Name: 单层的合成，装配和表征蛋白质单分子膜的电化学保护的金纳米粒子薄膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 学习单层保护金纳米团簇的合成与薄膜组装技术，用于蛋白质单层电化学研究。该方法以Pseudomonas aeruginosa azurin为模型蛋白，通过循环伏安法实现快速电子转移动力学分析。

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我们衷心感谢美国国家科学基金会（CHE-0847145）以及亨利·德雷福斯教师学者奖项目对本研究的慷慨支持。我们特别感谢里士满大学生物学系显微成像中心主任克里斯汀·戴维斯（Christine Davis）在横截面成像方面提供的帮助。同时，我们向 T. Leopold 博士、R. Kanters 博士、D. Kellogg 博士、R. Miller 博士、W. Case 博士，以及 Russ Collins、Phil Joseph、Carolyn Marks、Mandy Mallory 和 John Wimbush 致以诚挚谢意——正是他们使里士满大学的本科生科研成为可能。我们还要向 Leopold 研究实验室所有现任、前任及未来的本科生研究人员致以由衷的感谢。

1. 己硫醇单层保护的金团簇合成
采用2:1的1-己硫醇（C6）与金的摩尔比合成己硫醇功能化的单层保护金团簇（MPCs），以获得平均结构为Au225(C6)75的产物。4-9 对Brust反应进行特定改进，例如改变配体类型、硫醇与金的特定比例、反应温度、加料速率，或进行合成后的处理，9-11 可分别获得具有不同核尺寸和功能化保护基团的多种MPCs。4 通过碘分解样品后的质子（1H）核磁共振（NMR）分析，可确定由不同烷基硫醇基团功能化的MPCs的近似（平均）组成。
<ol>
	<li>在通风橱中，将1.1 g四辛基溴化铵（TOABr）溶于30 mL甲苯中。</li>
	<li>溶解0.38 g硼氢化钠（NaBH₄）4) 加入约 20 mL 的 18 MΩ 超纯水（UP H2O）并在冰上冷却至少30分钟。</li>
	<li>溶解 0.31 g 氯金酸（HAuCl₄）4) 加入约 20 mL 超纯水（UP H2O，并使用额外约5 mL超纯水定量转移溶液混合物至TOABr-甲苯溶液中2O 以将水相金溶液转移至非水相溶液中。在轻微盖紧的条件下剧烈搅拌30分钟，使橙黄色的水相与澄清的非水相充分混合。</li>
	<li>将澄清的水相和焦橙色的非水相均转移至分液漏斗中。弃去水相（下层），倾倒出非水相（上层）至一个洁净的烧瓶中。</li>
	<li>以2:1的比例加入C6和HAuCl4 加入非水溶液中，搅拌30分钟，形成Au(I)聚合物，可通过溶液颜色由红橙色变为浅黄色、近乎无色来确认。</li>
	<li>将反应混合物转移至隔热的冰浴中，搅拌下冷却至0°C，保持至少30分钟。</li>
	<li>定量且快速地加入预冷的 NaBH₄4 在巯基存在下，向反应混合物中加入溶液以将 Au(I) 还原为金属金，加入后立即形成浓稠的黑色 MPC 溶液。在 0°C 下搅拌反应过夜。</li>
	<li>将反应混合物转移至分液漏斗，弃去水相（下层）至废液杯中，旋转蒸发非水相（上层）甲苯层至接近完全干燥，得到烧瓶中残留的深黑色油泥。</li>
	<li>通过加入乙腈并静置过夜，使MPCs沉淀。</li>
	<li>使用带有橡胶接头和侧臂烧瓶的中等孔隙度玻璃砂芯漏斗，通过真空过滤收集MPCs，并用大量乙腈冲洗。</li>
	<li>让MPCs自然风干，称量产物，通过透射电子显微镜（TEM）和核磁共振（NMR）分析进行表征，并加盖保存以备后续使用。将MPCs溶于甲苯后滴加到铜网（400目）上的甲酸膜/碳支持膜上，于80–100 kV条件下操作透射电子显微镜获取TEM图像。可使用Image J（免费软件）等图像分析软件估算平均核尺寸。</li>
</ol>
2. 薄膜组装：二硫醇连接的MPC薄膜组装用于蛋白质单层电化学
