Name: 固相Submonomer Peptoid聚合物及其自组装成高度有序的纳米片的合成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: 学习固相Submonomer法合成序列特异性peptoid聚合物，并探索其自组装形成高度有序纳米片的方法。该技术适用于纳米科学、生物医学和材料工程研究。

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作者谨此感谢李炳哲、Philip Choi 和 Samuel Ho 提供的宝贵帮助。本工作在劳伦斯伯克利国家实验室的分子铸造厂完成，该实验室由美国能源部科学办公室基础能源科学办公室根据合同号 DE-AC02-05CH11231 提供支持，并由国防威胁降低局根据合同号 IACRO-B0845281 提供支持。

1. 多肽拟态物的固相单体下合成法
固相合成（SPS）是一种用于逐步合成序列特异性生物大分子的常用技术，可直接在惰性固相载体（如聚合物树脂微球）上进行。SPS 的主要优势在于偶联产率高，且易于去除过量反应物。在树脂上完成偶联反应后，只需简单排出过量试剂，并洗涤树脂微球，即可准备进行下一步反应。在最终合成反应完成后，将全长寡聚物从树脂上裂解下来，所得溶液相产物可进一步研究。本文中，我们对 SPS 方法进行改进，用于制备序列特异性的肽拟态聚合物（peptoid polymer）。
<ol>
	<li>装置设置：手动肽拟态物合成的所有步骤均可在一次性聚丙烯（PP）烧结柱或配有三通旋塞的烧结玻璃反应容器中进行。所有操作均需在通风橱内完成。在玻璃容器或塑料柱中进行孵育时，将其中一端连接至氮气源，使溶液缓慢鼓泡以实现充分混合。或者，对于一次性反应柱中的反应孵育，可用封帽密封柱的两端，并将其置于旋转摇床上。在排出反应混合物或洗涤液时，通过废液捕集装置连接至实验室真空系统。反应容器应配备粗孔烧结片。为防止树脂珠粘附于玻璃容器壁上，需对玻璃反应容器进行硅烷化处理。配制5%二氯二甲基硅烷的二氯乙烷溶液（v/v）。将洁净干燥的反应容器加满硅烷化溶液，静置30分钟，然后排空。依次用二氯乙烷（DCE）和甲醇各洗涤一次。硅烷化溶液可重复使用，应予以保存。排净后可空气干燥或甩去多余溶液，并在拆下旋塞后将玻璃器皿烘至完全干燥。在加入树脂前需冷却反应容器。</li>
	<li>向烧结反应容器中加入100 mg（0.06 mmol）Rink酰胺树脂。加入2 mL二甲基甲酰胺（DMF）溶胀树脂，振荡或鼓泡处理10分钟。通过抽真空除去溶液，得到溶胀后的树脂。</li>
	<li>加入1 mL 20% 4-甲基哌啶的DMF溶液（v/v），以脱除Fmoc保护基。振荡反应2分钟，然后排液；再重复一次，孵育时间为12分钟。</li>
	<li>加入2 mL DMF，振荡15秒后排液，洗涤树脂。重复此步骤3次。</li>
	<li>溴乙酰化：加入1 mL含0.6 M溴乙酸（0.6 mmol）的DMF溶液及86 μL N,N'-二异丙基碳二亚胺（0.93当量，0.56 mmol）。在轻微鼓泡条件下孵育30分钟，然后排液，并用2 mL DMF冲洗（重复4次）。</li>
	<li>取代反应：加入1 mL浓度为1–2 M的胺类化合物N-甲基吡咯烷酮溶液。在鼓泡条件下孵育30–120分钟，然后排液，并用DMF冲洗（每次2 mL，重复4次）。</li>
	<li>通过重复亚单体循环步骤1.5（溴乙酰化）和1.6（取代反应），继续延长肽拟态物链。</li>
</ol>
<ol start="8">
	<li>最后一次取代反应完成后，用 2 mL DMF 洗涤（重复 4 次），然后用 2 mL 二氯甲烷洗涤（重复 3 次）。盖紧并保存反应容器，直至进行裂解。</li>
	<li>合成暂停（可选）：若需在肽拟物合成过程中暂停，请完成取代反应后继续进行步骤 1.8。若要继续延长肽拟物链，则通过重新溶胀干燥树脂（步骤 1.2）并重复亚单体循环（步骤 1.5 和 1.6）来重启合成。除第二次取代反应后外，任何取代反应后均可将树脂干燥并储存，因为树脂-肽拟物偶联物在第二次取代后可能形成环状二酮哌嗪副产物。</li>
	<li>对于多个同时进行的合成反应，建议使用固相萃取真空装置以提高效率。肽拟物合成也可通过在商用肽合成仪上正确编程方法实现自动化，例如 Aapptec Apex 396、CEM Liberty 微波合成仪和 Protein Technologies Inc. Prelude 合成仪。</li>
</ol>
2. 裂解与侧链去保护
<ol>
	<li>将所有干燥的树脂转移至一个 20 mL 闪烁玻璃小瓶中。</li>
	<li>在通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备，向闪烁玻璃小瓶中加入 4 mL 三氟乙酸（TFA）裂解混合液1（例如 95% 水溶液 TFA，参见讨论部分），盖紧瓶盖。在室温下振荡 10 分钟至 2 小时（参见讨论部分）。</li>
	<li>通过一次性聚丙烯（PP）烧结滤筒将树脂过滤，收集 TFA 裂解液至一个新的、预先称重的 20 mL 闪烁玻璃小瓶中。使用一次性聚丙烯移液管转移裂解液较为方便。</li>
	<li>加入 1 mL 新鲜裂解混合液冲洗树脂，以收集残留的肽拟物。重复此步骤两次。</li>
	<li>通过通入温和的氮气气流或使用 Biotage V10 浓缩仪除去 TFA。</li>
	<li>将粗产物油状物重新溶解于 6 mL 乙腈/水（1:1, v/v）溶液中用于 HPLC 分析。冷冻并冻干，重复一次。</li>
	<li>记录粗产物的重量。以干燥粉末形式于 -20 °C 保存。</li>
	<li>裂解测试（可选）：可取 0.5% 的树脂进行小规模裂解测试，以快速确定所合成肽拟物的纯度和分子量，并验证所选裂解条件是否正确。该测试对监测合成进程尤为有用。</li>
</ol>
3. 多肽拟化合物的表征与纯化
<ol>
