Name: 在小鼠心脏的动作电位和钙瞬变的光学测绘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学习小鼠心脏光学测绘技术，用于同步记录动作电位和钙瞬变信号。该方法采用Langendorff灌流和高速成像，为心律失常机制研究提供高分辨率电生理数据。

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NIH 基金项目 R01 HL085369

1. 储备液的高级制备
<ol>
	<li>提前用去离子水配制两份 Tyrode's 溶液（16x）储备液，并于 4°C:
	<ol class="lalpha">
		<li>储备液 I（119.872 g/L NaCl，3.056 g/L CaCl₂）2 (2H2O）、5.6 g/L KCl、2.6274 g/L NaH2PO4，3.408 g/L MgCl2 (6H2O), (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ));</li>
		<li>储备液 II（26.88 g/L NaHCO₃，Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制荧光染料的储备液。为避免反复冻融，我们保存 30 μl 两种染料的等分试样置于 -20°C，这足够进行一次实验：
	<ol class="lalpha">
		<li>电压敏感性染料 RH237（Invitrogen，Carlsbad，CA）储备液，1.25 mg/mL 的二甲基亚砜（DMSO，Sigma，St. Louis，MO）溶液；</li>
		<li>钙指示剂 Rhod-2AM（Invitrogen，Carlsbad，CA）储存液，1 mg/mL 的 DMSO 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提前配制兴奋-收缩耦联抑制剂blebbistatin储存液（Tocris Bioscience，美国密苏里州圣路易斯，2 mg/mL DMSO溶液），并将溶解后的blebbistatin储存于 4°C.</li>
</ol>
2. 准备灌注溶液和实验装置7
<ol start="4">
	<li>新鲜配制 2 L 台氏液（含 128.2 mM NaCl、1.3 mM CaCl2 (2H2O)、4.7 mM KCl、1.05 mM MgCl2 (6H2O)、1.19 mM NaH2PO4、20 mM NaHCO3、11.1 mM D-葡萄糖的去离子水溶液，pH = 7.35 ± 0.05）。若使用储备液配制 2 L 台氏液（足够一次实验使用），则取 1750 mL 去离子水，加入 125 mL 储备液 I、125 mL 储备液 II 和 4 g 葡萄糖，混匀。</li>
	<li>开启灌流系统的两台泵。将用于逆向灌流的蠕动泵（Peri-Star，WPI，Sarasota，USA）设定为 40 mL/min；将用于表面灌流并将灌流液返回储存槽的另一台蠕动泵（Cole-Parmer Masterflex L/S 蠕动泵，Cole-Parmer Instrument Company，Vernon Hills，Illinois）设定为 80 mL/min。</li>
	<li>用 70% 乙醇清洗灌流系统 30 分钟，随后用 2 L 去离子水冲洗。</li>
	<li>当灌流室内的去离子水完全排空后，开始循环台氏液，并使其通过一个 5-μm 滤器（Millipore，Billerica，MA，USA）。使用水浴夹套和循环器（ThermoNESLAB EX7，Newtown，USA）将灌流液加热至 +37°C，并通过向溶液中通入 O2/CO2（95% / 5%）混合气体进行氧合。使用 pH 计（Oakton Instruments，Vernon Hills，IL）监测溶液 pH，并调节 O2/CO2 气体通入速率，使 pH 维持在 7.35 ± 0.05。实验过程中持续监测 pH 和温度。</li>
	<li>双通道光学标测装置由两台 MiCAM Ultima-L CMOS 相机（SciMedia，Costa Mesa，CA）组成，具有高空间分辨率（100×100 像素，每像素 230±20 μm）和高时间分辨率（1,000–3,000 帧/秒）。在指定用于钙成像的相机前安装带通滤光片（590±15 nm，Thorlabs，Newton，NJ）；而在指定用于电压成像的相机前则需放置长通滤光片（>700 nm，Thorlabs，Newton，NJ）。两台相机通过一个含有二向色镜（635 nm 截止波长，Omega Optical，Brattleboro，VT）的支架相互垂直排列。双相机支架正下方装有一枚镜头（Nikon NIKKOR 55 mm 1:1.4 235052），用于将来自心脏的发射光聚焦至二向色镜。工作距离约为 3 cm。 
激发光由卤素灯（Newport Oriel Instruments，Stratford，CT；SciMedia，Costa Mesa，CA）产生，依次通过热滤光片、快门和带通滤光片（520±45 nm）。柔性导光管将经带通滤光后的激发光引导至标本，同时使用快门控制仅在图像采集期间对标本进行光照，以避免荧光染料发生光漂白。</li>
	<li>提前准备好用于起搏和信号记录的 Ag/AgCl2 电极，并在放置心脏前将其安装至灌流室中。确保放大器和滤波器已调节至适当水平。</li>
</ol>
3. 收集小鼠心脏，插管并建立兰格多夫灌流
<ol start="10">
	<li>通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮/赛拉嗪麻醉（氯胺酮，80 mg/kg 体重；赛拉嗪，10 mg/kg 体重）和肝素（100 单位），并确认无痛反射以确保适当的麻醉深度。</li>
	<li>行胸骨中线切口后，迅速取出心脏，并在充氧（95% O2，5% CO2）、恒温（37±1°C）的台氏液中清洗。</li>
