小鼠窦房结的高分辨率光学标测

本实验方案的总体目标是对完整Langendorff灌注的心脏或离体心房组织中的小鼠窦房结进行光学标测。该方法有助于解答窦房结电生理与病理生理学领域中关于起搏异常、病态窦房结综合征以及各种相关心房心律失常疾病机制的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在完整组织中以极高的空间分辨率和时间分辨率同时检测多种参数。

通过脚趾夹捏确认麻醉深度适当后，使用5.5英寸弯型Mayo剪刀和5.5英寸Kelly止血钳在胸腔前部做一厘米切口。用4英寸弯型Iris镊迅速夹住肺组织，使用4/3英寸Iris剪刀将肺、胸腺和心脏连同心包一并剪下。将组织置于37摄氏度含氧改良Tyrode溶液中清洗。

然后使用弯曲的3英寸Vannas Tubingen剪刀和4.3英寸5号镊子，从心脏上剥离肺、胸腺及脂肪组织。接下来，使用自制的21号导管和两把弯曲的4.3英寸5号B型镊子进行主动脉插管，并同时以37°C的Tyrode溶液对心脏进行灌流和表面灌注，在灌流前使溶液通过一个串联的11微米尼龙滤器，以防止冠状循环堵塞。随后，通过三通旋塞将压力传感器连接至灌流管路上的鲁尔锁接头，以监测主动脉压力，并根据需要调节灌流速度，使主动脉压力维持在60至80毫米汞柱之间。

对于来自Langendorff灌注心脏的窦房结光学标测，将器官水平放置，使后侧朝上置于玻璃组织浴槽中，并使用直径为0.1毫米的固定针将心室心尖固定在涂有硅胶的槽底，以防止实验过程中因液体流动引起的移动。通过肺静脉、左心房和二尖瓣将一根小型硅胶管插入左心室，并使用40号丝线将该管固定于周围结缔组织。接着，使用另一根40号丝线套扎上腔静脉和下腔静脉，并将右心耳边缘固定于槽底。

将缝合线的另一端拉伸并固定在灌流室底部，在右心耳边缘放置一个定制的起搏电极。然后将两个心电图用12毫米单极针状电极置于右心室和左心室基底部附近，并将心电图接地电极置于心尖附近。为对组织进行染色，通过冠状动脉灌流管路上的在线灌流端口注入稀释后的染料，持续灌注5至7分钟。

稳定20分钟后，向灌流液中加入0.5毫升37摄氏度的blebbistatin，随后在接下来的5至7分钟内，通过管路中的鲁尔锁注射端口，将0.1毫升溶于1毫升37摄氏度Tyrode溶液中的blebbistatin注入冠状动脉灌流管路。使用blebbistatin时应谨慎。为防止抑制剂沉淀，应先将blebbistatin溶解于已预热至37摄氏度并保持澄清的培养基中，并剧烈搅拌混合物。

为对样本进行光学标测，首先将一小块盖玻片固定于组织上方的溶液表面，以减少因溶液振动引起的运动伪影。然后，使用一根柔性分叉光纤导管，通过恒定电流、低噪声卤素灯提供的激发光，将经过滤光的光束照射到组织上，并采集所产生的荧光信号图像。在完成如上所述的心脏插管后，从腹侧分离心室，并沿三尖瓣至上腔静脉轴线方向经三尖瓣切开右心房，随后沿终嵴内侧支进行切口。

为打开前部心房游离壁，从内侧切口的中点向右心耳右下角边缘作一剪口，并将展平的心房游离壁固定在硅胶包被腔体的底部。为打开左心耳，沿左心耳二尖瓣上角处剪开二尖瓣。然后将打开的左心房按此前处理右心房的方式进行固定。

随后部分去除心室组织。保留一圈心室组织用于固定制备样本，以防止损伤心房，将组织固定在涂有硅胶的灌流 chamber 的底部。现在将最终制备的样本从硅胶涂层 chamber 的底部抬高约 0.5 毫米，以便从心外膜和心内膜两侧进行灌流，并用 37°C Tyrode 溶液对样本进行灌流。

然后将自制的 pacing 氯化银电极放置在分离的右心耳边缘。在右心耳和左心耳附近各放置一个心电图 12 毫米针状单极电极，并将心电图接地电极置于房室交界附近。为了染色心肌组织，使用 1 毫升移液器将用 37°C Tyrode 溶液稀释的电压敏感性染料缓慢滴加到组织表面。

然后，通过将稀释的blebbistatin直接施加于组织上固定样本，再经灌流液给予另外0.5毫升blebbistatin，并按照前述方法对样本进行光学标测。组织染色和blebbistatin抑制步骤至关重要，需准确执行并采用精确的染色程序，以确保心房生理参数（包括心率、主导起搏点位置及心房传导）不受影响。此处展示了一个典型的右心房激活等高线图，该图重建自Langendorff灌流小鼠心脏在自发性窦性心律下的信号，并附有分别以1毫秒和0.5毫秒采样率获取的两个相应的右心房等高线图。

早期激活点位于上腔静脉附近的腔静脉间区域，该区域在解剖学上定义为窦房结所在位置。本实验中，在以10至12赫兹频率对右心耳进行至少一分钟的起搏后，停止电刺激，并将窦房结恢复时间计算为最后一次捕获的动作电位与第一次自发动作电位之间的时间间隔。在自发窦性节律期间，离体心房标本的激活可精确定位主导起搏点的具体区域。

如果手术和染料加载操作得当，则心房的生理特性不应出现显著变化。尽管动脉染色可能需要使用更多的染料，但通过该加载方法，窦房结区域组织中的荧光信号显得更加稳定，冠状动脉染色后的信号强度衰减时间几乎是表面染色后的两倍。一旦掌握该技术，若操作正确，可在30至40分钟内完成整个过程。

进行此操作时，须注意在切割前先准确定位心房解剖结构，以避免损伤心房组织及窦房结。完成本操作后，可进一步采用常规玻璃微电极记录等方法，以探究心肌细胞跨膜电位的传导特性等相关问题。该技术建立后，为智力生理学领域研究人员探索心脏心房心律失常（包括窦房结功能障碍）开辟了道路。

观看本视频后，您应能较好地掌握如何对小鼠窦房结组织进行高分辨率光学标测。