	<li>通过分析型高效液相色谱（HPLC）、电喷雾液相质谱（LC-MS）和/或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），确定粗产物的纯度以及是否含有目标分子量。</li>
	<li>将干燥的peptoid粉末溶于水中，配制成约5–10 mg/mL的溶液，根据溶解度需要可加入少量乙腈。用滤膜过滤粗品peptoid的澄清溶液， 0.45 μm 注射器滤器去除灰尘和颗粒物。</li>
	<li>分析型高效液相色谱和电喷雾液相色谱-质谱：配制 ˜ 20 μg/mL 粗肽拟态物溶液。过滤 200 μL 与一个 0.45 μm 过滤并注射 20 μL.</li>
	<li>MALDI：混合 1 μL 的 ˜20 mg/mL 肽模拟物与 1 μL 基质。点样 1 μL 点样于MALDI板上，自然晾干。基质和采集模式根据样品而定（图5）。</li>
	<li>使用反相制备型高效液相色谱纯化粗肽拟态物混合物。根据多肽拟态物的疏水性选择洗脱梯度和色谱柱（C4 或 C18）。合并纯化后的组分，冷冻并冻干，得到疏松的白色粉末。记录最终产物的重量。</li>
	<li>HCl盐的形成（可选）：将冻干粉重新溶解于100 mM HCl（水溶液）中，可加入少量乙腈助溶。转移至预先称重的玻璃小瓶中，冷冻后重新冻干，重复两次。重新称重以确定肽模拟物粉末的质量。</li>
</ol>
4. 佩普托纳米片的形成
本部分描述了由单链、序列特异性的两亲性36聚肽模拟物（图1）形成片层的实验方案。在按照上述方法合成、纯化并冻干肽模拟物后，将所得白色粉末溶解于DMSO中，配制成2 mM的储备溶液。
<ol>
	<li>在1 dram玻璃小瓶中，用成膜缓冲液（10 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH 8.0的水溶液）配制500 μL的20 μM peptoid溶液。首先加入445 μL Milli-Q水和50 μL 10倍浓度的成膜缓冲液，涡旋混匀。然后加入5 μL 2 mM peptoid储备溶液，轻轻旋转混匀。盖紧玻璃小瓶。</li>
	<li>通过轻柔搅动稀释的水相peptoid溶液可形成纳米片。将玻璃小瓶从水平位置缓慢倾斜至直立位置即可形成纳米片。轻微振荡也可形成纳米片，但所得纳米片通常较小且直边较少。关于纳米片形成机制的更详细分析已另文报道。2</li>
	<li>为获得大量高质量纳米片，将玻璃小瓶围绕水平轴缓慢旋转（<1 RPM），持续一至三天。可使用Appropriate Technical Resources RKVSD Rotamix旋转混合仪或定制的摇床连续完成此操作。</li>
	<li>纳米片的透析（可选）：在某些应用中，可能需要去除游离的peptoid链或缓冲液/盐分。将Float-a-Lyzer 100 kD透析膜置于所需缓冲液中浸泡15分钟。将500 μL peptoid纳米片溶液加入样品室中，放入500 mL相同缓冲液中，以60 rpm磁力搅拌。透析持续4小时，每隔一小时更换一次新鲜缓冲液。</li>
</ol>
5. 纳米片的荧光显微镜观察
<ol>
	<li>使用 Nile Red 对纳米片进行荧光成像，Nile Red 是一种环境敏感型染料，当其定位于疏水环境时，荧光强度会增强（图 2）。</li>
	<li>向 100 μL 纳米片溶液中加入 1 μL 的 100 μM Nile Red，使 Nile Red 的终浓度达到 1 μM。</li>
	<li>在热水中配制 1% 琼脂糖溶液，并倒入塑料培养皿中。确保琼脂糖溶液厚度约为 1/8 英寸，在平坦表面上静置冷却。待琼脂糖凝固后，用刮铲切割并转移 1 cm × 1 cm 的小方块至载玻片上。</li>
	<li>为使纳米片保持在同一焦平面，将 1 μL 纳米片溶液滴加在琼脂糖块上。静置 2 分钟，使琼脂糖吸收缓冲液，从而将纳米片保留在表面。应在 15 分钟内完成成像，否则琼脂糖会因脱水而开始变形。</li>
	<li>若需在溶液中对纳米片进行成像，可在载玻片上直径为 20 mm、厚度为 0.12 mm 的垫圈内加入 15 μL 样品，然后盖上盖玻片。若纳米片仅被简单夹在载玻片与盖玻片之间而无垫圈，许多纳米片会发生剪切，且看似微小的蒸发作用将导致纳米片持续移动。</li>
	<li>在倒置荧光显微镜（例如配备 Andor iXonEM+ EMCCD 光谱仪和 Texas red 滤光片的 Olympus IX81 显微镜）下，采用落射荧光照明对纳米片进行成像。</li>
</ol>
6. 纳米片的扫描电子显微镜（SEM）观察
<ol>
	<li>硅基底的等离子体刻蚀（可选）：对硅片进行等离子体刻蚀，以促进片层的吸附。将硅片放入等离子清洗机（例如 Harrick Plasma Cleaner/Sterilizer PDC-32G）的真空腔室中。抽真空至 200 mTorr，并将射频线圈功率设为 18 W（PDC-32G 的高功率设置）。刻蚀 2 分钟。</li>
	<li>在经等离子体处理的硅基底上滴加 20 μL 的肽素片层溶液，静置 3 分钟。用 Kim-wipe 纸的尖端吸除多余溶液。再用移液器在表面滴加 20 μL 水，再次吸除多余液体，以去除缓冲液和盐分。重复此步骤 4 次。</li>
	<li>或者，将肽素片层溶液对水进行透析，以去除缓冲液和盐分。在经等离子体处理的硅基底上滴加 20 μL 透析后的片层溶液，然后让样品在空气中自然干燥。</li>
	<li>使用扫描电子显微镜（例如 Zeiss Gemini Ultra-55 Analytical Scanning Electron Microscope），配备镜内探测器，在 1 kV 至 5 kV 的电子束能量下对片层进行成像（图 3）。</li>
</ol>
7. 安全注意事项：
<ol>
	<li>二甲基甲酰胺和二氯甲烷被合理怀疑为致癌物。</li>