	<li>在解剖显微镜下快速识别主动脉，并在右锁骨下动脉远端对升主动脉进行整齐切割。将一小段主动脉连接至自制的21号带喇叭口尖端的套管。使用4-0黑色编织丝线（Surgical Specialties Corporation, Reading, PA）将心脏固定在套管上。插管后，以台氏液逆行灌注并同时进行表面灌流。调节逆行灌注速度至2–5 mL/min，使主动脉压力维持在60–80 mmHg（压力传感器，World Precision Instruments Inc (WPI), Sarasota, USA；桥式放大器 TBM4M，WPI, Sarasota, USA）。</li>
	<li>心脏插管完成后，剥离并移除肺、胸腺及脂肪组织。</li>
	<li>将分离的心脏用针（Fine Science Tools）在心尖部固定于灌流室底部（Sylgard包被），以防止液流引起的心脏移动。同时将左右心耳拉直并用针（Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA）固定于灌流室底部，以提供最大的心房光学测量表面积。 
	非常重要！ 通过肺静脉将一根细硅胶管插入左心室，并用丝线将其固定于邻近结缔组织。此举可防止左心室内滞留灌流液积聚和酸化，尤其在使用兴奋-收缩去耦联剂抑制心室收缩后更为重要（见第4部分第19步）。</li>
	<li>将自制电极置于心脏表面，用于传递由Master-8（A.M.P Instruments Ltd, Jerusalem, Israel）或PowerLab 26T（AD Instruments, Sydney, Australia）产生的起搏刺激。</li>
	<li>在心脏上方的溶液表面固定一小块盖玻片，以减少溶液振动引起的心脏运动伪影。</li>
	<li>将激发光聚焦于心脏表面，并调节双相机装置与心脏之间的距离，以获得最高分辨率图像。</li>
	<li>关闭室内所有光源，开始使用PowerLab 26T进行电生理记录。</li>
</ol>
4. 加载电压和钙离子敏感性染料以及兴奋-收缩解偶联剂
<ol start="19">
	<li>将 0.6 mL 的 blebbistatin 预热。取 0.5 mL blebbistatin 与灌注液储液罐中的灌注液混合。将剩余的 0.1 mL blebbistatin 用 1 mL Tyrode 溶液稀释，并通过靠近套管的给药口缓慢注入（持续 20 分钟）。观察 blebbistatin 逐渐减少运动伪影的过程。</li>
	<li>将 30 μL 电压敏感性染料 RH237 原液用 1 mL Tyrode 溶液稀释，并通过与 blebbistatin 相同的注射口在 5–7 分钟内缓慢注入。</li>
	<li>将 30 μL 钙离子指示剂 Rhod-2 AM 与 Pluronic F127（Invitrogen, Carlsbad, CA，DMSO 中 20% 溶液）按 1:1 比例混合，随后用 1 mL Tyrode 溶液稀释，并通过同一注射口在 5–10 分钟内缓慢施加。</li>
	<li>等待 5–10 分钟，使 blebbistatin 和染料充分到达细胞膜和胞质。当运动完全被抑制后，继续后续实验步骤。</li>
	<li>在整个实验过程中持续监测心电图记录，以确保心脏电生理功能正常。</li>
	<li>使用 SciMedia 定制软件（SciMedia, Costa Mesa, CA）开始荧光信号记录。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
<img alt="用于荧光成像的光学显微镜装置，配备滤光片；用于分析细胞内 Ca²⁺ 水平。" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 灌流、电记录与光学标测的实验装置。 
EM=发射光；Lp=长通滤光片
<img alt="心电图研究、心脏刺激装置；包含心房、心室信号、电极、心电图示意图。" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 心室起搏期间记录的实验装置及信号示例。左侧：心电图信号由 Ag/AgCl2 圆盘电极采集（上图），并展示了一个 S1S1 刺激方案的示例（下图）。中间：Langendorff 灌流小鼠心脏装置。右侧：显示了来自心房（上图）和心室（下图）的代表性光学动作电位和钙瞬变信号。黄色箭头（上图）指向来自心室的荧光信号散射，该信号在心房记录中可见。 
LV=左心室；RV=右心室；LA=左心房；RA=右心房
<img alt="使用电极记录心脏信号；Vm 和 CaT 图形分析；电极设置、结果图表。" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 野生型小鼠心脏心室中 Vm 和 CaT 的代表性光学记录。A. 实验装置示意图，黑色圆点标记了均匀分布的记录位点，其光学记录结果见 (C)。B. 来自阵列中心位置（见 (C) 中方框区域）的 Vm 和 CaT 记录示例。C. 来自均匀分布位点阵列的 Vm（蓝色）和 CaT（红色）信号。信号按 3×3 像素进行合并处理。
<img alt="心脏激活时间与电压动态示意图；包含起搏、Vm、dV/dt 图形。" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 激活图与传导。A. 野生型小鼠心脏的激活图示例，白色箭头指示横向（T）和纵向（L）方向。B. 对应于 A 中三个点（T1、T2、T3；L1、L2、L3）的 Vm 信号（上图）和 dV/dt（下图）。
<img alt="在对照和异丙肾上腺素条件下APD80与CaD80的心脏图谱比较；动作电位，钙瞬变。" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 动作电位和钙瞬变持续时间分析。A. 显示了在对照条件下（左）和应用30 nM异丙肾上腺素后（右）心脏的动作电位在80%复极化时的持续时间（APD80）以及钙瞬变在80%舒张时的持续时间（CaD80）图谱。右侧心室中的黄/绿色表明异丙肾上腺素缩短了APD80和CaD80。B. 野生型小鼠心室（上）和心房（下）的APD80与CaD80典型记录示例。

