Name: 自组装多胺基多肽 Amphiphiles (PPAs) 及相关生物材料的简易合成协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习多胺基多肽两亲分子(PPAs)的简易合成方法，利用2-氯三苯甲基氯树脂和固相合成技术制备自组装生物材料。该方法无需保护基团即可构建杂化肽两亲分子，适用于药物递送和生物成像研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本项目由内布拉斯加大学医学中心（启动资金，MC-S）；NIH-COBRE，5P20GM103480（T. Bronich）；以及美国化学会，PRF# 57434-DNI7（MC-S）资助。

1. 聚磷酸酯合成的通用方案
<ol>
	<li>计算合成规模（通常以 mmol 为单位）。该规模基于目标多肽酸（PPA）的质量。需注意，固相肽合成（SPPS）的反应效率随着氨基酸序列长度的增加而逐渐降低，因此难以精确计算实际反应效率。</li>
	<li>根据树脂的载量计算所需树脂的重量。载量信息可在树脂容器或分析方案上找到，单位为 mmol/g。可使用以下公式计算树脂的重量：</li>
	<li>准确称取2-氯三苯甲基氯树脂（本实验中载量约为0.85 mmol）</li>
	<li>将树脂置于规格如下的一次性烧结玻璃合成容器中：容量 – 50 mL，烧结玻璃盘直径 – 25 mm，孔隙度 – 中等。</li>
	<li>向树脂中加入15 mL二氯甲烷（DCM）。</li>
	<li>将合成容器固定在可调速机械摇床（烧瓶摇床/搅拌器）上，并将容器调至45°角（或水平）以最大程度地增强振荡效果。</li>
	<li>让树脂珠溶胀15分钟。溶胀可提高反应产率，因为它有助于分子扩散并增加对活性位点的可及性，从而提升偶联效率。</li>
	<li>加入8当量（以0.25 mmol为基准，则为2 mmol）所需多胺（Spermine、Spermidine、Diethylenetriamine、1,3-diaminopropane） 等等。) 加入树脂中，反应5小时。 
	注意：较短的反应时间会降低产率。</li>
	<li>进行 Kaiser 检测（参见 材料表）以确认多胺成功连接至树脂。伯胺成功连接会产生紫色/蓝色，表明存在游离胺。</li>
	<li>使用4当量的1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基（Dde）溶于无水甲醇（15 mL）中，过夜振荡反应混合物以保护伯胺基团11. 
	注意：反应时间较短会降低产率。</li>
	<li>进行凯撒试验。若树脂珠无蓝色出现，则表明伯胺保护成功。若伯胺保护未成功，请重复上一步操作。</li>
	<li>除去二氯甲烷，并用二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合液（2:1，15 mL）洗涤树脂两次。</li>
	<li>将20当量（5 mmol）二叔丁基二碳酸酯（Boc）溶于二氯甲烷（DCM，20 mL）中，反应持续3小时。</li>
	<li>进行氯醌试验（参见 材料表）以确认仲胺的完全保护。阳性结果（已保护）呈无色或淡黄色。游离的仲胺呈深绿色/蓝色，而伯胺则呈红色。</li>
	<li>除去溶剂混合物，并用二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合液（2:1，15 mL）洗涤两次。</li>
	<li>加入10 mL含2%水合肼的DMF溶液，振荡反应1小时。</li>
	<li>进行凯撒试验以确认伯胺的脱保护反应成功。</li>
	<li>以与书写或绘制顺序相反的序列添加所需的氨基酸。肽链通常从N端向C端绘制，但其合成方向相反，即从C端到N端。例如，若要制备含有核心肽序列-GLFD-的PPA，应依次添加天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）、亮氨酸（L），最后添加甘氨酸（G）。 
	注意：对于大多数氨基酸，以下偶联混合液适用于与负载多胺的树脂进行连接。
	<ol>
		<li>将4当量（1 mmol）Fmoc保护的氨基酸、3.95当量的1-羟基苯并三唑-六氟磷酸盐（HBTU）和15当量的N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）混合。</li>
		<li>用二氯甲烷与DMF的混合液（1:1，15 mL）溶解，超声处理混合液2分钟（直至完全溶解）。</li>
		<li>等待额外的3–5分钟，以确保氨基酸上的羧基被充分活化。</li>
		<li>将反应混合物加入反应容器中，在室温下反应2-4小时。 
		注意：我们发现以下试剂可作为 HBTU 的有效替代品（通常需要更少的氨基酸和缩合剂）：COMU、PyBOP、HATU、DIC/Oxima。</li>
		<li>进行凯撒试验以确认偶联成功。</li>
		<li>通过向氨基酸中加入20%的4-甲基哌啶（10 mL）DMF溶液，脱除Fmoc保护基。重复操作两次，每次振荡反应混合物15分钟。 
		注意：去除Fmoc的一个高效替代方法是使用哌嗪/DBU12.
		<ol>
			<li>每次添加之间用二氯甲烷（15 mL）洗涤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行凯撒试验以确认氨基酸的脱保护反应成功。</li>
		<li>用 DMF（10 mL）洗涤树脂两次，每次 5 分钟，以彻底去除 4-甲基的残留；最后用 DCM（10 mL）洗涤 10 分钟。</li>
		<li>通过依次重复偶联和脱保护步骤，加入所有剩余的氨基酸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后，在连接完所有必需的氨基酸后，将疏水性尾部与多胺-肽结构的最后一个氨基酸进行偶联：
	<ol>
		<li>将10当量的目标羧酸官能团加入到溶于DCM与DMF混合液（1:1，20 mL）的9.5当量HBTU和12当量DIPEA中。 