	<li>N,N'-二异丙基碳二亚胺、4-甲基哌啶和溴乙酸对皮肤、眼睛和呼吸道有害。应在通风橱内谨慎使用。若吸入或经皮肤吸收可能具有毒性，且暴露可能导致过敏反应。空容器仍残留产品（液体/蒸气），在移出通风橱前应彻底冲洗。</li>
	<li>三氟乙酸（TFA）是一种强酸，对上呼吸道、眼睛和皮肤具有极强的腐蚀性。TFA还具有挥发性，浓溶液必须始终保存在通风橱内，以避免造成呼吸道损伤。操作TFA溶液时应使用适当的个人防护装备，并保持谨慎。一旦手套接触TFA，应立即更换，并及时清理任何泄漏物。</li>
</ol>
8. 代表性结果：
本部分描述了一种序列特异性的36聚肽模拟物链的合成、表征与纯化，该肽模拟物链可折叠形成高度有序的纳米片层3（图1）。
在100 mg Rink酰胺树脂上合成了嵌段电荷肽模拟物H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2。所有取代反应均使用2 M胺溶液，其中第1-18位残基反应时间为60分钟，第19-36位残基反应时间为120分钟。叔丁基β-丙氨酸盐酸盐被转化为游离碱（见讨论部分），而苯乙胺和Boc-乙二胺则直接使用。树脂使用95%三氟乙酸（TFA）、2.5%三异丙基硅烷、2.5%水的混合溶液裂解2小时。蒸发除去TFA后，得到约180 mg黏稠油状物，将其重新溶解于6 mL乙腈:水（1:1, v/v）中。通过分析型反相高效液相色谱（RP-HPLC）和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI）确认产物纯度（图4）及目标分子量的存在：RP-HPLC条件为C18柱（5 μm，50 × 2 mm），流动相为含0.1%（v/v）TFA的水-乙腈梯度洗脱（30%-80%乙腈），流速1 mL/min，温度60 °C，运行时间30分钟（图5）。
使用Vydac C18柱进行反相高效液相色谱纯化（10 μm，22 mm × 250 mm）进行，流动相为含0.1%三氟乙酸的水-乙腈溶液，乙腈浓度在60分钟内从30%梯度升至60%，流速为10 mL/min。每次色谱运行上样量为60 mg粗产物。根据分析型反相高效液相色谱（RP-HPLC）的纯度结果（图4），合并相应馏分，冷冻干燥后得到产物 ˜80 mg 的絮状白色粉末。
通过基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI）确认纯化的阻断电荷肽模拟物分子量。取1 μL浓度为100 μM的纯化肽模拟物（溶于乙腈:水1:1（v/v）溶液中），与1 μL基质溶液（5 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于乙腈:水1:1（v/v）并含0.1%三氟乙酸）混合，取1 μL混合液点样于MALDI靶板上。待样品自然风干后，将其放入Applied Biosystem/MDS SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF分析仪中检测。采集和处理模式设置为线性低分子量模式。将计算所得分子量输入目标质量，以自动调整延迟时间。激光强度设定为3400。实测分子量为4981.2，与理论计算值4981.74高度一致。
将冻干纯化粉末溶于DMSO中，配制成2 mM的储备液，可在4 °C下保存。按照前述方案制备片层，并通过荧光光学显微镜和扫描电镜（SEM）进行成像（图2和图3）。观察到多种形状，其特征尺寸最大可达300 μm，且明显具有较直的边缘。
<img alt="肽聚合物的化学结构；聚酰胺合成公式示意图。" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 嵌段电荷肽模拟物 H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2 的序列。该单链、嵌段电荷、两亲性多肽模拟物36聚体可自组装形成高度有序的二维纳米片3。其计算分子量为4981.74。
<img alt="晶体学荧光显微镜下的红色晶体；结构分析与形貌研究。" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 肽模拟物纳米片的荧光显微镜图像。纳米片由含10 mM Tris、100 mM NaCl、pH 8.0的20 μM肽模拟物溶液形成。样品置于含1 μM Nile Red的琼脂糖上进行成像。比例尺为100 μm。
<img alt="受折纸启发的石墨烯折叠变体；显微镜图像；结构分析。" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 肽模拟物纳米片的扫描电子显微镜图像。纳米片由含 10 mM Tris、100 mM NaCl、pH 8.0 的 20 μM 肽模拟物溶液形成。比例尺为 5 μm。
<img alt="HPLC 色谱图，保留时间与吸光度关系，显示纯化产物与粗产物分析。" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2 的分析型反相高效液相色谱（HPLC）图谱。图中显示了粗产物与纯化后产物的分析型 HPLC 图谱（色谱条件：C18 柱，5 μm，50 x 2 mm，流动相梯度 30–80%，流速 1 mL/min，运行时间 30 分钟，柱温 60°C），目标嵌段电荷型多肽类似物为 H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2。
<img alt="质谱结果，图表显示质荷比与相对强度百分比，m/z 4981.2 处有峰。" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. H-[Nae-Npe]9-[Nce-Npe]9-NH2 的 MALDI-TOF 质谱图。实测质量为 4981.2，与计算质量 4981.74 非常接近。

