Name: 鼠标窦房结的高分辨率光学测绘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学习小鼠窦房结的高分辨率光学测绘方法，使用Langendorff灌流心脏或离体心房制备技术。该技术可研究起搏器异常、病态窦房结综合征及房性心律失常的电生理机制。

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本研究得到了威斯康星大学麦迪逊分校医学院启动资金（A.V.G.）的支持。

所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 80-23）进行。本研究中使用的所有方法和方案均已由威斯康星大学实验动物护理与使用方案委员会批准，符合美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》（出版物编号 85-23，1996 年修订版）的要求。本研究中所使用的动物均按照《实验动物护理和使用指南》的规定接受了人道护理。
1. 心脏摘除与朗格多夫灌注
<ol>
	<li>在心脏分离前，使用水浴和水夹套将Tyrode溶液预热至37 °C。</li>
	<li>用5%异氟烷/95% O2麻醉小鼠。</li>
	<li>通过检查痛觉反射是否消失，确认麻醉程度适当。</li>
	<li>进行开胸术。使用5.5&#34;弯头Mayo剪刀和5.5&#34; Kelly止血钳，在胸廓前部做1 cm切口。
	<ol>
		<li>迅速将心脏从胸腔中取出（30秒内）。使用4&#34;弯头Iris镊夹住肺组织，用4.3&#34; Iris剪刀将肺、胸腺和带心包的心脏一起剪下。切勿直接夹取心脏。</li>
		<li>在充氧（95% O2 / 5% CO2）、恒温（36.8 ± 0.4°C）的改良Tyrode溶液中清洗心脏。使用以下成分的溶液（单位为mM）：128.2 NaCl、4.7 KCl、1.19 NaH2PO4、1.05 MgCl2、1.3 CaCl2、20.0 NaHCO3 和 11.1 葡萄糖（pH 7.35 ± 0.05）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在相同溶液中浸泡的同时，辨认肺、胸腺和脂肪组织，小心将其从心脏上分离。使用3&#34;弯头Vannas-Tubingen剪刀和4.3&#34; #5镊子。</li>
	<li>然后辨认主动脉，并将其套入自制的21 G套管上。使用两把4.3&#34;弯头#5B镊子。</li>
	<li>插管后，在整个实验过程中，同时进行灌流（通过套管以约5 ml/min的流速灌注；应根据主动脉压力调整流速，见下文）和上灌流（浴槽中以约50 ml/min的流速）。灌注液需经预热和过滤的Tyrode溶液，并通过串联的11 µm尼龙滤器，以防止冠状循环堵塞。</li>
	<li>通过连接至灌注管路的三通旋塞鲁尔接头的压力传感器（或压力计）监测主动脉压力，并将其维持在60至80 mmHg之间。必要时调整灌注速度，以保持主动脉压力在此范围内。</li>
</ol>
2. 来自Langendorff灌注完整心脏的窦房结光学标测
<ol>
	<li>仪器设置
	<ol>
		<li>将心脏水平放置，并使用直径为 0.1 mm 的针将心室心尖固定在灌流腔硅胶涂层的底部，以防止实验过程中因液体流动引起的心脏移动。12</li>
		<li>通过肺静脉、左心房（LA）和二尖瓣（MV）将一根细小的硅胶管（内径 0.012&#34; × 壁厚 0.005&#34;）插入左心室（LV），并用丝线（4-0）将该管固定于探查用结缔组织上。</li>
		<li>将心脏后侧朝上放置（图1A，左侧面板）。</li>
		<li>使用直径为 0.1 mm 的微量固定针将右心耳（RAA）边缘固定在灌流腔的硅胶底部。调整其高度，使右心房后表面保持平坦，并位于相机的焦平面上，以便从心房最大表面积区域进行光学测量。</li>
		<li>用丝线（4-0）分别结扎上腔静脉（SVC）和下腔静脉（IVC），拉紧后将线的另一端固定在硅胶涂层腔室的底部（见图3A）。确保缝线不会遮挡光学观察视野。</li>