		注意：某些尾段可能需要不同比例的溶剂（通常增加二氯甲烷的比例）或添加其他溶剂，如N-甲基吡咯烷酮（NMP）。</li>
		<li>将混合物超声处理5–10分钟，直至完全溶解（我们观察到尾部完全溶解所需时间可能更长），然后加入容器中。 
		注意：对于含有多个反应位点的尾链，在偶联前需要对其进行保护。</li>
		<li>至少反应5小时，但建议过夜反应以获得最高产率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 固相载体上PPA的裂解
此步骤的目的是将PPA从树脂上裂解下来，并去除氨基酸和多胺残基上的Boc保护基团。
<ol>
	<li>用 DMF 洗涤树脂（8 mL，2 分钟），再用 DCM 洗涤两次（每次 8 mL，5 分钟）。每次添加洗涤液前，将容器中的溶剂排尽。最后一次洗涤完成后，在真空条件下干燥树脂 15 分钟。</li>
	<li>使用以下混合比例配制裂解溶液：28:1:1 三氟乙酸（TFA）: H2O：三异丙基硅烷（TIPS）。配制15 mL裂解鸡尾酒溶液时，将14 mL三氟乙酸（TFA）与0.5 mL H2O 和 0.5 mL TIPS。</li>
	<li>将此裂解液加入树脂中，在室温下振荡反应2–4小时。</li>
	<li>将溶液收集至25或50 mL的圆底烧瓶中。</li>
	<li>浓缩 TFA 在真空中 在40 °C下加热混合物，同时使用旋转蒸发仪在减压条件下浓缩至1–2 mL（温度不得超过55 °C，以避免PPA分解）。</li>
	<li>蒸发后，将所得的TFA溶液（逐滴）加入含有无水冷乙醚（15 mL）的圆底烧瓶中。此时PPA将立即沉淀析出。</li>
	<li>此外，向原先浓缩TFA的烧瓶中加入无水冷乙醚（5 mL）。</li>
	<li>超声处理该烧瓶以回收更多固体，并与步骤 2.6 中的乙醚溶液合并。 
	注意：可使用少量二氯甲烷（DCM）清洗转移用移液管。避免在操作过程中引入N,N-二甲基甲酰胺（DMF），因其易形成凝胶状物质。</li>
	<li>将烧瓶（加盖）放入冰箱，静置过夜，以最大程度促进沉淀。</li>
	<li>使用烧结玻璃砂芯漏斗通过真空过滤收集沉淀物。理想的孔径为细孔或中孔。</li>
	<li>用冷乙醚（5–10 mL）洗涤沉淀物两次，以去除残留的有机物。</li>
</ol>
3. 使用基质辅助激光解吸电离干燥液滴法鉴定粗产物
<ol>
	<li>正离子模式下分析用基质的制备：
	<ol>
		<li>为开始使用基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱进行分子量分析，取10至20 mg的α-氰基-4-羟基肉桂酸加入微量离心管中。</li>
		<li>加入含0.1%三氟乙酸（TFA）的水/乙腈溶液（1:1，1.0 mL），并通过涡旋充分混匀。 
		注意：该基质适用于带正电荷的肽段。MALDI负离子模式操作类似，但需使用含0.1%氨水的9-氨基吖啶作为基质，并以氨水作为溶剂添加剂。</li>
		<li>取1–2 µL样品点加至MALDI不锈钢靶板上，空气中自然干燥；再加入1–2 µL基质溶液，再次干燥。 
		注意：靶板表面具有圆形标记，呈网格状排列，有助于定位特定点样位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用MALDI仪器分析样品以确认其身份。电喷雾电离（ESI）是验证PPA身份的有效替代方法。</li>
</ol>
4. 使用制备型反相高效液相色谱（HPLC）纯化PPA
<ol>
	<li>将PPA沉淀物溶解于最小量的乙腈和水中。
	<ol>
		<li>经验法则：将100 mg干燥粗品PPA溶解于少于5 mL的乙腈和水混合溶剂中。疏水性更强的PPA可能需要更高比例的乙腈才能溶解，且总体可能需要更大的溶剂体积，具体取决于PPA的净电荷（表1）。</li>
		<li>若未能完全溶解，可加入1%三氟乙酸（TFA）（溶于乙腈或H2O）。也可加入少量其他相容性溶剂，如二甲基亚砜、甲醇或异丙醇（含量限制在5%以内）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶剂</td>
			<td colspan="2">带正电荷的PPA</td>
			<td colspan="2">带负电荷的PPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">含0.1% TFA的水溶液</td>
			<td colspan="2">含0.1% NH3的水溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">含0.1% TFA的乙腈溶液</td>
			<td colspan="2">含0.1% NH3的乙腈溶液</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：溶剂体系。 针对带正电荷和负电荷的PPA推荐的溶剂体系。
<ol start="2">
	<li>使用探头超声仪对PPA进行超声处理，以48%振幅进行20分钟、每次10秒的脉冲处理；或者在超声清洗槽中处理2-3小时。</li>
	<li>随后，先用0.45 μm针筒过滤器过滤，再用0.20 μm聚四氟乙烯（PTFE）针筒过滤器过滤。PPA溶液应澄清，不含任何颗粒物质。
	<ol>
		<li>如果过滤困难，可延长超声时间。强烈建议在针筒过滤后立即进行PPA溶液的纯化，因为长期储存可能导致其聚集或形成凝胶，从而需要重新超声，甚至重新过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在纯化过程中及纯化后，使用HPLC级溶剂，或通过0.25 μm针筒过滤器/膜过滤的溶剂。 
	注：纯化PPA最常用的溶剂条件为H2O与ACN的梯度洗脱体系。</li>
	<li>本方案应使用标准的反相高效液相色谱（HPLC）仪器，需配备洗脱梯度程序控制器、二元溶剂输送系统、可在220 nm和254 nm波长下检测的紫外检测器，以及可编程的组分收集器。最大流速应达到50 mL/min。</li>
