鼠标窦房结的高分辨率光学测绘

该实验方案的总体目标是从完整的 Langendorff 灌注心脏或离体心房制剂对小鼠窦房结进行光学标测。该方法可以帮助回答窦房结电生理学和病理生理学领域关于起搏器异常、病态窦房结综合征和各种与房性心律失常相关的疾病机制的关键问题。该技术的主要优点是它能够以非常高的空间和非时间分辨率研究完整组织中的多个参数。

通过捏脚趾确认适当的麻醉水平后，使用弯曲的 5.5 英寸 Mayo 剪刀和 5.5 英寸凯利止血钳在胸部前部做一个 1 厘米的切口。使用 4 英寸弯曲的虹膜镊子，快速抓住肺组织，并使用 4/3 英寸的虹膜剪刀将肺、胸腺和心脏以及心包一起剪出。在含氧的 37 摄氏度改性 Tyrode 溶液中洗涤组织。

然后使用弯曲的 3 英寸 Vannas Tubingen 剪刀和三分之四英寸的 5 号镊子从心脏中取出肺、胸腺和脂肪组织。接下来，使用定制的 21 号插管和两个弯曲的 4.3 英寸 5 号 B 镊子来插管主动脉，同时用 37 摄氏度的 Tyrode 溶液灌注和超熔心脏，引导溶液在灌注前通过在线 11 微米尼龙过滤器，以防止冠状动脉循环堵塞。然后通过三通旋塞阀将压力传感器连接到灌注管路上的鲁尔锁，以监测主动脉压力，根据需要调整灌注速度以将主动脉压保持在 60 至 80 毫米汞柱之间。

为了从 Langendorff 灌注心脏对窦房结进行光学映射，将器官放置在玻璃组织器官浴室中，将器官水平放置，后部朝上，并使用 0.1 毫米直径的销将心室根尖固定到腔室的硅胶涂层底部，以防止实验期间流诱导运动。通过肺静脉、左心房和二尖瓣将一根小硅胶管插入左心室，并使用 40 丝缝合线将管固定在周围的结缔组织上。接下来，使用另外 40 根丝缝线套住上腔静脉和下腔静脉，并将右心耳的边缘固定在腔室底部。

将缝合线的另一端拉伸并固定在腔室底部，并在右心耳的边缘放置定制的起搏电极。然后将两个心电图 12 毫米针状单极电极放置在左右心室底部附近，并将接地心电图电极放置在心室根尖附近。要对组织进行染色，请将稀释的染料注射到冠状动脉灌注管线的在线灌注端口中，以便在 5 到 7 分钟内输送。

稳定 20 分钟后，将 0.5 毫升 37 摄氏度的 blebbistatin 加入灌注液中，然后使用内联鲁尔锁注射口将 0.1 毫升 blebbistatin 稀释在 1 毫升 37 摄氏度的 Tyrode 溶液中，再注射 5 到 7 分钟到冠状动脉灌注管中。应谨慎使用 Blebbistatin。为防止抑制剂沉淀，首先将 blebbistatin 溶解在已加热至 37 度的培养基中，然后剧烈搅拌混合物。

要对样品进行光学映射，首先将一个小的有盖玻璃固定在组织上方的溶液表面上，以减少振动溶液产生的任何运动伪影。然后使用柔性分叉光导和由恒流、低噪声卤素灯提供的激发光，将过滤后的光束对准组织并对产生的荧光信号进行成像。如刚才所示，在心脏插管后，从前侧解剖心室，沿着三尖瓣上腔静脉轴通过三尖瓣打开右心房，然后通过终嵴的内侧肢切开。

要打开前心房游离壁，从内侧肢体切口的中线到右心耳右下角的边缘切开一个切口，然后将扁平的心房游离壁固定在硅胶涂层腔室的底部。要打开左心耳，请沿左心耳的二尖瓣上角切开二尖瓣。然后固定打开的左心房，就像之前对右心房所做的那样。

然后部分切除脑室组织。保留心室组织的边缘以固定制剂以防止损伤心房，并将组织固定在 Sylgard 涂层腔室的底部。现在将最终制剂从硅胶涂层室底部抬起约 0.5 毫米，以允许从心外膜和心内膜表面进行超融合，并用 37 摄氏度的 Tyrode 溶液对样品进行超融合。

然后将定制的起搏氯化银电极放在解剖的右心耳边缘。在左右心耳附近放置一个心电图 12 毫米针单极电极，并将接地心电图电极放置在心房室交界处附近。要对心脏组织进行染色，请使用 1 毫米移液器将用 37 摄氏度 Tyrode 溶液稀释的电压敏感染料缓慢释放到组织上。

然后将稀释的 blebbistatin 直接涂抹在组织上，将样品固定在组织上，然后通过灌注液再施用 0.5 毫升 blebbistatin，并如刚才所示对样品进行光学映射。组织染色和 blebbistatin 抑制步骤至关重要，需要准确实施和精确的染色程序，以免影响心房生理参数，包括心率、前导起搏器的分配和心房传导。这里显示了为 Langendorff 灌注小鼠心脏的自发性窦性心律重建的典型右心房激活等值线图，并显示了以 1 毫秒和 0.5 毫秒采样率获取的两个相应的右心房等值线图。

早期激活点位于上腔静脉附近的腔内区域，窦房结在解剖学上是明确的。在这个实验中，在右心耳以 10 至 12 赫兹的频率起搏至少 1 分钟后，停止电刺激，并将窦房结恢复时间计算为最后一次捕获的动作电位和第一次自发动作电位之间的时间间隔。在自发性窦性心律期间激活孤立的心房准备可以识别前导起搏器位置的精确区域。

如果适当地遵循手术和染料负荷程序，则不应观察到心房生理特征的显着变化。虽然动脉染色可能需要更多的染料，但通过这种加载方法，窦房结区域组织中的荧光信号似乎更稳定，冠状动脉染色后的信号强度衰减时间几乎是表面染色后的两倍。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 30 到 40 分钟内完成。

尝试此手术时，请注意在切割前找到心房解剖结构，以免损坏心房组织和窦房结。在此程序之后，可以执行其他措施，如常规玻璃二尖瓣电极记录，以回答有关交换跨膜电位特性的其他问题。发展后，这项技术为智力生理学领域的研究人员探索房性心律失常铺平了道路，包括心脏窦房结功能障碍。

观看此视频后，您应该对如何对小鼠窦房结准备进行高分辨率光学映射有很好的了解。