皮层组织和动态可视化的微生物，利用全内反射荧光显微镜
May 1st, 2012
全内反射荧光显微镜（TIRF）是一个功能强大的方法来观察结构在细胞表面的高对比度和时间分辨率。我们展示的TIRF如何可受聘在皮层细胞壁封闭的细菌和真菌细胞的蛋白质动力学研究。
该程序的总体目标是获得承载细胞壁的微生物的高质量、全内反射、荧光或草皮图像。这是通过首先准备盖玻片和细胞来完成的。第二步是精确对齐显微镜设置以获得最佳图像质量。
接下来，选择正确的事件、角度和成像条件来获取图像或动态影像。最后一步是对采集的图像进行成像后处理。最终，草皮显微镜用于研究细胞皮层蛋白质定位的动力学。
与超越传统或共聚焦显微镜等金属相比，这种技术的主要优点是 图像对比度 显微镜 它非常高，允许快速时间和低光。因此，该方法可以帮助回答膜研究领域的关键问题，例如横向蛋白质分离的机制或膜蛋白的迁移性。使用前应清除草坪显微镜检查的盖玻片上的灰尘颗粒。
由于草皮对脏盖玻片上灰尘产生的背景信号很敏感。需要一张背景较少的清洁盖玻片才能开始清洁盖玻片的程序。使用镊子将盖玻片放入带盖的陶瓷支架中。
接下来，在玻璃容器中填充一摩尔氢氧化钠。这种氢氧化钠可以多次重复使用。将装有盖玻片的陶瓷支架放入氢氧化钠中，并在缓慢连续旋转下将盖玻片孵育两小时。
孵育时间不要超过八小时，因为这会在两小时后产生不透明的盖玻片，用蒸馏水清洗盖玻片两次，每次缓慢连续旋转五分钟，将清洁后的盖玻片存放在覆盖有 100% 乙醇的陶瓷支架中。为了制备用于草坪显微镜检查的芽孢杆菌最细微的细胞，在 5 毫升适当的生长培养基中稀释至 0.01 至 0.05 的 OD 600，然后生长至指数期。在合成培养基中制备 1.25%aros，将 aros 粉末溶解在 1.5 摄氏度的 95 毫升塑料管中，然后储存在 72 摄氏度的加热块中。
在载玻片中间加入一小滴 aros，用第二滴载玻片，至少两分钟后将 aros 压入平坦的垫子中，小心地将载玻片分开。在微量离心机中以 12， 000 RPM 的速度离心 500 μL 芽孢杆菌最细微的细胞，持续 1 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 50 μL 培养基中。
在 aros pad 的中心添加 2 到 4 微升细胞。接下来，使用镊子从装满乙醇的容器中取出干净的盖玻片，并用加压空气干燥。小心地将盖玻片放在样品上。
在显微镜检查前让细胞静置至少两分钟。对于长期成像，用凡士林、羊毛脂和石蜡的加热混合物或 Val 应用程序密封盖玻片的边缘。为了制备用于草坪显微镜检查的视觉酵母细胞，稀释预培养物并在适当的培养基中生长至少 5 小时。
至指数期，从装满乙醇的容器中取出盖玻片，然后用加压空气和移液管扩散将其干燥。5 微升，盖子上有 conval 和 a 或 con a 溶液。用加压空气滑落并干燥 con A 与酵母细胞壁的碳水化合物结合并固定酵母细胞。
接下来，将 4.5 μL 酵母细胞悬液转移到 con 的一侧，即涂层盖玻片。小心地将盖玻片样品面朝下放在显微镜载玻片上，从一个边缘开始，慢慢滴落。这将避免气泡的形成。
在显微镜检查之前让细胞静置至少两分钟，用 val 应用程序密封盖玻片的边缘以进行长期成像。本视频中展示的所有实验均在定制的草坪设置上进行，该设置基于带有奥林巴斯 100 x 1.45 NA 物镜的全自动 IMEX 支架。使用的光源是 75 毫瓦二极管、488 纳米和 561 纳米的泵浦固态或 DPSS 激光器。
草皮角度和荧光。光漂白后或兄弟会位置后的恢复可以通过两个电流计即时调整。第三个检流计用于在 epi、fluorescence、frap 和 turf 之间切换。
检流计由实时采集软件直接控制，允许使用 EM CCD 相机和相机前的 2 倍放大镜收集草坪图像中跟踪的物体的定位动力学。采集也由实时采集软件控制。在使用激光器之前，戴上激光护目镜，以草皮模式将激光器投射到天花板上，并校准零度位置，使激光器位于一条直线上。
物镜在最佳调整后将激光光斑聚焦到最小尺寸，激光轮廓应形成一个大致圆形的清晰光斑。在每次会话之前执行校准。为了获得最佳图像质量，草坪显微镜的对准对于该程序的成功至关重要。
必须仔细调整图像采集的正确入射角、角度和参数，以获得最佳图像质量。要开始图像采集，请使用明场照明确定细胞的位置。红色 LED 特别好，因为它们不会引起明显的光损伤。
切换到激光照明并选择合适的激光器和滤光片组合来激发所选的荧光团，确保草皮角度为亚临界角度。否则，将无法检测到由 GFP 融合蛋白产生的信号。找到单元格的顶部，即单元格面向盖玻片的一侧。
逐渐增加激光束的入射角，直到信号消失，然后慢慢减小角度，直到细胞表面的荧光再次出现。再次调整 Z 焦距，使其在曲面上处于最佳位置。可接受的草皮角度不会在细胞边缘产生模糊的光晕，如酵母蛋白示例所示。
PMA one GFP 成像，入射角从左上到右下减小。图像显示临界角处信号突然丢失，结构信息和信噪比逐渐降低，调整激光强度和相机增益以最大化动态范围。通常，E-M-C-C-D 相机最适合在高信噪比下检测非常低的信号。
草坪显微镜对小高度非常敏感。盖玻片的差异导致只有少数细胞可以同时成像。这张荧光珠密集悬浮液的图像是视野不均匀的一个例子，其中只有部分视野是聚焦的。
因此，对于小单元，采集区域通常可以简化为包含所选对象的子区域。对于双色草坪实验，必须尽量减少 R-F-P-G-F-P 对的荧光团渗漏。使用单独的发射滤光片，因为 RFP 每周由 488 纳米光激发。
此处显示了避免渗漏和双色成像的典型工作流程。使用单独的滤光片组对细胞进行成像后，使用荧光珠对图像进行下放和对齐，然后进行合并 对于分析，影响图像质量的一个关键参数是激光对准和干净的物镜。对准激光器并聚焦于用于草坪成像的 Z 位置后，取出样品并清洁物镜上的所有油。
残油会导致激光衍射和光束轮廓中出现斑点。草坪显微镜可用于可视化细菌细胞中肌动蛋白同源物和细胞壁酶的分布。在这个代表性结果中，表达肌动蛋白 hoog MBL 或转肽酶 PBPH 的 GFP 融合的芽孢杆菌微妙细胞通过草坪和规则落射荧光成像。
此处的图像表示时间序列的平均投影，以指示 motile 覆盖的区域。使用不同的成像模式监控 MBL 补丁。叠加图像中的蓝色轮廓表示从明场图像图像中可视化的细胞边界。
每周表达的转肽酶 PBPH 定位于皮质斑块，这些斑块几乎无法通过 epi 荧光看到，但可以通过草皮清楚地区分。对于箭头指示的 SEPTA 处的 P-B-P-H-G-F-P 信号，可以最好地观察到穿透力降低，箭头在落射荧光中显示为线条，但在草坪中显示为点。下一组图像显示了 TOR 复合成分（视觉酵母中第 61 位）的落射荧光和草坪照明之间的比较。
