Name: 制定通过Nanoprecipitation技术嵌段聚合物纳米粒子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习使用纳米沉淀技术合成嵌段共聚物纳米粒子，用于抗癌药物递送系统。该方法通过PLGA-PEG共聚物封装难溶性药物，提高肿瘤治疗效果，适用于纳米医学研究。

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本工作由高尔夫球手抗击癌症组织、卡罗来纳纳米技术卓越中心试点资助项目、大学癌症研究基金以及美国国立卫生研究院K-12职业发展奖资助。

1. PLGA-b-PEG 聚合物的合成
<ol>
 <li>将带有末端羧酸根的聚（D,L-丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）（PLGA-羧酸根）溶解于PLGA的任一溶剂中（如材料部分所述），浓度为5 mM。在温和搅拌下，PLGA可在此浓度下溶解。</li>
 <li>将NHS（分子量115.09）和EDC（分子量191.7）均溶解于PLGA溶液中，浓度为25 mM。（EDC和NHS的加入量均为PLGA摩尔量的5倍，即化学计量过量）。在PLGA-羧酸根溶液中加入EDC和NHS，并在温和搅拌下反应约1小时，将PLGA-羧酸根转化为PLGA-NHS。</li>
 <li>通过加入洗涤液甲醇使反应产物PLGA-NHS沉淀析出。向溶液中加入约10倍体积过量的甲醇。在2000 × g条件下离心，使PLGA-NHS沉淀，并弃去上清液（以去除残留的EDC和NHS）。用甲醇洗涤的步骤至少重复三次。</li>
 <li>将PLGA-NHS沉淀物在真空下干燥30分钟，以去除任何残留的洗涤液。</li>
 <li>将PLGA-NHS沉淀物重新溶解于最初用于溶解PLGA的相同溶剂中，浓度相同。然后向PLGA溶液中加入异双功能PEG（氨基-PEG-羧酸根），使其终浓度为5 mM（摩尔比为1:1）。混合溶液在持续搅拌下孵育24小时。</li>
 <li>24小时后，通过过量加入洗涤液甲醇使反应产物PLGA-b-PEG嵌段共聚物沉淀析出。重复上述洗涤和离心步骤三次，以去除所有未反应的过量PEG。</li>
 <li>将PLGA-b-PEG嵌段共聚物在真空下干燥。</li>
</ol>
2. PLGA-b-PEG 纳米颗粒的制备
由PLGA为核、PEG为表面包被的两亲性嵌段共聚物可制备具有PLGA内核和PEG表面修饰的纳米颗粒。多种不同的疏水性药物均可被包载于此类纳米颗粒中。荧光化合物可被包封在纳米颗粒内部，或与PLGA进行共价连接，因此这些纳米颗粒可用于荧光成像研究。
当需要包封的货物分子具有高度疏水性时，常采用纳米沉淀法来制备纳米颗粒。
<ol>
 <li>将PLGA-b-PEG嵌段共聚物和待包封的药物/货物溶解于能够溶解PLGA的任意溶剂中。PLGA可被多种常见溶剂溶解，包括乙腈、二氯甲烷（DCM）、四氢呋喃、丙酮或乙酸乙酯。溶剂的选择至关重要，因其会影响纳米颗粒的性质，因此此步骤中应使用合适的溶剂。</li>
 <li>然后将聚合物/药物混合物逐滴加入3–5倍体积的搅拌水中，使最终聚合物浓度约为3 mg/mL。（图2）</li>
 <li>在减压条件下继续搅拌2小时，使纳米颗粒通过自组装形成，并去除残留的有机溶剂。</li>
 <li>收集与纯化：使用Amicon滤膜（截留分子量20 kDa）在2,700×g离心10分钟浓缩纳米颗粒，洗涤后重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中。此过程可去除所有未包封的药物/货物。可进行基本的生物物理表征，如粒径、表面电荷及药物包封效率，以更全面地了解纳米颗粒的性质。</li>