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<li>Mora, P. uig, Masip, I. sabel, Cortés, N. uria, Marquina, R. egina, Merino, R. amón, Merino, J. esús, Carbonell, T. eresa, Mingarro, I. smael, Messeguer, A. ngel, Pérez-Payá, E. nrique <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+from+a+positional+scanning+peptoid+library+of+in+vivo+active+compounds+that+neutralize+bacterial+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins.</a> J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).</li>
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<li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+%28%26alpha%3B+peptoids%29+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (&alpha; peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li>
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</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

应用与意义
本方案描述了一种简单且高效的肽素合成方法，以及肽素在水相中自组装形成纳米片的过程。大多数实验室均可轻松开展肽素的合成，因为该过程仅需使用廉价的材料、基本的专业知识和简便的技术4。同样，超薄且高度有序的纳米片的自组装也仅需反复倾斜装有稀释肽素水溶液的小瓶即可实现2。肽素是生物医学和纳米科学研究中极具前景的材料，因其结构稳定、合成灵活，同时具有序列特异性和高度可调性5。已有研究表明，肽素具备生物活性（如治疗剂6,7、诊断工具8、细胞内递送9-10），并可折叠形成层级化的纳米结构3, 11-14。由于其模块化合成特性，可快速构建组合肽素文库15-19，并用于广泛的功能或性质筛选。特别是这些纳米片，可作为二维展示支架、膜模拟物、生物传感器、蛋白质模拟物以及器件制备的潜在平台。鉴于可能的序列种类几乎无穷无尽，肽素研究领域正在迅速扩展。
 