<ol><li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+maps+of+intracellular+%5BCa2%2B%5Di+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts.</a> Circulation. 90, 1-1 (1994).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+repolarization+and+refractoriness+from+intact+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts.</a> Circulation. 90, 1469-1480 (1994).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Pruvot, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+cycling+versus+restitution+in+the+mechanism+of+repolarization+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans.</a> Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFast%2C+VG+%22Practical+methods+in+cardiovascular+research%22">Practical methods in cardiovascular research</a>. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).</li>
<li>Glukhov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. , (2009).</li>
<li>Baker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dispersion+of+repolarization+and+refractoriness+in+transgenic+mouse+hearts+promotes+reentrant+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia.</a> Circ Res. 86, 396-407 (2000).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+electrode+polarization+in+the+far+field%3A+implications+for+external+defibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).</li>
<li>Hammouda, M., Kinosita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coronary+circulation+in+the+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The coronary circulation in the isolated heart.</a> J Physiol. 61, 615-628 (1926).</li>
<li>Salama, G., Hwang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).</li>
<li>Lou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li>
<li>Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本实验中，我们通过添加一根细小的硅胶管对兰格多夫（Langendorff）灌流法进行了改进，这一改进在使用兴奋-收缩解偶联剂抑制心室收缩后尤为关键。该硅胶管用于防止灌流液淤积、灌流液酸化以及左心室缺血的发生。小鼠心脏对低温极为敏感；因此，心脏各部位的温度差异将导致动作电位时程出现人为差异。为此，在灌流腔室中引入了加热系统，以确保整个实验过程中温度恒定维持在37°C8。由于兰格多夫模型无法保留心脏的神经支配，因此在灌流液中需考虑添加神经递质，以研究生理性的交感和副交感张力9。除了逆行灌流外，对心脏进行表面灌流（superfusion）有助于维持适宜的环境参数，如pH值和温度。在本方法中，兰格多夫灌流的心脏被水平放置。也可采用垂直式兰格多夫灌流装置10，但这可能导致心脏力学特性出现轻微差异11。除CMOS相机外，也可使用其他检测器同时进行膜电位（Vm）和钙瞬变（CaT）的成像映射12。
使用高时空分辨率的CMOS相机可确保记录的准确性；然而，光学标测信号并非来自单个细胞。实际上，每个荧光信号均来自数百至数千个细胞，具体取决于光学放大倍数。由于心室荧光信号较强，可能因光散射而扭曲心房信号，因此需要谨慎解读光学记录的信号。小鼠心脏制备的另一局限性在于，由于心脏体积小导致表面曲率较大，从而引起信号失真和噪声13。传导速度的测量不仅可能受小鼠心脏曲率的影响，还可能受电极极性和虚拟电极的影响。为了准确获得传导速度、激活各向异性及复极化图谱，必须将相机精确聚焦于心脏表面。
该方法中，实时心电图记录可作为心脏电生理学光学研究的补充。本方案采用电压敏感性染料（RH237）和钙离子指示剂（Rhod-2AM），因其响应速度快、激发光谱相似且发射光谱不同3,7。除RH237和Rhod-2AM外，也可使用其他染料组合来测量Vm和CaT3。一种新型电压敏感性染料PGHI具有较大的斯托克斯位移（&gt;200 nm），由于PGHI与Rhod-2AM的发射波长分离更明显，可获得更佳的Vm和CaT信号14。未来的研究改进方向可能包括探索新型荧光探针、开发新型成像探测器以及改进图像处理软件。更高分辨率的成像以及用于三维光学标测的新型光学成像模式，也是光学标测技术未来的重要发展方向5。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>费舍尔科技</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>费舍尔科技</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>费舍尔科技</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>费舍尔科技</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>费舍尔科技</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔科技</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>费舍尔科技</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>拓可生物科技</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>英维特罗根</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>英维特罗根</td><td>R1244</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>英维特罗根</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML856/" target="_blank"&gt;PowerLab 26T &lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠心脏动作电位与钙瞬变的光学标测