</ol>
3. 储存
冷冻干燥是储存纳米颗粒的常用方法11。冷冻干燥可长期保持纳米颗粒的物理和化学特性，以实现长期稳定性12。冷冻干燥过程可能对颗粒造成应力，导致配方失稳，因此通常使用冷冻保护剂（防止冷冻应力）和冻干保护剂（防止干燥应力）。这些保护剂的选择取决于预期的储存时间长度13。
<ol>
 <li>在冷冻干燥过程中，通过将样品冻结至其玻璃化转变温度（Tg）以下，实现样品的完全固化。</li>
 <li>在干燥步骤中，冰通过升华作用被去除。应优化温度和压力，以实现高效的冷冻干燥过程。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
PLGA-b-PEG 二嵌段共聚物的表征
可采用多种技术来确认聚合物偶联是否成功。PLGA-b-PEG 的组成可通过 400 MHz 1H 核磁共振（NMR）进行表征。所生成产物（PLGA-b-PEG）的分子量可通过凝胶渗透色谱法（GPC）进行验证。PLGA-b-PEG 的分子量分布曲线和洗脱时间应与单独的 PLGA 和 PEG 不同。综合使用这些技术可对所生成产物进行表征，并判断偶联反应是否成功。
PLGA-b-PEG 纳米颗粒的表征
粒径及粒径分布可通过动态光散射法进行测定。纳米沉淀过程中不同的参数会影响颗粒的大小。初始使用的聚合物（包括PLGA和PEG）的分子量也会影响粒径分布。透射电子显微镜（TEM）也可用于确认纳米颗粒的粒径分布和结构，如图3所示。颗粒尺寸通常处于纳米（nm）范围。若颗粒尺寸较大且粒径分布不均，可能表明偶联反应存在错误，或纳米沉淀方法需要优化。此外，可使用ZetaPALS测定颗粒表面的Zeta电位。 
药物/载荷的包封效率可通过标准高效液相色谱法（HPLC）进行定量。
将颗粒溶解于有机溶剂中，并可通过高效液相色谱法（HPLC）测定药物/负载物的吸光度（图4）。药物释放动力学研究可采用已知固定量的纳米颗粒，在30个Slide-A-Lyzer MINI透析装置中进行透析。在固定的时间间隔，收集透析装置中的内容物，并加入等体积的有机溶剂以溶解纳米颗粒。对这些样品进行HPLC分析，以定量测定药物/负载物的含量。
<img alt="化学反应示意图，EDC/NHS 酰胺键形成，肽偶联机制，合成过程" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. EDC/NHS 化学反应
<img alt="纳米沉淀示意图；有机相与水相混合以进行包封过程。" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 制备聚合物纳米颗粒的纳米沉淀法。 将含有 PEG-PLGA 二嵌段共聚物及待包载药物或 cargo 的有机溶剂溶液（乙腈或 DCM）逐滴加入 3–5 mL 搅拌中的 H2O 中。
<img alt="纳米颗粒分布、透射电子显微镜图像、结构分析、材料科学研究。" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 纳米颗粒的透射电子显微镜分析。 含有wortamin的PEG-PLGA纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像。使用磷钨酸作为对比剂。
<img alt="紫杉醇释放动力学曲线图；纳米颗粒比较，数据分析，药物递送研究。" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 纳米颗粒中药物的可控释放。 纳米颗粒在PBS中透析后紫杉醇的释放情况。在指定时间点，将颗粒从透析盒中取出，并溶于乙腈中。采用HPLC测定溶液浓度。比较了两批独立制备的纳米颗粒。