		<li>将定制的起搏电极放置在右心耳（RAA）边缘。制备电极时，使用直径为 0.25 mm、表面涂覆硅胶的银丝，电极间距为 0.5 mm，起搏端裸露 1 mm 长度去硅胶部分。然后将两个 12 mm 长的 ECG 单极针电极（29 号针头）分别置于右心室和左心室基底部附近，并将接地 ECG 电极置于心室心尖附近。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色
	<ol>
		<li>由于荧光染料和电-机械解偶联剂blebbistatin均对光敏感，因此所有以下操作均需在暗室中进行。首先配制电压敏感性染料 RH-237 或 di-4-ANNEPS 的储备液：1.25 mg/ml 溶于二甲基亚砜（DMSO，终浓度 2.5 mM），分装（每份 30 µl），并于 -20 °C 保存。</li>
		<li>取 5–10 µl 染料储备液，加入 1 ml 预热至 37 °C 的Tyrode溶液中稀释，然后通过在线Luer注射口在 5–7 分钟内将其注入冠状动脉灌流管路中。</li>
		<li>提前配制blebbistatin储备液（2 mg/ml 溶于二甲基亚砜，终浓度 6.8 mM），并于 4°C 保存备用。</li>
		<li>在心脏稳定灌流 20 分钟后，向灌流液中加入 0.5 ml 预热至 37 °C 的blebbistatin溶液，并将 0.1 ml blebbistatin加入 1 ml 预热至 37 °C 的Tyrode溶液中稀释，随后通过在线Luer注射口在 5–7 分钟内注入冠状动脉灌流管路中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从离体心房标本对窦房结进行光学标测
<ol>
	<li>仪器设备
	<ol>
		<li>对于离体心房制备，按照上述1.1-1.5步骤所述方法分离并插管心脏，用于全心制备。</li>
		<li>从心室前侧解剖去除心室组织。详见图1A，右侧面板，切口#1。</li>
		<li>沿三尖瓣-上腔静脉轴（TV-SVC轴）切开三尖瓣（TV），打开右心房（RA）。详见图1A，右侧面板，切口#2。</li>
		<li>切开界嵴的内侧支以打开右心耳（RAA）。详见图1A，右侧面板，切口#3。</li>
		<li>从切口#3中点向RAA右下角边缘进行切开，打开前侧心房游离壁，展平后用针固定在硅胶涂层培养皿底部。详见图1A中空心箭头所示方向，切口#4。保留一圈心室组织用于固定制备物，防止损伤心房。</li>
		<li>类似地，沿二尖瓣（MV）至左心耳（LAA）上角的方向切开二尖瓣，打开左心房（LA）。</li>
		<li>为打开LAA，从已切开的LAA中部开始，穿过前侧心房游离壁，直至接近LAA中段边缘处。</li>
		<li>沿相同方向切开前侧心房游离壁，然后展平并固定于Sylgard涂层培养皿底部。</li>
		<li>部分去除房间隔组织。此举可减少非聚焦区域组织对光学信号的散射。因此，在该制备中可同时观察到LA和RA，以及窦房结（SAN）和房室交界区（AVJ）（图1B）。</li>
		<li>将最终制备物从硅胶涂层培养皿底部抬高约0.5 mm，以便对心外膜和心内膜表面均进行灌流。</li>
		<li>以恒定流速用预热（37 °C）的Tyrode溶液对制备物进行表面灌流：聚焦灌流时流速约为12 ml/min（位于上腔静脉附近），浴槽式灌流时约为30 ml/min。</li>
		<li>将自制的Ag/AgCl2刺激电极（直径0.25 mm）放置在解剖后的RAA边缘。然后将两个ECG 12 mm针状电极（29G，单极）分别置于RAA和LAA附近。接地ECG电极置于AVJ附近。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色
	<ol>
		<li>直接应用电压敏感性染料（RH-237或di-4-ANNEPS）。具体操作：将1–2 µl染料储备液溶于1 mm预热（37 °C）的Tyrode溶液中，使用1 mm移液器缓慢将稀释后的染料释放至制备物表面。</li>
		<li>或者，可通过Langendorff灌注心脏的冠状动脉进行心房染色，方法同前述全心制备（步骤2.2.1–2.2.2）。
		<ol>