多肽拟态物固相亚单体合成中的变量
由于能够从数量庞大且种类多样的单体库中进行选择20，在某些情况下，为了提高每一步的偶联效率从而提升最终产物的产率，需要对亚单体法进行适当的调整。引入未保护的杂环侧链时，需使用氯乙酸代替溴乙酸21。对于较长的肽拟物序列或亲核性较低的胺类，通常在进行约20次偶联后，需延长取代反应时间并提高胺的浓度。通过使用水浴控温的反应容器将反应体系加热至35 °C，有助于促进反应进行。对于异丙胺等高挥发性的胺类，必须注意避免其挥发损失。
以盐酸盐形式存在的胺类，例如叔丁基-β-丙氨酸盐酸盐，在用于取代反应前需先游离为游离碱。该过程可通过将胺类溶解或悬浮于二氯甲烷（DCM）中实现&tilde;5 g 胺/25 mL 二氯甲烷），并在分液漏斗中用等摩尔浓度的氢氧化钠水溶液中和。收集二氯甲烷层，并用额外的二氯甲烷洗涤水层。合并的二氯甲烷层经硫酸钠干燥后过滤至预先称重的圆底烧瓶中。通过旋转蒸发除去溶剂，得到油状产物，称重并记录产物质量。
在裂解步骤中，TFA裂解试剂混合物及裂解时间取决于所用保护基的种类和数量。裂解试剂混合物的使用原则与传统的多肽去保护裂解方法类似1。通常情况下，对于不含保护基或仅含少量对酸高度敏感的保护基（如BOC、三苯甲基）的序列，需孵育10分钟。对于含有较难去除的保护基（如叔丁酯、Mtr、Pbf）或含有多个保护基的序列，建议孵育2小时，以确保每条链完全去保护。粗品肽类似物通常可溶于乙腈:水 1:1（v/v）溶液中，但对于侧链整体疏水性较高的肽类似物，常需使用更高比例的乙腈。