	<li>使用C-18反相色谱柱进行分离。可根据待纯化固体的质量及PPA的净电荷，选用以下尺寸的色谱柱（表2）。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PPA 电荷</td>
			<td>颗粒大小</td>
			<td>色谱柱尺寸</td>
			<td>粗提 PPA 质量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ ve 电荷</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160; ve 电荷</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 30 mm</td>
			<td>170 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ ve 电荷</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 21.2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160; ve 电荷</td>
			<td>5 μm</td>
			<td>150 x 21.2 mm</td>
			<td>90 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：建议的色谱柱参数：C18反相高效液相色谱柱的柱尺寸、颗粒大小及每次进样的最大载样量
<ol start="7">
	<li>根据色谱柱的载样量和高效液相色谱仪进样环的体积确定PPA的进样体积。按照表3中的设置运行高效液相色谱梯度洗脱程序（洗脱时间为40分钟）。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间</td>
			<td>溶剂 A（乙腈）</td>
			<td>溶剂 B（水）</td>
			<td>流速 (mL/min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
			<td rowspan="5">流速取决于色谱柱填料及其尺寸。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35</td>
			<td>95%</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38</td>
			<td>100%</td>
			<td>0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>5%</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：建议的梯度： 建议的反相梯度，显示在一段时间内水与乙腈的相对组成。流速将取决于色谱柱的规格。
<ol start="8">
	<li>使用 MALDI 分析收集在各个试管中的组分，并确定哪个（或哪些）试管含有 PPA。通过研究每个试管中检测到的分子量来评估。
	<ol>
		<li>在分析型 HPLC 上检测各组分的纯度。使用配备在 220 nm 处设置的紫外检测器的 HPLC 梯度系统。</li>
		<li>如果存在杂质，需通过 HPLC 进行额外一轮纯化。上述用于制备型 HPLC 的梯度可通过在线柱转换软件缩小比例后用于分析型 HPLC。每个组分在进行物理表征或生物学评价前，纯度必须 ≥95%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将收集的组分转移至一个大容量的圆底烧瓶或蒸发烧瓶中，去除全部乙腈和大部分水。最终的 PPA 溶液体积不应超过 10 mL。</li>
	<li>将此浓缩液转移至一个 50 mL 离心管中。请注意，PPA 是类似去污剂的物质，因此在溶剂蒸发过程中会产生气泡。我们发现加入乙醇可减少气泡的形成。</li>
	<li>对浓缩液进行真空浓缩。在真空蒸发过程中，大量 PPA 可能会黏附在容器壁上。可通过反复用 HPLC 级水冲洗瓶壁来回收这部分物质。浓缩后的 PPA 溶液与冲洗液的总体积不应超过 30 mL。</li>
	<li>将水溶液置于一个 50 mL 管中。</li>
	<li>用液氮对 PPA 溶液进行速冻： 
	注意：速冻可形成较小的冰晶，从而在冻干过程中更快升华。此外，缓慢冷冻可能导致自组装的超分子结构形成。另一种可选但不推荐的方法是逐步在 -80 °C 冰箱中冷冻，或使用干冰加丙酮混合物进行冷冻。
	<ol>
		<li>在将离心管放入冻干机前，应刺破或松开管盖，以使样品中的水分能够逸出并被冷凝单元收集。将冻干机设置为 -54 °C 和 0.016 mbar。 
		注意：也可选择取下管盖，并在管口覆盖一层擦拭纸（用橡皮筋固定）。此外，我们发现将样品倾斜冷冻或将冰打碎成小块，可因增大表面积而实现更快、更充分的冻干。</li>
		<li>如果固体开始融化，可能表明样品中残留有有机溶剂（通常为乙腈）。应重复冷冻步骤，并评估冻干状态。</li>
		<li>如果融化现象持续存在，有两种可能的解决方案：
		<ol>
			<li>将样品分为两份（分别置于两个管中），加水稀释后再次冷冻。此方法不宜频繁使用，因为大量有机溶剂可能损坏设备。</li>
			<li>或者，将样品置于烧瓶中，在真空下进一步蒸发去除有机溶剂。直接对液态样品进行冻干通常会导致暴沸和 PPA 化合物的损失。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. PPAs 的储存
<ol>
	<li>将PPA储存于-20 °C，管盖拧紧并用Parafilm密封，试管上贴好适当标签。</li>
	<li>使用前，将PPA置于真空室中恢复至室温，以避免水蒸气在PPA上冷凝。</li>
</ol>