			<li>冠状动脉灌注染色后，按上述方法分离心房制备。必要时可追加表面染色以达到满意的荧光强度。快速的心房分离不会导致染料褪色，也不影响染色质量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用机械-电去耦联剂blebbistatin固定制备物。将3–5 µl blebbistatin储备液加入预热（37 °C）的Tyrode溶液中，缓慢将其滴加至制备物表面及周围溶液中。由于blebbistatin具有光敏感性13,14，在制备和染色过程中应避免长时间光照。</li>
		<li>根据需要多次追加blebbistatin以充分抑制收缩。通常最多可追加3次（每次3–5 µl），足以有效抑制运动伪影，从而准确重建窦房结和心房的激活过程。</li>
		<li>在灌流液中额外加入0.5 ml预热的blebbistatin。此过程中暂停表面灌流30秒，以使染料/blebbistatin充分染色心房组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 光学图谱实验设置
注意：光学图谱系统的详细描述见其他文献。12
<ol>
	<li>使用时间分辨率为每秒2,000帧或更高的相机，以及一系列聚光镜，以达到空间分辨率100 µm/像素或更高。这是重建窦房结激活和结内传导所必需的。</li>
	<li>为减少溶液振动引起的运动伪影，在心脏或离体心房标本上方的溶液表面固定一小块盖玻片。</li>
	<li>使用由恒流、低噪声卤素灯提供的激发光（波长520 ± 45 nm），并通过柔性分叉光导将滤光后的光束引导至标本上。</li>
	<li>采用长通滤光片（&#62;715 nm）过滤发射的荧光信号，利用相机制造商提供的软件在计算机上采集、数字化并保存所获得的荧光信号。</li>
</ol>
5. 数据处理
注意：光学标测数据以一系列在不同时间点采集的荧光强度矩阵形式收集和存储。每个像素代表在特定时间点从组织制备的特定位置采集的荧光强度测量值。系统会针对每个像素自动去除背景荧光，以更清晰地显示由膜电位变化引起的荧光信号变化，并将信号反转，使其与微电极系统测得的动作电位（APs）相对应。有关光学成像数据处理各个步骤的详细信息，包括图像分割、空间滤波、时间滤波和基线漂移校正，已在相关专题综述中提供。15
<ol>
	<li>手动或使用特定算法（例如，阈值分割或边缘检测）15 为确定组织边界，创建一个二值掩膜，其中1代表包含的像素，0代表排除的像素，并将该掩膜应用于序列中的每一帧。此过程生成一幅二值图像，突出显示后续处理所需的感兴趣区域。</li>
	<li>为了提高光学数据的信噪比，对选定的兴趣区域内的信号进行滤波。为此，使用空间（即 根据所需的卷积窗口或核（例如 3 × 3，或对噪声较大的数据采用 5 × 5）对相邻荧光像素进行平均，和/或时间滤波（例如 Butterworth、Chebyshev I 型、Chebyshev II 型、椭圆滤波） 等等。) (图2注意在数据分析时可能存在滤膜引入的假象。更多细节请参见相关综述。15</li>
	<li>根据需要去除光学记录中基线的漂移（通过使用高通滤波或对原始信号进行多项式拟合），然后将每个像素的信号归一化至0（最小荧光）到1（最大荧光）。</li>
	<li>选择一个时间窗口，以涵盖单次动作电位传播过程中所有像素的激活时间。将每个像素的激活时间定义为荧光信号上升支最大导数（dF/dt）对应的时间点。最大值，其中 F 为荧光强度）。利用所有像素的激活时间，重建等时激活图。每条等时线将显示同时被激活的像素。</li>
	<li>为了重建动作电位时程（APD）分布图，对每个像素计算从激活时刻到特定复极化水平时刻之间的持续时间（例如，在80%复极化水平时，记为APD80）80). 利用所有像素的APD值，重建APD分布的等时图。每个等时线将显示具有相同APD的像素。</li>
	<li>为计算动作电位传播的传导速度，需将标本表面拟合至5.4步骤中计算得到的激活时间数据。可采用多项式曲面拟合或局部核函数曲面平滑法，随后根据拟合曲面的梯度计算局部传导速度矢量。</li>
	<li>为了生成复极化图，为每个像素分配其复极化时间，该时间定义为动作电位第二导数（d²V/dt²）最大值对应的时刻。2F/dt2OAP末端光学信号的幅度，或90%复极化时间。</li>
</ol>

