的定位动力学测量。这些图像由 EM CCD 相机配合相机前部的 2 倍放大镜采集。采集过程同样由实时采集软件控制。在使用激光器之前，需佩戴激光防护眼镜，将激光器在草坪模式下投射到天花板上，并校准零度位置，使激光处于一条直线。为实现最佳效果，通过优化调节将激光光斑聚焦至最小尺寸，此时激光轮廓应形成一个边界清晰、大致呈圆形的光斑。每次实验前均需进行校准。为获得最优图像质量， turf 显微镜的准直调节对该实验的成功至关重要。为了获得最佳的图像质量，必须仔细调整图像采集的入射光位置、角度和参数。开始图像采集时，使用明场照明确定细胞的位置。红光LED尤其适用，因为其不会引起显著的光损伤。切换至激光照明，并选择合适的激光器和滤光片组合以激发目标荧光染料，确保光束入射角为亚临界角。否则将无法检测到GFP融合蛋白产生的信号。找到细胞的顶部区域，即朝向盖玻片一侧的细胞表面。逐渐增大激光束的入射角，直至信号消失，然后缓慢减小角度，直到细胞表面荧光重新出现。再次调节Z轴焦距，以获得细胞表面的最佳成像位置。可接受的入射角应不会在细胞边缘产生模糊光晕，酵母蛋白的此示例即展示了这一情况。从左上到右下，入射角逐渐减小，对PMA上的GFP进行成像。图像显示在临界角处信号突然消失，并且结构信息以及信噪比逐渐降低。调节激光强度和相机增益以最大化动态范围。通常，E-M-C-C-D相机最适合在高信噪比条件下检测极低信号。表面显微镜对微小高度非常敏感。盖玻片的微小差异会导致仅有少数几个细胞能够同时成像。这幅荧光微珠浓悬浮液的图像就是一个视野不均匀的例子，其中只有部分视野处于焦点范围内。因此，对于较小的细胞，采集区域通常可以缩小至包含目标对象的子区域。在双色草坪实验中，必须尽量减少R-F-P-G-F-P组合的荧光染料串色。由于RFP可被488纳米光微弱激发，应使用独立的发射滤光片。为避免串色和实现双色成像，典型的实验流程如上所示。在使用不同的滤光片组分别对细胞成像后，需利用荧光微球对图像进行拆分与校准，然后再进行合并。在分析过程中，影响图像质量的一个关键参数是激光的准直以及物镜的清洁。在完成激光校准并聚焦至用于成像的Z轴位置后，取出样品，并将物镜上的所有镜油清理干净。残留的油污会导致激光发生衍射，并在光束轮廓中产生散斑。草坪显微技术可用于观察细菌细胞中肌动蛋白同源物和细胞壁酶的分布情况。在此代表性结果中，表达肌动蛋白同源物 MreB 或转肽酶 PBP2 的绿色荧光蛋白融合蛋白的枯草芽孢杆菌细胞，分别通过草坪显微和常规落射荧光显微技术进行成像。此处的图像代表了时间序列的平均投影，用以指示运动性 MBL 菌斑所覆盖的区域，该菌斑通过不同成像模式进行监测。叠加图像中的蓝色轮廓表示从明场图像中观察到的细胞边界。每周表达的转肽酶 PBPH 定位于皮层斑块，这些斑块通过落射荧光难以观察，但可通过 TURF 清晰分辨。在箭头所示的隔膜处，P-B-P-H-G-F-P 信号的穿透性降低最为明显：在落射荧光中呈现为线条状，而在 TURF 中则呈现为点状。下一组图像展示了 TOR 复合物组分 Bit61 在酿酒酵母（Saccharomyces visi）中落射荧光与 TURF 照明的对比情况。该蛋白表达较弱，仅形成少量皮层斑块，每斑块中仅有少数几个蛋白拷贝。在落射荧光成像中，仅有少数斑块能从强烈的背景信号中显现；而在TURF成像中，斑块的信噪比非常高，可清晰观察。通过多种图像处理步骤，例如减去高斯模糊或中值模糊图像，可进一步提升图像对比度；而局部背景扣除则可去除噪声并增强高亮度结构的清晰度。这通常会以丢失精细结构和过度放大高强度区域为代价。如箭头所示，更优的方法是二维去卷积，可使用免费或商业软件包完成。去卷积后对比度的提升通过这段 GFP RAs two 的延时电影得以展示，该影片交替显示了原始图像和去卷积后的图像。由于GFP RAs two是一种快速移动的蛋白质，快速采集时间对于解析其动态行为至关重要。图像处理在共定位分析中尤为重要，这一点在此处酵母蛋白FET3G FP和PMA1 RFP的时间推移双色电影中得到了说明。前 10 帧为原始图像，其余帧为去模糊处理后的图像。为了实现有效分析，最大限度地增强对比度并锐化模糊的原始图像是至关重要的。Turf 和 frap 提供了一种强大的组合方法，可用于研究皮层蛋白的动力学行为。利用该技术对表达 G-F-P-M-B-L 的 B 细微细胞进行分析，排除了“踏车”机制作为含 MBL 斑块运动的可能解释。移动区域的 chm 图及其沿虚线所示 chm 图的强度分布，以类似于酵母细胞质膜 turf frap 的方式展示。TPAs PMA 1 揭示了酵母细胞质膜蛋白的缓慢重排现象，这些蛋白在细胞表面发育完成后分布成网络状结构域。该技术为细菌细胞生物学领域研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）细胞壁合成机制的研究奠定了基础。观看本视频后，您应能充分理解如何获取酵母和细菌等微生物的皮层蛋白动态特性研究中所需的菌落图像，以及该技术在研究皮层蛋白动态特性方面的应用。

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生物工程

皮层组织和动态可视化的微生物，利用全内反射荧光显微镜

本文展示了在活体细菌细胞上进行单分子荧光显微镜观察的实验方案，以实现对功能性分子复合物的检测、追踪和定量分析。...

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本视频介绍了TIRF技术，这是一种基于全内反射显微镜的方法，用于观察肌动蛋白和微管聚合的动态过程。该方法能够实现对肌动蛋白与微管偶联动态的高分辨率实时成像，对于理解细胞间相互作用至关重要。...

利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

来源：Daniele, F., 等 利用全内反射荧光显微镜和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动力学：细胞成像与数据分析。J. Vis. Exp.

使用全内反射荧光显微镜进行细胞成像

来源：Winkle, C. C., et al．利用联合方法定义质膜递送在轴突分支和神经元形态发生中的作用．J. Vis. Exp.

全内反射荧光显微镜用于胞吐事件的可视化

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基于结构化照明显微镜数据的时空图像相关光谱法量化T细胞中的皮层肌动蛋白流

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利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

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同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

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可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

学习使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层蛋白质动态定位的方法。该技术适用于细菌和真菌细胞，可实现高对比度、高时间分辨率的活细胞成像，为研究膜蛋白动态行为提供重要工具。

使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层结构与动态

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