<ol><li>Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+x-ray-triggered+crystallization+at+long+range+in+self-assembling+filament+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks.</a> Science. 327, 555-559 (2010).</li>
<li>Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+supramolecular+rigidity+of+peptide+fibers+through+molecular+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).</li>
<li>Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+biomolecular+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of biomolecular soft matter.</a> Faraday Discussions. 166, 9-30 (2013).</li>
<li>Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterase-activated+release+of+naproxen+from+supramolecular+nanofibres%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres.</a> Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).</li>
<li>Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMata%2C+A+%22Nanotechnology+in+Regenerative+Medicine%22">Nanotechnology in Regenerative Medicine</a>. , Springer. 39-49 (2012).</li>
<li>Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+Polyamine-Based+Peptide+Amphiphiles+with+Tunable+Morphology+and+Physicochemical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+bioscience%22%5BJournal%5D)">Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties.</a> Macromolecular bioscience. 17, (2017).</li>
<li>Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+biophysicochemical+interactions+at+the+nano-bio+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface.</a> Nature Materials. 8, 543(2009).</li>
<li>Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+cationic+lipid-based+nanoparticles+facilitate+endosomal+escape+and+reduction-triggered+cytosolic+siRNA+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release.</a> Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).</li>
<li>Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-immolative+polycations+as+gene+delivery+vectors+and+prodrugs+targeting+polyamine+metabolism+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer.</a> Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).</li>
<li>Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-containing+amine+oxidases+contribute+to+terminal+polyamine+oxidation+in+peroxisomes+and+apoplast+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biology. 13, 109(2013).</li>
<li>Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0040403996003449">Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates.</a> Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).</li>
<li>Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/ra/c5ra23441g">Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis.</a> RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).</li>
<li>Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+polyamine+metabolism+and+function+in+cancer+and+other+hyperproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373(2007).</li>
<li>Wuts, P. G. M., Greene, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWuts%2C+PGM+%22Protection+for+the+Amino+Group.+In+Greene%27s+Protective+Groups+in+Organic+Synthesis%22">Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis</a>. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).</li>
<li>Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+racemization+and+aspartimide+formation+in+microwave-enhanced+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突