<ol><li>Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+polymers+in+pharmaceutical+and+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).</li>
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<li>Gref, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+long-circulating+polymeric+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres.</a> Science. 263, 1600-1603 (1994).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

使用嵌段共聚物的纳米沉淀法是一种简单、快速制备聚合物纳米颗粒的方法。所得到的纳米颗粒具有疏水性内核，可用于递送难溶性化合物。其表面的亲水层不仅提供了优良的水溶性，还可作为功能基团，进一步与靶向配体进行偶联。
存在多种纳米颗粒平台，包括脂质体、聚合物纳米颗粒、树枝状大分子、金属颗粒和量子点14在这些平台中，聚合物纳米颗粒平台是制备最简便、应用最广泛的平台之一。该技术所需的设备配置简单，数小时内即可掌握。此外，其应用范围广泛，且具有良好的生物相容性，可同时用于 体外 和 体内 其携带货物的能力使其具备成像和治疗功能。
本文采用 EDC/NHS 化学方法制备双嵌段共聚物。然而，嵌段共聚物也可使用不同的催化剂合成。另一种常用的催化剂是辛酸亚锡。PEG 的端羟基被用作引发基团来合成嵌段共聚物。由二羟基 PEG 或单甲氧基 PEG 引发的丙交酯和乙交酯的开环聚合，可分别得到 A-B-A 型或 A-B 型嵌段共聚物15。该制备方法在分子设计上更具灵活性，但 ED...

<table><tbody><tr><td>EDC</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>22980</td><td>偶联试剂</td></tr><tr><td>NHS</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>24500</td><td>偶联试剂</td></tr><tr><td>胺基-PEG-羧酸盐</td><td>莱桑生物公司</td><td>Nh2-PEG-CM-5000</td><td>聚合物（可使用任意聚乙二醇分子量，此处列出5000）</td></tr><tr><td>PLGA-羧酸盐</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6013-2</td><td>聚合物</td></tr><tr><td>二氯甲烷（DCM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>乙腈 &amp;>99% 纯度</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>甲醇 &amp;纯度 >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>洗涤</td></tr></tbody></table>

通过纳米沉淀法制备双嵌段聚合物纳米颗粒

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

纳米技术是一门相对较新的科学分支，涉及利用尺度在纳米级（纳米颗粒）粒子的独特性质。纳米颗粒可以被精确地设计，使其尺寸、组成和表面化学性质得到严格控制。这使得人们能够以前所未有的自由度来调控其负载物的一些基本特性，例如溶解度、扩散性、生物分布、释放特性以及免疫原性。自诞生以来，纳米颗粒已被广泛应用于科学与医学的诸多领域，包括药物递送、成像以及细胞生物学1-4。然而，由于存在技术门槛的认知，其应用尚未在“纳米技术实验室”之外得到充分拓展。本文中，我们描述了一种简单的合成方法，用于构建一种具有广泛应用前景的聚合物纳米颗粒平台。
第一步是合成一种具有疏水区和亲水区的二嵌段共聚物。以PLGA和PEG为模型聚合物，我们描述了使用EDC/NHS化学法进行偶联反应的过程5（图1）。我们还讨论了聚合物的纯化过程。合成的二嵌段共聚物可在纳米沉淀过程中通过疏水-亲水相互作用自组装形成纳米颗粒。
所述聚合物纳米颗粒具有高度多功能性。该纳米颗粒的疏水性内核可用于携带难溶性药物，以进行药物递送实验6。此外，这些纳米颗粒可克服难溶性分子生物学试剂（如需使用DMSO等溶剂的渥曼腺素）所伴随的有毒溶剂问题。然而，DMSO可能对细胞产生毒性并干扰实验结果。这些难溶性药物和试剂可通过聚合物纳米颗粒实现高效递送，同时毒性极低。聚合物纳米颗粒还可负载荧光染料，用于细胞内转运研究。最后，这些聚合物纳米颗粒可通过表面聚乙二醇（PEG）与靶向配体偶联。此类靶向性纳米颗粒可用于标记细胞表面或内部的特定表位7-10。