<table><tbody><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-DX1726P-1</td><td>99+%</td></tr><tr><td>N-甲基吡咯烷酮</td><td>VWR</td><td>BDH1141-4LP</td><td>99%</td></tr><tr><td>溴乙酸</td><td>Acros Organics</td><td>200000-106</td><td>99%</td></tr><tr><td>4-甲基哌啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M73206</td><td>96%</td></tr><tr><td>N,N&amp;rsquo;-二异丙基碳二亚胺</td><td>Chem-Impex International</td><td>001100</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>EMD Millipore</td><td>EMD-DX0835</td><td>ACS 级</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-AX0145P-1</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>99%</td></tr><tr><td>三异丙基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781-10G</td><td>用于 TFA 裂解</td></tr><tr><td>1,2-二氯&amp;#8211;乙烷</td><td>JT Baker</td><td>JTH076-33</td><td>用于玻璃反应容器的硅烷化处理</td></tr><tr><td>苯乙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>407267-100ML</td><td>&amp;gt;99.5% 疏水性侧链胺</td></tr><tr><td>Boc-乙二胺</td><td>CNH Technologies</td><td>C-1112</td><td>阳离子型侧链胺</td></tr><tr><td>叔丁基-β-丙氨酸盐酸盐</td><td>Chem-Impex International</td><td>04407</td><td>阴离子型侧链胺</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982-10X10MG</td><td>用于 MALDI 基质</td></tr><tr><td>尼罗红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19123-10MG</td><td>用于荧光成像</td></tr><tr><td>二氯二甲基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80430-500G-F</td><td>用于玻璃反应容器的硅烷化处理</td></tr><tr><td>一次性聚丙烯烧结柱</td><td>Applied Separations</td><td>2416</td><td>6 mL 聚丙烯柱，配有 20 mm 聚乙烯烧结片</td></tr><tr><td>一次性三通鲁尔接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>31200-80</td><td>用于一次性手动合成反应容器的旋塞阀</td></tr><tr><td>鲁尔锁环</td><td>Cole-Parmer</td><td>45503-19</td><td>1/4&quot;&amp;#157; 接头，用于一次性手动合成反应容器</td></tr><tr><td>鲁尔接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>45500-20</td><td>1/4&quot;&amp;#157; 接头，用于一次性手动合成反应容器</td></tr><tr><td>一次性聚丙烯移液管</td><td>VWR international</td><td>16001-194</td><td>用于 TFA 转移</td></tr><tr><td>鲁尔锁塑料注射器</td><td>National Scientific</td><td>S7515-5</td><td>6 mL 注射器</td></tr><tr><td>1 液量盎司玻璃小瓶</td><td>VWR international</td><td>66011-041</td><td>配有酚醛模制螺旋盖和聚乙烯覆面纸浆衬垫</td></tr><tr><td>20 mL 闪烁瓶</td><td>VWR international</td><td>66022-060</td><td>配有聚丙烯盖和纸浆箔衬垫</td></tr><tr><td>Secure-Seal 粘合垫片</td><td>Invitrogen</td><td>S-24736</td><td>用于荧光成像</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63411</td><td>用于荧光成像</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR international</td><td>48366-067</td><td>用于荧光成像</td></tr><tr><td>4&amp;#8221; 硅晶圆</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16007</td><td>预先切割为 5×7 mm 芯片</td></tr><tr><td>0.45 滤膜</td><td>VWR international</td><td>28143-924</td><td>用于 HPLC。&lt;br/&gt;PTFE 膜</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>BD Biosciences</td><td>212272</td><td>用于荧光成像</td></tr><tr><td>SPE 真空萃取装置</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57044</td><td>SPE 真空萃取装置示例</td></tr><tr><td>烧结玻璃容器</td><td>Ace glass</td><td>6402-12</td><td>孔隙度 C 烧结片</td></tr><tr><td>等离子清洗/灭菌仪</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td>用于 SEM 前处理硅芯片的等离子清洗仪示例</td></tr></tbody></table>

固相亚单体合成肽模拟物聚合物及其自组装形成高度有序纳米片

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

肽模拟物是一类新型的仿生性非天然序列特异性杂合聚合物，具有抗蛋白酶降解能力、显著的生物活性，并可折叠形成高级有序的纳米结构。在结构上与肽类似，肽模拟物为聚N-取代甘氨酸，其侧链连接于氮原子而非α-碳原子。由于合成简便且结构多样，可用于验证驱动分子设计的基本原理 从头合成 新型生物活性与纳米结构材料的设计与工程化
在此介绍一种简单的手动肽拟态物（peptoid）合成方案，可高效合成长链多肽拟态物（最长可达50聚体），产率优异。该方法仅需基本实验设备、常规操作技术（如液体转移、过滤）以及市售试剂，使肽拟态物成为众多研究人员可及的工具。肽拟态物骨架通过“单体-亚单体法”逐个单体延伸，该方法包含两步单体加成循环：酰化与取代。首先，溴乙酸经活化后 原位 使用N,N'-二异丙基碳二亚胺将树脂结合的仲胺酰化。随后，伯胺通过亲核取代溴化物引入侧链。该两步循环反复进行，直至达到目标链长。此两步循环的偶联效率通常超过98%，可实现长达50个残基的多肽类似物合成。由于可直接使用数百种易得的伯胺，亚单体法能够精确构建高度可调、序列精确且化学多样性丰富的多肽类似物。
 
由于具有合成灵活、结构稳定以及在原子水平上有序排列的特点，肽模拟物（peptoids）正逐渐成为纳米生物科学研究中一种多功能的仿生材料。最近，研究人员已成功实现了一种单链、两亲性且富含信息的聚肽模拟物折叠形成高度有序的纳米片层结构。该肽模拟物由36个单体组成，仅包含三种 commercially available 的单体：疏水性、阳离子性和阴离子性单体。其中，疏水性的苯乙基侧链埋藏在纳米片层的内部核心，而带电荷的氨基和羧基侧链则排列在亲水性的表面。这种肽模拟物纳米片层可作为膜模拟物、蛋白质模拟物、器件制备以及传感器的潜在平台。本文描述了肽模拟物的合成方法、片层形成过程及显微成像技术，为未来肽模拟物纳米片层的设计提供了简便可行的技术路径。

本文概述了一种简单且通用的手动肽拟态物合成方法，该方法仅需基本设备和市售试剂，可在大多数实验室中轻松实现肽拟态物的合成。文中详细描述了由36个单体组成的两亲性肽拟态物的合成、纯化与表征过程，并阐述了其自组装形成高度有序纳米片的特性。