这种蛋白质每周表达一次，并形成小的皮质斑块，每个斑块只有几个蛋白质拷贝。在落射荧光中，在强背景上方只能看到少数斑块，而在草坪中可以以非常好的信噪比对斑块进行成像。可以通过各种图像处理步骤进一步提高图像对比度，例如减去高斯或中位数模糊图像，而局部背景减去可去除噪声并锐化高强度结构。
这通常是以精细结构的损失和高强度区域的夸大放大为代价的。如箭头所示，一个更好的过程是 2D 反卷积，可以使用免费或市售的软件包来执行。这个 GFP RAs 2 的延时电影说明了反卷积后对比度的增加，它显示了交替的原始和下放的草皮图像。
由于 GFP RAs 2 是一种快速移动的蛋白质，因此快速采集时间很重要。它的动态行为。图像处理对于共定位分析尤为重要，如酵母蛋白、FET 3G FP 和 PMA one RFP 的延时双色电影所示。
前 10 帧表示原始图像，其余帧是下放图像 为了使分析成为可能，最大化对比度并锐化模糊的原始图像至关重要。Turf 和 frap 为研究皮质蛋白的动力学提供了强大的组合。在表达 G-F-P-M-B-L 的 B 最细微细胞中使用这种技术排除了跑步作为观察到的含有 MBL 的斑块运动的机制。
由虚线指示的移动斑块的 chm 图和沿 chm 图的强度分布以酵母质膜的类似方式显示。A TPAs PMA 一揭示了酵母质膜蛋白的缓慢重排，其发育后分布成覆盖整个细胞表面的网络状结构域。该技术为细菌细胞生物学领域的研究铺平了道路，以探索枯草杆菌细胞壁合成的机制。
观看此视频后，您应该对如何获取酵母和细菌等微生物的草坪图像以及该技术如何帮助研究皮质蛋白的动态特性有很好的了解。
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概述
全内反射荧光 (TIRF) 显微镜用于以高对比度和时间分辨率观察细胞表面附近的结构。这种技术特别适用于研究细胞壁包裹微生物中的蛋白质动力学。
关键研究组成部分
科学领域
- 显微镜学
- 细胞生物学
- 蛋白质动力学
背景
- TIRF 显微镜能够对细胞结构进行高分辨率成像。
- 它特别适用于观察细胞皮层蛋白质的动力学。
- 这种技术适用于细菌和真菌细胞。
- 显微镜的准备和校准对于获得最佳成像至关重要。
研究目的
- 获取具有细胞壁的微生物的高质量 TIRF 图像。
- 研究细胞皮层蛋白质的定位和动力学。
- 展示 TIRF 显微镜在生物学研究中的有效性。
使用的方法
- 准备用于成像的盖玻片和细胞。
- 精确校准显微镜设置。
- 选择适当的入射角和成像条件。
- 对获取的图像进行成像后处理。
主要结果
- 成功获取高质量的 TIRF 图像。
- 观察细胞皮层蛋白质定位动力学。
- 展示 TIRF 显微镜在研究微生物方面的能力。
- 对细胞壁包裹细胞中蛋白质行为的洞察。
结论
- TIRF 显微镜是研究蛋白质动力学的宝贵工具。
- 它提供了对细胞过程的高分辨率洞察。
- 这种技术可以增强我们对微生物细胞生物学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
TIRF microscopy enables high-contrast, real-time visualization of protein dynamics at the cell cortex in microorganisms, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By providing quantitative spatial and temporal data on membrane-associated processes, it enhances target validation and predictive confidence in antimicrobial and antifungal research. This capability is particularly valuable for studying cell wall synthesis, secretion systems, and signal transduction pathways in yeast and bacterial models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of protein localization and dynamics at the cell surface, clarifying mechanisms of membrane protein segregation and mobility.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of therapeutic targets involved in cell wall synthesis and membrane organization with high signal-to-noise ratio.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in target function by visualizing cortical protein behavior in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts suitable for assessing compound effects on protein localization and dynamics.
- Operational Value: Enables reproducible, high-throughput compatible imaging of microbial cells due to rapid acquisition and low phototoxicity.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of standardized, wall-bearing microorganism samples for consistent imaging performance.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical work by validating targets in disease-relevant microbial systems with genetic tractability.