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circ Res. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduction+barriers+and+pathways+of+the+sino-atrial+pacemaker+complex%3A+their+role+in+normal+rhythm+and+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2012).</li>
<li>Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinoatrial+node%2C+a+heterogeneous+pacemaker+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure.</a> Cardiovasc Res. 47 (4), 658-687 (2000).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+Node+Reentry+in+a+Canine+Chronic+Left+Ventricular+Infarct+Model%3A+The+Role+of+Intranodal+Fibrosis+and+Heterogeneity+of+Refractoriness%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Arrhythm+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness.</a> Circ Arrhythm Electrophysiol. , (2013).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex.</a> Eur Heart J. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>John, R. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinus+Node+and+Atrial+Arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Sinus Node and Atrial Arrhythmias.</a> Circulation. 133 (19), 1892-1900 (2016).</li>
<li>Swaminathan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+CaMKII+causes+cardiac+sinus+node+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice.</a> J Clin Invest. 121 (8), 3277-3288 (2011).</li>
<li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node%3A+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299 (2), H482-H491 (2010).</li>
<li>Egom, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+sinoatrial+node+function+and+increased+susceptibility+to+atrial+fibrillation+in+mice+lacking+natriuretic+peptide+receptor+C%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C.</a> J Physiol. 593 (5), 1127-1146 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> J Vis Exp. (55), e3275(2011).</li>
<li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
<li>Swift, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+blebbistatin+for+cardiac+optical+mapping+and+other+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications.</a> Pflugers Arch. 464 (5), 503-512 (2012).</li>
<li>Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analysis+of+cardiac+optical+mapping+data+obtained+with+potentiometric+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (7), H753-H765 (2012).</li>
<li>Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node%3A+structure+and+expression+of+HCN+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovasc Res. 73 (4), 729-738 (2007).</li>
<li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 40-50 (2001).</li>
<li>Krishnaswamy, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+parasympathetic+nervous+system+regulation+of+the+sinoatrial+node+in+Akita+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice.</a> J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).</li>
<li>Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+action+potential+durations+in+isolated+mouse+left+and+right+atria+recorded+using+voltage-sensitive+dye+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2634-H2643 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cardiac+pacemaker+circuits%3A+methodological+puzzles+of+the+sinoatrial+node+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping.</a> Circ Res. 106 (2), 255-271 (2010).</li>
<li>Aschar-Sobbi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+atrial+arrhythmia+susceptibility+induced+by+intense+endurance+exercise+in+mice+requires+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha.</a> Nat Commun. 6, 6018(2015).</li>
<li>Hansen, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+driven+by+micro-anatomic+intramural+re-entry+revealed+by+simultaneous+sub-epicardial+and+sub-endocardial+optical+mapping+in+explanted+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts.</a> Eur Heart J. 36 (35), 2390-2401 (2015).</li>
<li>Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+heart+rate+in+a+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrocardiol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart.</a> J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).</li>
<li>Kanlop, N., Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+study+of+blebbistatin-induced+chaotic+electrical+activities+in+isolated+rat+atrium+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations.</a> J Physiol Sci. 60 (2), 109-117 (2010).</li>
<li>Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 152-160 (2010).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sinoatrial+node+function+and+intra-atrial+conduction+in+murine+gain-of-function+Scn5a%2B%2FDeltaKPQ+hearts+suggest+an+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍了两种小鼠窦房结（SAN）制备方法：1）在Langendorff灌流的完整心脏中的完整窦房结；2）在分离并打开心房的制备标本中的窦房结。这两种制备方法适用于不同的实验目的。在Langendorff灌流的完整心脏制备中，心房的完整结构得以保留，因此可用于研究心房颤动等复杂的心房心律失常，以及在折返性心动过速期间窦房结与心房之间的相互作用6。相比之下，在分离的心房制备中，心房被打开并展平为一种伪二维结构，导致原有的三维解剖束结构受到破坏。这可能影响折返通路的解剖路径，因此分离的心房制备不适合用于研究心房心律失常的发生机制。然而，利用这种制备方法，可以精确地可视化并详细研究主导起搏位点的位置、结内传导以及动作电位的传播模式。此外，完整心房的观察受限于其后侧视野，而在分离的制备标本中，整个心房表面均可用于光学标测。
此外，分离的心房制备可通过解析心房小梁网络的复杂显微结构，实现心房的结构-功能定位映射，如 图4为此，应采用高空间分辨率（100 µm/像素或更高）和高时间分辨率（2,000 fps 或更高），因为精确区分心房和窦...