肽模拟物是一类新型的仿生性非天然序列特异性杂合聚合物，具有抗蛋白酶降解能力，并表现出显著的生物活性，以及……

本实验的总体目标是描述一种简单高效的固相多肽合成方法，以及多肽在水相中自组装形成高度有序纳米片层的过程。从结构上看，此类多肽与多肽类似，属于取代的甘氨酸聚合物，其侧链连接在氮原子上，而非α-碳原子上。该过程首先通过亚单体方法合成特定的多肽序列。亚单体法包含两个简单的化学步骤，依次将每个单体引入链中。第一步，将连接在固相载体上的胺进行溴乙酰化。第二步，用伯胺取代溴离子。重复这些步骤直至达到所需的链长。链延伸完成后，将肽从固相载体上裂解下来，所得的粗肽油通过高效液相色谱纯化，并进行表征，以启动肽向纳米片的自组装。在玻璃小瓶中配制肽的稀水缓冲溶液，并轻轻混合。作为最后一步。在显微镜下观察纳米片。结果表明，通过两个简单化学步骤的迭代循环，可获得一种能自发自组装成纳米片的序列特异性聚合物。肽是一类新型的仿生聚合物，其性质介于蛋白质与传统聚合物之间。它们像传统聚合物一样坚固且具有良好的合成可调性，同时也像蛋白质和DNA一样具有高度可调性和序列特异性。多肽正作为一种先进材料被用于解决生物医学和材料科学中的关键问题，例如生物活性药物的筛选或人工蛋白质的设计。多肽的主要优势包括精确的序列控制、种类极其丰富的构建单元、高效的合成过程以及对蛋白酶的稳定性。本文概述了一种通用的多肽手动合成方法，该方法仅需使用基本设备和市售试剂，可在大多数实验室中便捷地完成多肽的合成。直观展示合成步骤至关重要，可为初涉固相合成领域的研究人员提供宝贵的参考。本文首次详细描述了两亲性肽（36个氨基酸残基）的纯化与表征过程，以及其自组装形成高度有序纳米片的特性。请首先按照书面实验方案中的说明搭建实验装置。以下步骤将使用玻璃反应容器进行，而非一次性聚丙烯烧结柱，以便更清晰地展示操作过程。将100毫克R酰胺树脂加入烧结反应容器后，加入2毫升二甲基甲酰胺（DMF）溶胀树脂，并通过鼓泡搅拌10分钟。随后在真空条件下排去溶液，以分离溶胀后的树脂。接下来，加入1 mL含20%三氟乙酸的DMF溶液以脱去FMOC保护基团。振荡2分钟，然后排尽溶液。重复此过程共12分钟，随后用2 mL DMF冲洗树脂，振荡15秒后排尽溶液。从第一个亚单体循环开始生长肽链，该循环包括溴乙酰化和取代两个步骤。进行溴乙酰化时，加入1毫升0.6摩尔的溴乙酸DMF溶液和86微升二异丙基碳二亚胺。振荡反应30分钟后，排尽溶液，并用2毫升DMF冲洗。接下来，加入一毫升浓度为一到二摩尔的端甲基吡咯酮胺进行置换，孵育30至120分钟。孵育结束后，排液并用两毫升DMF冲洗。随后，通过重复亚单体循环继续延长肽链。完成最后一次置换后，用两毫升DMF冲洗。随后用一个二氧六环甲烷洗涤柱盖封闭，并将反应容器保存至进行裂解。开始裂解时，在通风橱内并佩戴适当的个人防护装备，将所有干燥的树脂转移至一个20毫升的闪烁玻璃小瓶中，加入4毫升三氟乙酸（TFA）裂解混合液至闪烁玻璃小瓶中，并盖上盖子。在室温下紧密搅拌10分钟至2小时。或者，使用旋转摇床混合溶液。通过一次性聚丙烯烧结滤筒将树脂过滤，收集三氟乙酸（TFA）裂解液至一个新的已称重的20毫升闪烁玻璃小瓶中。接着，加入1毫升新鲜裂解试剂冲洗树脂，以收集残留的肽段。重复此步骤，冲洗两次。通过吹入温和的氮气流或使用生物电荷装置蒸发三氟乙酸（TFA）。使用V 10蒸发仪，将粗产物溶于6毫升体积比为1:1的乙腈和水混合溶液中。然后将样品冷冻并冻干。在第二次冻干后，应重复此过程一次。通过霉菌分析型HPLC和/或电喷雾LCMS联用，记录粗产物的重量，并将其作为干燥粉末在-20摄氏度下保存。通过按照文中所述步骤操作，可确定粗产物的纯度以及是否含有目标分子量。随后可根据书面流程采用反相制备型高效液相色谱法（reverse phase prep HPLC）对粗肽混合物进行纯化。本部分描述了由单一链序列特异性两亲性36肽（36 me peptide）形成片层结构的实验方案。多肽链合成、纯化并冻干后，将所得白色粉末溶解于DMSO中，配制成2毫摩尔的储备液。接着，取一个Dr.Glass文件，用于配制20微摩尔的多肽溶液。首先，加入445微升的Milli-Q水和50微升的10倍成膜缓冲液。涡旋小瓶以混匀。