- Operational Value: Supports longitudinal studies of protein dynamics critical for understanding resistance mechanisms and virulence.
- Translational Continuity: Enables correlation of molecular observations with phenotypic outcomes in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
TIRF microscopy fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for antimicrobial and antifungal programs where cortical protein dynamics are central to mechanism of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing protein dynamics at the cell membrane with minimal out-of-focus interference.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on protein localization and mobility, enabling reliable compound screening in microbial systems.
- Analytics: Provides kinetic and spatial measurements (e.g., FRAP, co-localization) that allow comparison of protein behavior across conditions and genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects molecular dynamics to preclinical relevance by enabling study of targets in living, wall-containing microorganisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for multiple projects studying membrane-associated targets in yeast and bacteria.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in membrane protein function and localization.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging with high signal-to-noise ratio and minimal photobleaching, supporting consistent data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct visual evidence of target engagement and mechanism in live cells.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial and antifungal candidates based on mechanistic de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy, sample preparation, and laser safety protocols for working with microorganisms.
- Needs a TIRF-capable microscope with stable laser alignment, EM-CCD camera, and environmental control for long-term imaging.
- Demands standardization of cover slip cleaning, cell immobilization, and sealing procedures across teams to ensure reproducibility.
- Requires adaptation for different microbial systems (yeast vs. bacteria) due to variations in cell wall composition and size.
- Limited by shallow penetration depth (~100-200 nm), restricting use to cortical and surface-associated processes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Sample Preparation: Preparing Cover Slips
2:27
Sample Preparation: Preparing Bacillus subtilis Cells
3:58
Sample Preparation: Preparing Saccharomyces cerevisiae Cells
5:03
Image Acquisition
9:44
Results: Visualization of Cortex Organization and Dynamics
13:41
Conclusion