本文所述方案可用于合成PPA以及PA和相关肽类分子（如杂合PA-肽素）。尽管使用固相肽合成法（SPPS）合成肽类分子是一种常规操作，但合成含有生物归巢分子的肽类则尤为困难。多胺类物质如精胺、亚精胺、二乙烯三胺， 等等。，可作为靶向癌细胞的归巢分子13PPA 可以自组装成具有多种形态的纳米结构6其正电荷还有助于延长循环时间（由于内体逃逸作用）并产生不同于传统聚酰胺（PA）的代谢特征。然而，由于分子中存在伯胺和仲胺，合成聚酰胺（PPA）及其类似物可能面临特殊挑战。本文所展示的合成策略通过合理使用正交保护基团克服了这一难题。Dde分子可选择性地仅与伯胺发生反应。11另一方面，Boc 会无差别地与伯胺和仲胺发生反应，因此只能在伯胺被保护后才能加入。需要说明的是，除 Boc 外，也可使用其他保护基。例如，与乙酸酐反应可永久性地乙酰化仲胺（该基团在裂解过程中不会被去除）；同样，使用三氟乙酸酐可获得对碱敏感的保护基团，而苄基氨基甲酸酯（benzylcarbamate）则可提供可通过 H 还原...

自组装肽两亲分子（PAs）是一类生物材料，通常包含以下结构片段：（a）亲水性头部，（b）连接区，和（c）疏水性尾部。文献中描述的大多数PAs具有由带电荷或极性氨基酸残基组成的亲水性头部。1,2,3,4. 聚酰胺类材料在生物医学领域已得到广泛应用，包括药物递送、疾病诊断、再生医学， 等等。5根据其氨基酸序列，肽两亲物（PAs）可形成多种纳米结构，包括球形胶束和纳米纤维。我们近期报道了一类基于杂化聚胺的肽两亲物，称为PPAs6这些生物材料的形态、自组装动力学及其代谢降解行为被发现与其溶解性头基团相关。此外，PPA纳米结构在测试浓度下对哺乳动物细胞（MiaPaCa2和HeLa细胞系）未表现出毒性。基于PPA的纳米载体是颇具吸引力的药物递送系统，原因在于：（1）已证实癌细胞中多胺的摄取与代谢增强；（2）阳离子型纳米结构可实现内体逃逸。7,8，这会导致其在细胞内的循环和滞留时间更长；（3）与PA相比，应具有明显不同的代谢特征，例如，对人体内存在的蛋白酶具有更高的稳定性（尽管可能对其他酶类，如胺氧化酶敏感）9,10此外，根据单个PPA分子的长度和电荷不同，PPA可表现出多样的形态、理化性质、纳米颗粒刚度以及组装动力学特性。6本文中，我们描述了一种用于合成、鉴定和纯化PPA的详细方案，该方案也可应用于PA或类似杂交肽分子的制备。
由于多胺通常无法在市场上获得其保护形式，且由于在将多胺与氨基酸及其他分子偶联时，保护其伯胺和仲胺至关重要，因此我们概述了实现其保护的合成步骤。本方案的总体目标是提供一种将多胺与氨基酸偶联的简便方法。多胺缺乏羧基，因此无法与Rink Amide或Wang树脂偶联。建议在合成方案中使用2-氯三苯甲基氯等树脂。PPA合成的主要挑战在于多胺分子中存在伯胺和仲胺官能团。在本研究中，我们保护了多胺中的所有仲胺，同时保留多胺上的伯氨基游离，以利于偶联反应的进行。该反应在固相载体上进行，遵循固相多肽合成（SPPS）的原理，以便于每次偶联和去保护步骤后的纯化处理。以下方案适用于PPA的手动和自动合成（尽管在自动系统中某些步骤的验证可能存在困难）。这些分子的合成也可在自动合成仪上进行，或借助微波反应器（全自动或半自动）完成。反应路线已总结于图1中。
<img alt="多肽合成示意图；化学结构；带有试剂的合成步骤；多胺结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57908/57908fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： (A) PPA合成的通用反应路线图。(B) 可用于合成本文所述PPA的代表性多胺。<a href="/files/ftp_upload/57908/57908fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>2-氯三苯氯树脂&amp;nbsp;</td><td>AappTec</td><td>RTZ001</td><td></td></tr><tr><td>SynthwareTM 合成反应器&amp;nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>SYNP120050M</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Acros</td><td>AC406920250</td><td>Fisher Sci. 目录号</td></tr><tr><td>腕式摇床</td><td>Boekel Scientific</td><td>401000-2</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser 检测试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>2-[(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙氨基]-乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS004772</td><td></td></tr><tr><td>无水甲醇</td><td>Acros</td><td>AC610981000</td><td>Fisher Sci. 目录号</td></tr><tr><td>氯醌检测试剂盒</td><td>TCI</td><td>TCC1771-KIT</td><td>VWR 目录号</td></tr><tr><td>二叔丁基二碳酸酯&amp;nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC194670250</td><td>Fisher Sci. 目录号</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>肼</td><td>Acros</td><td>AC296815000</td><td>Fisher Sci. 目录号</td></tr><tr><td>(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)</td><td>p3biosystems</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>4-甲基哌啶&amp;nbsp;</td><td>Acros</td><td>AC127515000</td><td>Fisher Sci. 目录号</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>AappTec</td><td>CXZ035</td><td></td></tr><tr><td>三异丙基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>9-氨基吖啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92817</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;注射器滤器：PTFE 膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-730-21</td><td></td></tr></tbody></table>