首先对金基底进行电化学清洗，并用C6自组装单分子膜（SAM）进行修饰，然后将其浸入二硫醇连接分子和C6修饰的金属纳米粒子（MPCs）的交替溶液中，构成一个“浸渍循环”；重复多次该循环，最终形成由二硫醇连接的MPC薄膜组装体。如先前研究所述2，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）质体铜蓝蛋白（AZ）的原始质粒由莱斯大学的Corey Wilson博士慷慨提供，而AZ蛋白则由里士满大学的Jonathan Dattelbaum博士教授提供，形式为纯化后的冻干粉末，随后用4.4 mM磷酸钾缓冲液（KPB，pH = 7.0，μ = 10 mM）重新溶解，通过紫外-可见（UV-Vis）分析确认其浓度为5–10 μM的溶液。
<ol>
	<li>从下至上按以下顺序组装电化学（echem）三明治电池：第一块有机玻璃固定板、作为工作电极的金基底、与金工作电极连接的黄铜电接触片、第一个橡胶垫圈、限定电极面积（0.32 cm²）的Viton O形圈、样品薄膜、第二个橡胶垫圈、对电极（铂网）、参比电极（Ag/AgCl）、第二块有机玻璃固定板。使用六角螺栓和螺母将整个组件夹紧，确保各层之间密封良好且电接触稳定。2）、玻璃池体、第二个橡胶垫圈和第二个亚克力固定板。整个池体通过螺纹杆和精心拧紧的翼形螺母固定在一起。池体配备一个市售参比电极，内含一个装有1 M饱和KCl溶液的玻璃管、Ag/AgCl参比丝和一根Pt辅助电极丝。</li>
	<li>通过在0.1 M H溶液中以100 mV/s的扫描速率，相对于Ag/AgCl, KCl参比电极在0.2至0.9 V、0.2至1.2 V和0.2至1.35 V的电位窗口内进行循环伏安法（CV）扫描，对金基底进行电化学清洗。2SO4 和 0.01 M KCl。</li>
	<li>在标准条件下，于KPB缓冲液中以100 mV/s的扫描速率在0.1至0.4 V（相对于Ag/AgCl，KCl）的电位窗口内进行循环伏安法（CV）测试，测量经清洗的裸金基底的充电电流。1 弃去 KPB，随后用 UP H 依次冲洗2O、乙醇（EtOH）、UP H2O 和 EtOH。</li>
	<li>将清洗后的金基底暴露于约300 μl的5 mM C6乙醇溶液中，静置过夜以形成有序的C6自组装单分子层（SAM）。弃去C6溶液，依次用乙醇、超纯水冲洗。2O、EtOH 和 UP H2O.</li>
	<li>在标准条件下测量自组装单分子膜（SAM）的充电电流。弃去KPB溶液，依次用超纯水（UP H2O、EtOH、UP H2O 和 EtOH。充电电流应明显低于裸金电极测得的电流（步骤 2.3）。1</li>
	<li>将修饰有自组装单分子膜（SAM）的金基底暴露于约300 μl的5 mM 1,9-壬二硫醇（NDT）乙醇（EtOH）溶液中，静置1小时，使NDT连接分子在C6 SAM中均匀分散。弃去NDT溶液，依次用乙醇（EtOH）、超纯水（UP H₂O）充分冲洗。2O、EtOH、UP H2O，以及二氯甲烷（CH2Cl2).</li>
	<li>将金基底暴露于 CH 的 MPC 溶液中2Cl2 （约1 mg/mL）通过缓慢通入N₂并搅拌2 气体处理1小时。如有必要，将已蒸发的MPC溶液补充更多CH2Cl2。这是薄膜组装中的锚定MPC层。弃去MPC溶液，再次用CH依次冲洗2Cl2，UP H2O 和 KPB。</li>
	<li>在标准条件下测量 MPC 层的充电电流。弃去 KPB，并用 UP H 依次冲洗2O 和 CH2Cl2.</li>
	<li>将金基底暴露于约 300 μl 的 5 mM NDT 溶液中2Cl2 通过缓慢通入 N₂ 搅拌2 气体处理20分钟。</li>
	<li>弃去 NDT，用 CH 充分冲洗2Cl2重复步骤 2.7 和 2.8，以沉积薄膜组装中的第二层 MPC。</li>
	<li>要沉积更多的MPC层，需重复步骤2.9和2.10。每增加一层MPC，均可观察到充电电流相应增加。</li>
	<li>网络化 MPC 薄膜制备完成后，用 KPB 冲洗经薄膜修饰的基底。通过向电化学三明治池中注入约 150 μL 浓度约为 5–10 μM 的 AZ 蛋白 KPB 溶液，密封后于冰箱中静置至少 1 小时，使 AZ 蛋白吸附在 MPC 薄膜组装体上。</li>
