在小鼠心脏的动作电位和钙瞬变的光学测绘
2011年9月13日
本文详细解剖程序，工具设置，并在光学测绘跨膜电位（VM）和细胞内钙瞬变（CAT），在隔离的Langendorff完整的实验条件下灌注小鼠心脏。
该程序的总体目标是同时光学映射完整分离的 LOR 灌注小鼠心脏中的跨膜电位和细胞内钙瞬变。这是通过首先切除完整的小鼠心脏，然后插管主动脉并开始 LOR 灌注来实现的。下一步是通过在耦合器上加载激发收缩，然后将心脏固定在灌注室来固定心脏。
最后的步骤是加载光学染料并准备减少实验过程中的运动伪影。光学图像是通过用我的 cam Ultima LC Moss 相机收集从心脏发出的光来获得的。嘿，我叫 di。
我是华盛顿大学的一名研究生。与现有方法（如微电极）相比，该技术的主要优点是光学映射可以在心脏的整个表面实现更高的空间分辨率。大家好，我是 Matt Sulkin。
我是华盛顿大学的一名研究生。这种方法如果作正确，可以帮助回答心脏电生理学中的许多问题，例如心律失常发生的基础。首先配置一个蠕动泵，以每分钟 40 毫升的速度循环溶液。
然后将第二个蠕动泵设置为每分钟 80 毫升。该泵将 Perfuse 8 返回储液罐和充氧储液罐。打开泵，用 1 升 70% 乙醇清洗系统 30 分钟，然后进行再循环。
然后用两升去离子水洗涤，不要再循环。排空水后，循环 2 升 Tyro 溶液，并通过 5 微米过滤器。用水套将灌注加热 8 至 37 摄氏度，然后循环器将含氧气体注入溶液中。
调整气体鼓泡速率，将 pH 值保持在 7.35 加负 0.05。在实验过程中监测 pH 值和温度。双光学测绘仪由两台高速 C moss 相机组成，可以每秒 100 帧的速度捕获 100 x 3000 像素的图像。
将带通滤光片连接到钙成像相机上，并将长通滤光片连接到双相机支架上的电压成像相机上。安装双镜和透镜，使来自心脏的发射光通过透镜聚焦到镜子上。此外，将两台相机连接到支架上并排列它们，使其彼此垂直。
接下来，设置激发灯。光由卤素灯产生，并通过柔性光导引导。使光线通过热滤光片、限制曝光的快门和激发带通滤光片。
最后，通过将银和氯化银电极安装在腔室中来准备它们。在仔细检查并调整放大器和滤波器的电平后，设置就可以开始了。在继续之前，使用氯胺酮和甲苯噻嗪与 100 单位肝素的混合物麻醉小鼠。
使用脚趾捏确保动物没有疼痛反射。在胸骨中部切开后，迅速切除心脏和周围组织。然后使用解剖显微镜快速识别主动脉，并在右锁骨下动脉下方的升主动脉上划清。
现在，使用四根黑色编织丝缝合线将一小段主动脉连接到定制的 21 号套管上，插管后复古大大灌注和超级融合心脏。使用 Tyro 溶液，调整流速，使主动脉压保持在 60 至 80 毫米之间。通过压力传感器测量的汞。
现在解剖并去除周围的肺、胸腺和脂肪组织。现在通过肺静脉将硅胶管插入左心室。将管子缝合到附近的结缔组织。
这个非常重要的步骤可以防止被困在左心室的灌注 8 充血和酸化，尤其是在抑制心室收缩之后。为防止 Perfuse 8 诱导的心脏运动，将心脏固定在门槛护罩涂层灌注室的底部，位于其顶点。此外，拉伸并固定右心耳和左心耳，以增加直立配置的心房表面积。
这将最大化录制表面积。要进行起搏刺激，请将定制的电极连接到心脏表面。为了减少运动伪影，请在溶液表面的心脏上固定一个小盖玻片。
通过将玻璃楔入几个引脚之间来执行此作。作为最后的准备工作，将激发光聚焦在心脏上并定位相机以获得光学图像，然后在加载模具的同时开始加载染料。持续监测心电图记录，以确保心脏的正常电功能。
首先将 BLEs 他汀类药物加热至室温。然后将半毫升 BLEs 他汀类药物混合到储液罐中的大量 8 中，并将剩余的 10 毫升 BLEs 他汀类药物稀释到 1 毫升 Tyros 溶液中。在接下来的 20 分钟内，通过套管附近的药物端口缓慢注射 BLEs 他汀
类药物。BLEs 他汀类药物将逐渐减少运动伪影。接下来，将 30 μL 电压敏感染料稀释到 1 mLtyro 溶液中，并在 5 到 7 分钟内将该混合物缓慢注入同一药物端口。然后再次制作相同的混合物。
这一次，额外添加了 30 微升钙指示剂。通过同一端口缓慢涂抹此混合物 5 到 10 分钟。注射钙指示剂后，再等待 5 到 10 分钟，让 BLEs 他汀类药物完全抑制运动，并让染料进入细胞，然后再进行实验。
这个心脏准备是做的。根据该方案，在心室起搏期间记录来自 S 1 S 1 刺激的心电图信号。动作电位和钙瞬时信号记录来自左侧心房和右侧心室。
箭头显示了从心室散射信号的位置，通过以 3 像素乘 3 像素的单位对来自摄像头的记录进行分档，可以从阵列数据的数据中显示钙瞬变和动作电位的阵列。可以构建一个显示动作电位传导的图。横轴和纵轴上三个连续点的数据显示动作电位在心室表面传播的振幅变化。
同样，可以构建一个显示动作电位和钙瞬时持续时间的图形。这将在左侧显示一个控制条件。向心脏注射异丙肾上腺素，这显然缩短了钙瞬变和动作电位的持续时间。
一旦掌握，按照此程序，该技术可以在两到三个小时内完成。可以执行其他方法，如起搏方案，以回答其他问题，例如有关 AV 结不应期的问题。
概述
本研究提出了一种在Langendorff灌流的离体小鼠心脏中进行跨膜电位和细胞内钙瞬变的光学映射的详细程序。该方法相比传统技术具有更高的空间分辨率，为心脏电生理学提供了见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏电生理学
- 光学映射技术
- 小鼠心脏模型
背景
- 光学映射允许同时测量Vm和CaT。
- 传统方法如微电极在空间分辨率方面有局限性。
- 该技术可以帮助研究心律失常的发生。
- Langendorff灌流在实验中维持心脏的活力。
研究目的
- 开发一种可靠的小鼠心脏光学映射方法。
- 提高对心脏电活动的理解。
- 促进对心律失常机制的研究。
使用的方法
- 切除并插管小鼠心脏以进行灌流。
- 使用高速摄像机捕捉光学图像。
- 加载光学染料以可视化跨膜电位和钙瞬变。
- 在实验过程中监测pH和温度。
主要结果
- 在离体心脏中成功进行Vm和CaT的光学映射。
- 展示了染料应用后减少了运动伪影。
- 有效记录了动作电位和钙瞬变信号。
- 验证了该方法可用于未来的电生理学研究。
结论
- 光学映射技术提供了高空间分辨率。
- 该方法可以推进心脏电生理学研究。
- 未来的研究可以利用这种技术探索心律失常的发生机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
Optical mapping of transmembrane potential and calcium transients in mouse hearts provides high-resolution spatial and temporal data critical for mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. This approach enables quantitative assessment of electrophysiological phenotypes, supporting predictive confidence in preclinical models of arrhythmia and heart failure. By capturing concurrent Vm and CaT dynamics, the method bridges discovery biology with translational biomarker alignment in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping action potential and calcium transient dynamics across cardiac tissue.