基于多胺的自组装肽两亲分子（ppas）及相关生物材料的简便合成方案

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

基于多胺的肽两亲分子（PPA）是一类新型的可自组装两亲性生物材料，与肽两亲分子（PA）密切相关。传统的PA以带电氨基酸（如赖氨酸、精氨酸）作为增溶基团，这些基团可直接连接到脂质段，也可包含由中性氨基酸组成的连接区域。通过调控PA的肽序列，可以获得多种不同的形貌结构。类似地，PPA也包含疏水段和中性氨基酸，但其水溶性（亲水）基团为多胺分子。与PA一样，当溶解于水中时，PPA也能自组装形成多种不同的纳米结构，包括小棒状结构、扭曲的纳米带以及融合的纳米片层。然而，由于单个多胺分子上同时存在伯胺和仲胺，这给PPA的合成带来了显著挑战。本文中，我们基于已有文献报道，展示了一种简便的合成PPA的实验方案，该方案采用固相肽合成法（SPPS），操作简便。此方法也可推广应用于PA及其他类似体系的合成。我们还详细说明了从树脂上裂解、产物鉴定及纯化所需的各个步骤。

在合成与纯化之后、进行理化或生物学评价之前，建议使用分析型高效液相色谱法（HPLC）重新检测PPA的分子量并确认其纯度。用于材料表征或生物学评价的PPA，其纯度需达到 &gt;95%. 图2 显示高效液相色谱图谱（上图）和基质辅助激光解吸电离质谱图（下图），证实产物的存在。高效液相色谱分析系统将计算曲线下面积（AUC），并给出AUC &gt;95% 可归因于产品纯度。在基于紫外检测的高效液相色谱系统中，应观察到单一且尖锐的峰。基质辅助激光解吸电离质谱图应与聚磷酸腺苷（PPA）的理论分子量在 ±1 Da 范围内相符（具体取决于 MALDI 分析模式）。
PPA的自组装过程可以通过多种技术进行观察和分析，包括透射电子显微镜（TEM）（图3A、B）、原子力显微镜（AFM）（<strong class="xf...

由于多胺类化合物含有多个氨基氮原子，因此基于多胺的肽两亲分子（PPAs）的合成具有较大挑战性，需要审慎使用保护基团来屏蔽这些活性官能团。本文中，我们描述了一种制备这类新型自组装分子的简便方法。