	<li>从冰箱中取出电化学池，使其恢复至接近室温。用KPB充分冲洗，重新加满KPB，并向KPB中通入N₂鼓泡2 气体处理10分钟。</li>
	<li>在KPB缓冲液中，以100 mV/sec的扫描速率，在-0.25 V至0.25 V（相对于Ag/AgCl，KCl）的电位窗口内进行循环伏安法（CV）测定蛋白质单分子层的电化学特性。</li>
</ol>
3. 薄膜组装：用于光学追踪的二硫醇连接MPC薄膜组装
在培养用于光学评估的MPC薄膜之前，需先用piranha溶液（注意！浓H2SO4与H2O2按2:1比例混合）清洗玻璃片，并用(3-巯丙基)三甲氧基硅烷（3-MPTMS）进行处理1-2。随后，采用上文所述的“浸渍循环”技术，在这些经过修饰的玻璃片上组装MPC薄膜。
<ol>
	<li>用 CH2Cl2 冲洗经 3-MPTMS 修饰的玻璃片，然后将其置于含 CH2Cl2 的 MPC 溶液（约 1 mg/mL）中，低速振荡反应 1 小时。此步骤通过将 MPC 锚定在硅烷的巯基末端，完成薄膜组装的第一层 MPC 沉积。用 CH2Cl2 充分冲洗玻璃片，并用 N2 气体吹干。对玻璃片进行紫外-可见光谱扫描（波长范围 400 至 1000 nm），然后再次用 CH2Cl2 冲洗。</li>
	<li>将玻璃片置于含 CH2Cl2 的 5 mM NDT 溶液中，低速振荡反应 1 小时。用 CH2Cl2 冲洗玻璃片。</li>
	<li>将玻璃片置于 MPC 溶液中，低速振荡反应 1 小时。此步骤完成薄膜组装的第二层 MPC 沉积。用 CH2Cl2 充分冲洗玻璃片，用 N2 气体吹干，并对玻璃片进行紫外-可见光谱扫描（波长范围 400 至 1000 nm）。随着更多 MPC 层被吸附到薄膜上，全波长范围的吸光度应逐步增加。</li>
	<li>如需沉积更多 MPC 层，可重复步骤 3.2–3.3。</li>
</ol>
4. 通过横截面透射电子显微镜表征单层保护的金团簇薄膜组装体
透射电镜（TEM）截面样品通过将表面包埋的薄膜进行再包埋来制备2, 12。具体操作首先将组装在经3-MPTMS修饰的玻璃载玻片上的MPC薄膜，使用Embed 812环氧树脂粘附到干净的标准显微镜载玻片上，以便在后续操作中更易于处理。操作过程中需谨慎控制加热条件，因为较高温度会导致薄膜中的MPC分解。
<ol>
	<li>混合 Embed 812 环氧树脂，并使其增稠至少 12 小时。</li>
	<li>用环氧树脂填充一个“00”号 BEEM 胶囊，倒置在 MPC 薄膜样品（按第 3 节制备）上。对胶囊施加压力，使气泡上升至胶囊顶部，从而在环氧树脂与 MPC 薄膜样品之间形成密封。在 60°C 下聚合至少 18 小时，然后将包埋的样品冷却至室温。</li>
	<li>将包埋好的样品置于 200°C 的铸铝加热板上加热 20 秒，以利于脱去带有附着 MPC en face 薄膜的包埋块。</li>
	<li>使用珠宝锯从 BEEM 胶囊包埋块上切下含有薄膜的样品部分。</li>
	<li>将切下的部分重新包埋于硅胶平底模具中，使 MPC 薄膜面朝上并面向硅胶凹槽内部。在室温下向硅胶凹槽中加入环氧树脂，并在 60°C 下聚合至少 18 小时。将样品冷却至室温。</li>
	<li>使用钻石刀在 Leica UCT 超薄切片机上垂直于刀刃方向切割样品，获得 60–80 nm 的薄切片。</li>
	<li>将切好的切片置于铜网（400 目）上的聚乙烯醇/碳支持膜上，对 MPC 薄膜组件的制备横截面进行透射电子显微镜（TEM）成像。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