导致人类生理学认知飞跃的新科学突破，往往以技术进步为先导。例如，荧光光学标测技术能够对细胞和组织中的多种生理参数进行研究1,2。该技术显著加深了我们对解剖结构与电生理功能及功能障碍之间关系的理解。在心脏中，天然起搏点和传导系统（如窦房结（SAN）和房室交界区）由结状心肌细胞构成，这些细胞被周围的心房肌细胞所隔离3-5。这种组织方式形成了具有特化电学特性的复杂三维结构。人们已认识到，这些起搏结构在结构和功能上的重构会形成显著的电生理异质性6,7。阐明此类异质性导致窦房结功能障碍和心房心律失常发生机制，将极大促进这些疾病的临床治疗。实现这一目标需要一种能够在组织水平上可视化电信号传播的技术，例如光学标测。
近年来，越来越多的证据表明，光学标测技术在心房电生理学和病理学研究中取得了显著进展2。然而，新颖且严谨的研究依赖于对实验数据的准确解读，而数据的有效性和稳定性则取决于精细的实验方案。转基因小鼠被广泛用作人类疾病（包括病态窦房结综合征、起搏异常和心房心律失常）的动物模型6,8-11。因此，将荧光光学标测技术与转基因小鼠模型相结合，为研究多种病理状态下相关的心脏电活动异常提供了强有力的工具。本文中，我们介绍了一种用于小鼠窦房结（SAN）和心房高分辨率光学标测的实验方案。具体而言，我们讨论并比较了不同的染料负载方法、染料漂白的时间效应以及实验过程中心率的稳定性。