基于多胺的自组装肽两亲分子（PPAs）及相关生物材料的简便合成方案

基于多胺的肽两亲分子（PPAs）是一类新型的可自组装两亲性生物材料，与肽两亲分子（PAs）相关。

该方法可以解答关于如何将两亲性肽修饰到多胺上，以及八面体保护基团使用的若干关键问题。该技术的主要优势在于，能够利用含有多个反应性位点的未保护化学构建单元，生成杂化两亲性肽。演示该实验步骤的是来自康达·谢里丹实验室的实验室学生Mehdi、Nathalia和Krishnaiah。首先，精确称取2-氯三苯甲基氯树脂，将树脂置于容量为50毫升、带有砂芯且孔隙度中等的合成反应器中。接下来，将合成容器固定在可调速机械振荡器上，并将容器倾斜至45度角，以最大程度地增强振荡效果。然后向树脂中加入15毫升二氯甲烷（DCM）。在树脂珠充分溶胀15分钟后，向树脂中加入八当量的目标多胺，并使其反应五小时。反应五小时后，进行凯撒试验（kaiser test），以确认多胺与树脂的反应成功。随后，在无水甲醇中加入四当量的DDE，保护伯胺基团，并将反应混合物震荡过夜。次日，再次进行凯撒试验，若树脂珠无蓝色出现，则表明保护成功。然后，沥干二氯甲烷，并用二氯甲烷与 DMF 的 2:1 混合液洗涤树脂两次。接着，向树脂中加入 20 当量溶于二氯甲烷的 Boc 酐，反应持续三小时。通过氯醌试验确认仲胺保护完成后，沥干溶剂混合物，并再次用二氯甲烷与 DMF 的 2:1 混合液洗涤树脂两次。随后，向树脂中加入 10 毫升含 2% 肼的 DMF 溶液。振荡反应一小时后，进行凯氏试验（Kaiser test），以确认伯胺成功脱保护。接下来，加入四当量的 Fmoc 保护氨基酸、3.95 当量的 HBTU 以及 15 当量的 DIPEA，混合均匀。加入等体积的二氯甲烷（DCM）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合溶剂，并超声处理反应液直至完全溶解。在将混合物加入树脂之前，确保氨基酸、偶联试剂和N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）充分混合并充分活化。等待三至五分钟以确保羧基完全活化后，将反应混合物加入含有树脂的反应容器中，在室温下反应两至四小时。每一步均需进行凯撒尔（Kaiser）试验或氯醌试验，以确认偶联反应成功。在进行凯撒尔试验确认偶联成功后，加入10毫升含20% 4-甲基吡啶的DMF溶液，以脱除氨基酸的Fmoc保护基团。反应完成后，再次进行凯撒尔试验，以确认氨基酸的脱保护反应成功。然后，每次用10毫升DMF洗涤树脂，共洗涤两次，每次持续5分钟，最后用10毫升DCM洗涤10分钟。在所有所需氨基酸偶联完成后，通过向9.5当量的HBTU和12当量的DIPEA中加入10当量的目标羧酸官能团，将疏水尾部与最后一个氨基酸偶联。将混合物超声至完全溶解，然后将该混合液加入反应容器中。反应至少进行五小时，但建议过夜反应以获得最高产率。先用8 mL二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂2分钟，再用8 mL二氯甲烷（DCM）洗涤两次，每次5分钟。每次添加洗涤液前，需将容器中的溶剂排尽。最后一次洗涤完成后，在真空条件下干燥树脂15分钟。准备15毫升裂解液时，将14毫升三氟乙酸（TFA）加入0.5毫升水和0.5毫升三异丙基硅烷中。将此裂解液加入树脂中，在室温下振荡反应2至4小时。裂解反应完成后，将溶液收集至50毫升圆底烧瓶中。然后，在减压条件下，使用旋转蒸发仪于40摄氏度加热，将三氟乙酸（TFA）浓缩至1至2毫升。蒸发完成后，将所得的TFA溶液逐滴加入另一个含有15毫升无水冷乙醚的圆底烧瓶中，以沉淀PPA。接着，向盛有浓缩TFA溶液的原烧瓶中加入5毫升无水冷乙醚。超声处理以回收更多固体。然后，将其与上一步骤中的乙醚溶液合并。盖住烧瓶，并将其放入冰箱中过夜，以最大程度促进沉淀。第二天，使用细孔或中等孔径的中心圆盘滤器漏斗通过真空过滤收集沉淀物。最后，用五到十毫升冷乙醚将沉淀物洗涤两次，以去除任何残留的有机物。HPLC 谱图和 MALDI 谱图证实了 PPA 产物的存在，其纯度应高于 95%，可用于材料表征或生物学评价。在基于紫外的高效液相色谱图谱中观察到单一尖锐峰，基质辅助激光解吸电离质谱图显示的分子量与计算得到的PPA分子量在正负一个道尔顿范围内相符。PPA的自组装可通过透射电子显微镜、原子力显微镜、小角X射线散射、扫描电子显微镜和动态光散射进行观察和分析。成功的自组装将在透射电子显微镜和原子力显微镜下形成结构明确的纳米结构。一旦掌握，若操作得当，该方案可在三天内完成。在实施该步骤时，请务必在进行任何后续研究之前纯化产物并评估其纯度。按照此方案，还可制备其他分子，如肽两亲分子、肽以及肽-多胺杂合物。该技术开发后，有助于自组装多肽两亲分子领域的研究，探索聚胺纳米结构在药物递送、成像或催化等领域的应用。观看本视频后，您应能充分理解如何开展基于聚胺的多肽两亲分子及其相关多肽两亲分子的合成。三氟乙酸和4-甲基吡啶可能具有危害性，在操作本实验步骤时应采取佩戴手套、实验服并在通风橱中操作等防护措施。