- Operational Value: Supports biological de-risking through simultaneous visualization of excitation-contraction coupling parameters.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking molecular perturbations to functional electrophysiological outputs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation via standardized optical signal acquisition.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible measurements of action potential duration, conduction velocity, and calcium transient amplitude.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple cardiac disease models through consistent Langendorff perfusion and dye loading protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studies of heart failure, arrhythmias, and metabolic disease using genetically engineered mouse models.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical validation through preserved tissue architecture and physiological perfusion.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying electrophysiological liability early in the discovery pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, enabling iterative refinement of cardiovascular candidates based on functional electrophysiological readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by correlating genetic or pharmacological interventions with spatial electrophysiological patterns.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs essential for reliable compound screening in ion channel and modulator discovery.
- Analytics: Provides spatiotemporal measurements of Vm and CaT that enable comparative analysis across experimental conditions and genotypes.
- Translational Research: Maintains physiological relevance through Langendorff perfusion, supporting extrapolation to intact organ responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological phenotyping capability applicable across multiple cardiovascular projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined perfusion, dye loading, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying electrophysiological liabilities prior to significant investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative action potential and calcium transient profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac dissection, Langendorff perfusion, and optical imaging systems.
- Dependent on high-speed CMOS cameras, excitation light sources, and optical filter sets for dual-channel detection.
- Necessitates cross-team standardization of dye loading protocols and motion artifact reduction strategies.
- Involves adaptation considerations when translating to different mouse strains or disease models with altered cardiac physiology.
- Includes practical limitations such as dye toxicity, photobleaching, and the need for meticulous motion suppression to maintain data quality.