<table><tbody><tr><td>水浴夹套</td><td>Radnoti</td><td>1660 系列大组织或单细胞分离用组织浴槽</td><td></td></tr><tr><td>水浴/循环器</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>压力放大器</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore 尼龙网滤膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢显微针 - 直径 0.1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td> superfusion 泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tubingen 剪刀&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501201, 500085</td><td></td></tr><tr><td>Mayo 剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Kelly 止血钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ECG 12 mm 针式电极（29 号，单极）&amp;nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>管路内鲁尔注射接口</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L CMOS 相机&amp;nbsp;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>卤素灯</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠窦房结的高分辨率光学标测

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

窦房结（SAN）功能障碍及其相关并发症是心脏疾病患者发病的重要原因。开发治疗这些患者的新药疗法依赖于对窦房结正常生理学及病理生理学的深入理解。在心脏起搏研究中，小鼠窦房结被广泛使用，因其便于对编码窦房结离子通道或钙处理蛋白的不同基因进行表达修饰。来自电生理学和组织学研究的新证据也证实了小鼠窦房结在结构和功能上具有代表性，并与包括人类在内的较大哺乳动物相似，例如存在从窦房结到心房的特化传导通路，以及窦房结内部复杂的起搏细胞层级结构。近年来，光学标测技术极大地促进了对小鼠窦房结内部及其起源的兴奋与传导机制的探索与研究，从而进一步加深了对窦房结的理解，并有助于与窦房结功能障碍相关疾病的临床治疗。在本论文中，我们详细描述了如何在完整、经Langendorff灌注的小鼠心脏以及分离的心房组织标本上进行窦房结光学标测。该实验方案是深入理解小鼠窦房结生理学与病理生理学的有力工具。