facile-protocol-for-synthesis-self-assembling-polyamine-based-peptide

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

自组装多胺基多肽 Amphiphiles (PPAs) 及相关生物材料的简易合成协议

本文概述了一种简单且通用的手动肽拟态物合成方法，该方法仅需基本设备和市售试剂，可在大多数实验室中轻松实现肽拟态物的合成。文中详细描述了由36个单体组成的两亲性肽拟态物的合成、纯化与表征过程，并阐述了其自组装形成高度有序纳米片的特性。...

固相亚单体合成肽模拟物聚合物及其自组装形成高度有序纳米片

本文描述了通过自组装这一自发过程形成高度有序的肽基结构的方法。该方法利用 commercially available peptides...

短肽自组装形成有序生物分子结构

我们介绍一种新型聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基-PAAm，可实现细胞外基质蛋白的直接结合，且成本低廉、操作简便。将羟基-PAAm水凝胶与微接触印刷技术结合，可独立调控天然细胞微环境中的多种信号，从而用于研究细胞力学转导。...

用于解耦机械转导信号影响的羟基-PAAm水凝胶的制备

肽类叔酰胺（PTAs）是一类包含但不限于肽、肽拟物和N-甲基化肽的肽模拟物超家族。本文描述了一种结合了 结合裂分-混合与单体前体策略，合成单珠单化合物的PTA库。...

裂分与混合合成及肽类叔酰胺库的表征

本文介绍了一种在同一序列中合成具有混合阳离子功能的肽模拟物（赖氨酸型和精氨酸型单体）的方案，并描述了这些化合物对引起皮肤利什曼病的原虫寄生虫Leishmania...

一种高效合成含混合型赖氨酸/精氨酸单体的肽拟物及其抗利什曼原虫活性评价方法

我们报告了含有修饰残基的肽核酸（PNA）寡聚体的合成与纯化方案。同时描述了用于表征修饰PNA识别RNA双链体的生物化学与生物物理方法。...

化学修饰的肽核酸对双链RNA相对于单链RNA的序列特异性与选择性识别

一种1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成方案及其自组装形成的超分子结构的表征。...

1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征

本方案描述了一种高效合成油酸-铂(II)配合物纳米乳液的方法，该纳米乳液由赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸（KYF）三肽稳定。在温和的合成条件下，KYF与该配合物通过自组装形成纳米乳液。...

一种由三肽稳定的油酸纳米乳液

本文介绍了一种合成信息编码的肽模拟寡聚物的方案，并利用胺类和醛类作为动态共价反应对，以及路易斯酸性稀土金属三氟甲磺酸盐作为多功能试剂，指导这些肽模拟物进行序列定向的自组装，形成分子梯状结构。...

信息承载型肽模拟物的合成及其序列导向的动态共价自组装

本文提供了在有机溶剂混合物中利用γ修饰的肽核酸寡聚体设计和自组装纳米结构的实验方案。...

伽马修饰肽核酸在有机溶剂混合物中的自组装形成复杂纳米结构

本方案介绍了三种利用环境条件诱导肽自组装形成水凝胶的快速简便制备方法。此外，还描述了肽水凝胶的表征方法，证明在这些简单条件下可形成机械稳定的肽水凝胶。...

机械稳定性自组装肽水凝胶的制备

学习多胺基多肽两亲分子(PPAs)的简易合成方法，利用2-氯三苯甲基氯树脂和固相合成技术制备自组装生物材料。该方法无需保护基团即可构建杂化肽两亲分子，适用于药物递送和生物成像研究。

基于多胺的自组装肽两亲分子（PPAs）及相关生物材料的简便合成方案

探索更多视频