本文介绍了一种利用嵌段共聚物合成聚合物纳米颗粒的纳米沉淀方法。我们将讨论嵌段共聚物的合成、纳米沉淀技术及其潜在应用。

纳米技术是一门相对较新的科学分支，涉及利用尺度在纳米级的粒子所具有的独特性质……

本实验的总体目标是采用纳米沉淀法合成聚合物纳米颗粒。首先通过 EDC-NHS 反应制备 APLGA-PEG 共聚物，再利用该 PLGA-PEG 共聚物通过纳米沉淀法形成纳米颗粒，从而包载目标药物或 cargo。此时，可通过动态光散射、透射电子显微镜或高效液相色谱法对纳米颗粒进行基本的生物物理表征，包括粒径、表面电荷及药物包封效率。该技术在肿瘤治疗方面具有重要意义，因为纳米颗粒能够递送难溶性抗癌药物，其疗效可能优于现有治疗方法。尽管该方法可为癌症治疗提供新的思路。它还可用于研究其他系统，例如细胞运输。通过使用成像剂展示该技术，可将纳米颗粒与靶向配体偶联，并在体内或体外进行可视化观察。今天将有我们实验室的两名技术人员，Rohit Sukumar 和 Natalie Cummings，开始PLGA-PEG共聚物的合成：将羧基化的PLGA以5毫摩尔浓度溶于乙腈中，在温和搅拌下进行。然后加入足量的NHS和EDC，使终浓度达到25毫摩尔，相对于PLGA而言提供五倍摩尔过量。轻轻搅拌溶液约一小时，使PLGA的羧基转化为PGA-NHS。一小时后，通过加入约10倍体积的甲醇洗涤液至溶液中，使PGA-NHS反应产物沉淀。在2000 × g条件下离心，收集P-L-G-A-N-H-S沉淀。离心后弃去上清液，以去除EDC和NHS的残留痕迹。该甲醇洗涤步骤至少重复三次。洗涤完成后，将 P-L-G-A-N-H-S 在真空条件下干燥 30 分钟，以去除任何残留的洗涤液。随后，用与最初溶解 PLGA 时相同浓度的乙酸三乙酯重新溶解 P-L-G-A-N-H-S 沉淀。溶解后，向 PLGA 溶液中加入异双功能 PEG，添加浓度为 5 毫摩尔/升。24小时后，在持续搅拌下将混合溶液孵育24小时。通过加入过量甲醇沉淀PLGA-PEG嵌段共聚物反应产物。进行洗涤和离心操作，并重复额外三次，以去除所有过量未反应的PEG。合成的最后一步是在真空条件下干燥PLGA-PEG嵌段共聚物。纳米粒子沉淀首先将PLGA-PEG嵌段共聚物和待包封药物溶解于A-P-L-G-A溶剂中。溶剂的选择至关重要，因其会影响纳米粒子的性质。然后将聚合物-药物混合物逐滴加入到3至10倍体积的搅拌水中，使最终聚合物浓度约为3毫克/毫升，需逐滴加入。将有机溶液加入水相是形成正确尺寸纳米颗粒的关键步骤。在减压条件下继续搅拌两小时，使纳米颗粒通过自组装形成，并去除有机溶剂的残留。搅拌两小时后。使用Amicon滤器，在2,700 × g条件下离心10分钟，浓缩纳米颗粒。随后用PBS洗涤纳米颗粒，以去除未包封的药物，并再次进行离心。最后，将纳米颗粒重新悬浮于PBS中。基本的生物物理表征，包括粒径、表面电荷和药物包封效率，可用于更好地理解纳米颗粒的性质。纳米颗粒的储存方法可按照书面实验方案所述进行。为表征PLGA-PEG纳米颗粒，采用透射电子显微镜观察其粒径、分布及结构。纳米颗粒的粒径通常处于纳米级范围。粒径较大且粒径分布不均可能表明偶联反应存在错误，或需要优化纳米沉淀方法。图中显示了一项药物释放动力学研究，其中采用标准HPLC定量测定了紫杉醇的载药效率和释放情况。已知固定量的纳米颗粒在固定时间间隔内进行透析。收集透析单元中的内容物，并加入等体积的有机溶剂以溶解纳米颗粒。随后对这些样品进行高效液相色谱分析。为了定量紫杉醇含量，一旦掌握该纳米沉淀技术，可在三小时内正确完成操作。进行此技术操作时，请始终将有机相缓慢加入水相中，以防止体系形成后产生大颗粒。该技术为纳米医学领域的癌症研究人员探索难溶性药物的应用铺平了道路，这些药物在此前因对癌症患者产生过高毒性而被认为不可行。此外，还可开展其他方法研究，例如体内药效学研究或成像研究，以回答诸如：当系统性毒性不再成为问题时，难溶性药物是否有效？靶向配体能否将纳米颗粒准确靶向至目标部位？

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