然后加入5 µL的2 mM肽储备溶液，轻轻混匀。通过轻轻搅动稀释的水相肽溶液，形成片状结构。将带盖的玻璃小瓶从水平位置缓慢倾斜至直立位置。此操作可实现轻微振荡，同样可得到片状产物。然而，对于许多高质量的片状物而言，所得片状物往往较小，且直边较少。使用试管旋转仪或定制的摇床，将玻璃小瓶围绕水平轴缓慢旋转一天，以对纳米片进行荧光染色；向100微升纳米片溶液中加入1微升100微摩尔的尼罗红，使尼罗红的终浓度为1微摩尔。尼罗红是一种环境敏感性染料，当其位于疏水环境时，荧光强度会增强。接下来，将1%琼脂糖溶液溶于热水中，并倒入塑料培养皿中。确保 aros 溶液厚度约为八分之一英寸，并将其静置在平坦表面上冷却。待 aros 凝固后，用刮刀切割成一厘米见方的小块。然后将切好的小块转移至载玻片上，在同一平面位置取一微升片层溶液滴加到 aros 样品上。两分钟后，aros 应吸收缓冲液，使片层停留在表面。在15分钟内对片层进行成像。或者，若需对片层和溶液同时成像，可在载玻片上直径为20毫米、厚度为0.12毫米的垫圈内加入15微升溶液。用盖玻片覆盖样品，并在几天内完成成像，以进行纳米片的扫描电镜观察。首先对硅片进行等离子体刻蚀，以促进纳米片的吸附。然后将20 µL的肽纳米片溶液滴加到经等离子体处理的硅基底上，静置3分钟后，用Kimwipe的尖端吸除多余溶液，再向表面滴加20 µL水，再次吸除多余液体，以去除缓冲液和盐分。或者，将肽片溶液对水进行透析，以去除缓冲液和盐分。在此情况下，可将20微升透析后的片状溶液滴加到经等离子体处理的硅基底上，并使其自然风干。待片状溶液在经等离子体处理的硅基底上完全干燥后，可使用镜内检测器在1千伏至5千伏的电子束能量下通过扫描电镜（SEM）对样品进行成像。对一种具有序列特异性的36个残基的嵌段电荷肽进行了合成、表征与纯化，该肽可折叠形成高度有序的二维纳米片。在合成该36残基嵌段电荷肽时，所用的胺类包括乙二胺、苯乙胺和叔丁基-β-丙氨酸。合成完成后，粗肽通过95%的水性三氟乙酸（TFA）从树脂上裂解下来。收集并蒸发三氟乙酸溶液后，通过反相高效液相色谱纯化粗制的36个甲硫氨酸区段电荷肽。随后通过质谱法确认纯化后区段电荷肽的分子量。观测到的质量数4981.2与计算值4981.74非常接近。将冻干粉末溶解于DMSO中，配制成2毫摩尔的储备液，并在4°C下保存。按照前述方案制备样品片，并使用荧光光学显微镜进行成像。观察到多种形状，其特征尺寸最大可达 300 微米，并且显著的直边十分明显。扫描电镜（SEM）也用于对这些片层进行成像，同样显示出明显的直边。本视频介绍了一种简单高效的固相合成多肽及其在水相中自组装形成纳米片层的实验方案。由于有数百种氨基酸基本单元可直接获得并可用于本方案，多肽所能实现的设计空间实际上几乎是无限的。肽类因其合成灵活性、稳定性和有序性，成为生物医学和纳米科学研究中极具前景的材料。特别是在原子水平上，这些纳米片可作为二维展示支架、膜模拟物、生物传感器、蛋白质模拟物以及器件制备的潜在平台。操作三溴化磷、乙酸和溴乙酸等腐蚀性试剂具有极高危险性，为防止受伤，所有反应均应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备。

solid-phase-submonomer-synthesis-peptoid-polymers-their-self-assembly

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科研

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Bioengineering

生物工程

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学习固相Submonomer法合成序列特异性peptoid聚合物，并探索其自组装形成高度有序纳米片的方法。该技术适用于纳米科学、生物医学和材料工程研究。

固相亚单体合成肽模拟物聚合物及其自组装形成高度有序纳米片

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