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

小鼠心脏是心血管研究中常用的模型，因为该物种具有低成本的基因工程技术。利用多种跨膜电位（Vm）、钙瞬变（CaT）及其他参数的荧光探针，可方便地对小鼠心脏进行心血管生理表型分析。兴奋-收缩耦联的特征是动作电位与细胞内钙离子动态变化，因此，从心脏同一位置同步记录Vm和CaT至关重要1-4。对经Langendorff灌流的小鼠心脏进行同步光学标测，有望揭示心力衰竭、心律失常、代谢性疾病及其他心脏疾病的潜在机制。细胞水平的研究无法实现对大量位点的激活、传导速度、动作电位时程及其他参数的可视化，而光学标测技术则能很好地解决这一问题1,5,6。本文介绍了基于先进CMOS成像技术，在小鼠心脏上以高时空分辨率同步进行Vm和CaT光学标测的仪器配置与实验条件。该方法获得的稳定光学记录结果表明，对Langendorff灌流小鼠心脏进行同步光学标测是可行且可靠的。

本文详细介绍了在完整分离的Langendorff灌注小鼠心脏中进行跨膜电位（Vm）和细胞内钙瞬变（CaT）光学标测时的解剖操作、仪器设置及实验条件。

小鼠心脏是心血管研究的常用模型，因为该物种存在低成本的基因工程技术。

本实验的总体目标是对完整分离的经LOR灌注的小鼠心脏，同时进行跨膜电位和细胞内钙瞬变的光学标测。首先取出完整的小鼠心脏，随后将主动脉插管并开始LOR灌注。下一步是通过加载兴奋-收缩耦联剂使心脏固定，然后将心脏固定于灌流室中。最后的步骤是加载光学染料，并做好准备以减少实验过程中的运动伪影。光学图像通过使用 my cam Ultima LC Moss 相机采集心脏发出的光获得。嘿，我叫 di。我是华盛顿大学的一名研究生。与现有方法（如微电极）相比，该技术的主要优势在于光学标测能够实现对心脏整个表面更高空间分辨率的观测。大家好，我是Matt Sulkin。我是华盛顿大学的研究生。如果操作得当，该方法可帮助解答心脏电生理学中的诸多问题，例如心律失常的发生机制。首先将一台蠕动泵设置为以每分钟40毫升的速度循环溶液。然后将第二个蠕动泵设置为 80 毫升每分钟。该泵将灌注液八回输至储存和氧合储液器中。开启泵，以一升 70% 乙醇进行循环冲洗系统 30 分钟。用两升去离子水冲洗，不进行循环。排空水后，循环两升Tyro溶液，并使其通过一个五微米滤器。使用水套将灌注液加热至37摄氏度，并将含氧气体以气泡形式通入溶液中。调节气体冒泡速率，使 pH 值维持在 7.35 ± 0.05 范围内。实验过程中需持续监测 pH 值和温度。双光学标测装置由两台高速 CMOS 相机组成，可每秒捕获 3000 帧、100 × 100 像素的图像。将带通滤光片连接到钙成像相机上，并将长通滤光片连接到双相机支架上的电压成像相机上。安装二向色镜和透镜，使来自心脏的发射光经透镜聚焦后投射到二向色镜上。同时，将两台相机安装到支架上，并调整位置使其相互垂直。接下来，设置激发光源。光源由卤素灯产生，并通过柔性导光管引导。让光线依次通过热滤光片、用于控制曝光的快门以及激发光带通滤光片。最后，通过将银和氯化银电极安装到腔室中来制备电极。仔细检查并调整放大器和滤波器的信号水平后，该装置即可用于心脏实验。