完整窦房结在离体灌注心脏中的光学标测 
显示了为自发性窦性心律重建的典型RA激活等时线图 图3 对于经Langendorff灌注的小鼠心脏，早期激活点位于上腔静脉附近解剖学上定义的窦房结所在的下腔静脉间区域。3,16 在1.0和0.5毫秒采样率下获取的两张RA激活等高线图如图所示 图3B.
为评估窦房结功能，我们测量了窦房结恢复时间（SANRT）。9 在以10-12 Hz频率进行至少1分钟的右心耳起搏后，停止电刺激，窦房结恢复时间（SANRT）定义为最后一个被捕获的动作电位与第一个自发动作电位之间的时间间隔图3C）。SANRT 校正至心率（即 SANRTc通过计算窦房结恢复时间（SANRT）与基础周期长度之间的差值来确定。此外，还...

本文介绍了一种以高空间和时间分辨率对小鼠右心房特别是窦房结的电活动进行光学标测的实验方案。

窦房结（SAN）功能障碍及其相关并发症是心脏疾病患者发病的重要原因。

本实验方案的总体目标是对完整Langendorff灌注的心脏或离体心房组织中的小鼠窦房结进行光学标测。该方法有助于解答窦房结电生理与病理生理学领域中关于起搏异常、病态窦房结综合征以及各种相关心房心律失常疾病机制的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在完整组织中以极高的空间分辨率和时间分辨率同时检测多种参数。通过脚趾夹捏确认麻醉深度适当后，使用5.5英寸弯型Mayo剪刀和5.5英寸Kelly止血钳在胸腔前部做一厘米切口。用4英寸弯型Iris镊迅速夹住肺组织，使用4/3英寸Iris剪刀将肺、胸腺和心脏连同心包一并剪下。将组织置于37摄氏度含氧改良Tyrode溶液中清洗。然后使用弯曲的3英寸Vannas Tubingen剪刀和4.3英寸5号镊子，从心脏上剥离肺、胸腺及脂肪组织。接下来，使用自制的21号导管和两把弯曲的4.3英寸5号B型镊子进行主动脉插管，并同时以37°C的Tyrode溶液对心脏进行灌流和表面灌注，在灌流前使溶液通过一个串联的11微米尼龙滤器，以防止冠状循环堵塞。随后，通过三通旋塞将压力传感器连接至灌流管路上的鲁尔锁接头，以监测主动脉压力，并根据需要调节灌流速度，使主动脉压力维持在60至80毫米汞柱之间。对于来自Langendorff灌注心脏的窦房结光学标测，将器官水平放置，使后侧朝上置于玻璃组织浴槽中，并使用直径为0.1毫米的固定针将心室心尖固定在涂有硅胶的槽底，以防止实验过程中因液体流动引起的移动。通过肺静脉、左心房和二尖瓣将一根小型硅胶管插入左心室，并使用40号丝线将该管固定于周围结缔组织。接着，使用另一根40号丝线套扎上腔静脉和下腔静脉，并将右心耳边缘固定于槽底。将缝合线的另一端拉伸并固定在灌流室底部，在右心耳边缘放置一个定制的起搏电极。然后将两个心电图用12毫米单极针状电极置于右心室和左心室基底部附近，并将心电图接地电极置于心尖附近。为对组织进行染色，通过冠状动脉灌流管路上的在线灌流端口注入稀释后的染料，持续灌注5至7分钟。稳定20分钟后，向灌流液中加入0.5毫升37摄氏度的blebbistatin，随后在接下来的5至7分钟内，通过管路中的鲁尔锁注射端口，将0.1毫升溶于1毫升37摄氏度Tyrode溶液中的blebbistatin注入冠状动脉灌流管路。使用blebbistatin时应谨慎。为防止抑制剂沉淀，应先将blebbistatin溶解于已预热至37摄氏度并保持澄清的培养基中，并剧烈搅拌混合物。为对样本进行光学标测，首先将一小块盖玻片固定于组织上方的溶液表面，以减少因溶液振动引起的运动伪影。然后，使用一根柔性分叉光纤导管，通过恒定电流、低噪声卤素灯提供的激发光，将经过滤光的光束照射到组织上，并采集所产生的荧光信号图像。在完成如上所述的心脏插管后，从腹侧分离心室，并沿三尖瓣至上腔静脉轴线方向经三尖瓣切开右心房，随后沿终嵴内侧支进行切口。为打开前部心房游离壁，从内侧切口的中点向右心耳右下角边缘作一剪口，并将展平的心房游离壁固定在硅胶包被腔体的底部。为打开左心耳，沿左心耳二尖瓣上角处剪开二尖瓣。然后将打开的左心房按此前处理右心房的方式进行固定。随后部分去除心室组织。保留一圈心室组织用于固定制备样本，以防止损伤心房，将组织固定在涂有硅胶的灌流 chamber 的底部。现在将最终制备的样本从硅胶涂层 chamber 的底部抬高约 0.5 毫米，以便从心外膜和心内膜两侧进行灌流，并用 37°C Tyrode 溶液对样本进行灌流。然后将自制的 pacing 氯化银电极放置在分离的右心耳边缘。在右心耳和左心耳附近各放置一个心电图 12 毫米针状单极电极，并将心电图接地电极置于房室交界附近。为了染色心肌组织，使用 1 毫升移液器将用 37°C Tyrode 溶液稀释的电压敏感性染料缓慢滴加到组织表面。然后，通过将稀释的blebbistatin直接施加于组织上固定样本，再经灌流液给予另外0.5毫升blebbistatin，并按照前述方法对样本进行光学标测。组织染色和blebbistatin抑制步骤至关重要，需准确执行并采用精确的染色程序，以确保心房生理参数（包括心率、主导起搏点位置及心房传导）不受影响。此处展示了一个典型的右心房激活等高线图，该图重建自Langendorff灌流小鼠心脏在自发性窦性心律下的信号，并附有分别以1毫秒和0.5毫秒采样率获取的两个相应的右心房等高线图。早期激活点位于上腔静脉附近的腔静脉间区域，该区域在解剖学上定义为窦房结所在位置。本实验中，在以10至12赫兹频率对右心耳进行至少一分钟的起搏后，停止电刺激，并将窦房结恢复时间计算为最后一次捕获的动作电位与第一次自发动作电位之间的时间间隔。在自发窦性节律期间，离体心房标本的激活可精确定位主导起搏点的具体区域。如果手术和染料加载操作得当，则心房的生理特性不应出现显著变化。尽管动脉染色可能需要使用更多的染料，但通过该加载方法，窦房结区域组织中的荧光信号显得更加稳定，冠状动脉染色后的信号强度衰减时间几乎是表面染色后的两倍。一旦掌握该技术，若操作正确，可在30至40分钟内完成整个过程。进行此操作时，须注意在切割前先准确定位心房解剖结构，以避免损伤心房组织及窦房结。完成本操作后，可进一步采用常规玻璃微电极记录等方法，以探究心肌细胞跨膜电位的传导特性等相关问题。该技术建立后，为智力生理学领域研究人员探索心脏心房心律失常（包括窦房结功能障碍）开辟了道路。观看本视频后，您应能较好地掌握如何对小鼠窦房结组织进行高分辨率光学标测。

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鼠标窦房结的高分辨率光学测绘

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本报告详细描述了在拉伸诱导心房颤动期间，对离体羊心左心房进行Langendorff灌注状态下同步心内膜和心外膜电兴奋光学标测的方法学与结果。...

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利用微电极阵列记录窦房结放电频率以鉴定小鼠固有心脏起搏功能缺陷

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光片成像揭示啮齿类动物心脏结构

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小鼠窦房结的高分辨率光学标测

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