在进行下一步操作前，使用含有100单位肝素的氯胺酮和赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏确认动物无疼痛反射。沿胸骨中线做切口后，迅速取出心脏及周围组织。然后在解剖显微镜下快速识别主动脉，并在右锁骨下动脉下方的升主动脉处做一整齐切割。现在，使用四根0号黑色编织丝线将一小段主动脉连接到自制的21号套管上。插管后，逆行灌注并持续灌流心脏。用Tyrode液调节流速，通过压力传感器监测，使主动脉压力维持在60至80毫米汞柱之间。现在解剖并去除周围的肺、胸腺及脂肪组织。接着通过肺静脉将一根硅胶管插入左心室。将导管缝合固定于附近的结缔组织上。这一非常重要的步骤可防止灌注液八在左心室滞留引起的充血和酸化，尤其是在心室收缩被抑制后。为防止灌注液八引起的心脏运动，需将心脏的心尖部固定在涂有硅胶的灌流室底部。此外，应拉伸并固定右心耳和左心耳，以增加直立状态下心房的表面积。这将最大化记录表面积。进行起搏刺激时，将自制电极连接到心脏表面。为减少运动伪影，在溶液表面的心脏上方固定一小块盖玻片。通过将玻璃片夹在多个固定针之间来固定。最后的准备工作包括：将激发光聚焦于心脏，并调整相机位置以获取光学图像，随后在加载染料的同时开始染色。持续监测心电图记录，以确保心脏的正常电生理功能。首先将BLEs他汀预热至室温。然后将0.5毫升的BLEs他汀加入灌注系统储液罐中的大量Tyros溶液中，并将剩余的0.1毫升BLEs他汀稀释于1毫升Tyros溶液中。在接下来的20分钟内，通过靠近套管的给药口将BLEs他汀的Tyros溶液缓慢注入。BLEs 类他汀将逐渐减少运动伪影。接下来，将30微升电压敏感染料稀释至1毫升台氏液中，并在5至7分钟内缓慢通过同一给药端口注入该混合液。然后再次配制相同的混合液。此次加入额外的30 µL钙离子指示剂。通过同一通道在5至10分钟内缓慢加入该混合液。钙离子指示剂注射后，需再等待5至10分钟，使BLEs他汀充分抑制运动，并让染料完全进入细胞，然后再继续实验。制备了该心脏标本。根据实验方案，在心室起搏期间记录了从S1到S1刺激的ECG信号。同时从左侧心房和右侧心室记录了动作电位和钙瞬变信号。箭头指示了通过将相机记录的信号以 3 像素 × 3 像素为单位进行像素合并后，心室信号散射发生的位置，从而可根据阵列数据展示一系列钙瞬变和动作电位。可据此构建显示动作电位传导的图示。来自横轴和纵轴上三个连续点的数据展示了动作电位在心室表面传播过程中振幅的变化。同样，可以构建显示动作电位和钙瞬变持续时间的图。左侧显示对照条件，右侧显示处理条件。向心脏注射了异丙肾上腺素，明显缩短了钙瞬变和动作电位的持续时间。掌握该技术后，按照本方案可在两到三小时内完成操作。此外，还可采用其他方法（如起搏方案）来回答更多问题，例如有关房室结不应期的问题。

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科研

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生物工程

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