<img alt="循环伏安法图；电位 vs. 电流；电化学分析；Ag/AgCl参比电极。" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1 MPC薄膜生长过程中双电层充电电流的监测，共进行5次浸渍循环（交替暴露于MPC和NDT溶液中）。每次浸渍循环后，充电电流系统性增加，表明MPC在薄膜上逐层沉积（图2）。循环伏安图在0.1至0.4 V（相对于Ag/AgCl，KCl）的电位窗口内，以100 mV/s的扫描速率，在4.4 mM磷酸钾缓冲液（pH = 7.0，μ = 10 mM）中采集。经美国化学学会许可重印自M.L. Vargo, C.P. Gulka, J.K. Gerig, C.M. Manieri, J.D. Dattelbaum, C.B. Marks, N.T. Lawrence, M.L. Trawick, 和 M.C. Leopold, Langmuir 26(1), 560-569。版权所有 2010。
<img alt="蛋白质层界面示意图，显示MPC组装；用于电化学分析的循环伏安图。" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2 (a) AZ蛋白吸附于二硫醇连接的MPC薄膜组装体的示意图。(b) 在4.4 mM磷酸钾缓冲液（pH = 7.0，μ = 10 mM）中，以100 mV/s的扫描速率，在-0.25至+0.25 V（相对于Ag/AgCl，KCl）的电位窗口内测得的AZ吸附于MPC薄膜组装体的典型循环伏安图。
<img alt="吸光度与波长关系图；光子学研究；发射分析；光谱数据分析。" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 
图3 二硫醇连接的MPC薄膜在3-MPTMS修饰的玻璃载片上生长过程的典型紫外-可见光谱监测结果。每次浸渍循环包括将玻璃载片依次浸入NDT连接剂溶液和MPC溶液中。每增加一次浸渍循环，薄膜厚度随之增长，吸光度同步升高。随着浸渍循环次数的增加，表面等离子体吸收带在约520 nm处逐渐形成。经M.L. Vargo、C.P. Gulka、J.K. Gerig、C.M. Manieri、J.D. Dattelbaum、C.B. Marks、N.T. Lawrence、M.L. Trawick和M.C. Leopold许可转载自《朗缪尔》（Langmuir 26(1), 560-569）。美国化学会2010年版权所有。
<img alt="纳米粒子的电子显微镜图像。纳米材料结构分析示意图。" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 4"> 
图 4 二硫醇连接的 MPC 薄膜组装的透射电子显微镜（TEM）截面图像分析。插图：用于薄膜组装的己硫醇功能化 MPC 的典型 TEM 图像。通过 Image J 分析，TEM 分析确定 MPC 的平均金核直径约为 2 nm。经 M.L. Vargo、C.P. Gulka、J.K. Gerig、C.M. Manieri、J.D. Dattelbaum、C.B. Marks、N.T. Lawrence、M.L. Trawick 和 M.C. Leopold, Langmuir 26(1), 560-569 许可重印。版权所有 2010 美国化学会。

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</ol>

无利益冲突声明。

单层蛋白质电化学是一种用于研究氧化还原蛋白质与合成吸附平台之间相互作用的有效技术。然而，该策略的有效性取决于能否在分子水平上精确调控吸附界面的构建。本方案所制备的基于MPC的平台是经过特定设计的平台，与采用烷硫醇自组装单分子层（SAMs）的传统PME系统相比，能够提供更均一的蛋白质吸附环境3，并实现更远距离的电子传递2。MPC薄膜组装作为电化学界面的一个优势在于其具有高度的通用性和适应性，可适用于不同尺寸和表面化学性质/功能的氧化还原蛋白质、多种不同的纳米材料以及不同的电极构型。例如，通过在组装好的MPC最外层进行简单的置换反应，该方法可轻松拓展用于细胞色素c（cyt c）的电子传递研究11。由于cyt c带正电荷，能够通过静电作用结合到基底上，因此可将羧基封端的烷基硫醇通过置换反应引入修饰电极界面MPC的外围配体中，从而实现蛋白质的静电驱动固定化，后续的电化学分析方法与本文所述完全相同1。为了调节MPC的尺寸以适应不同大小的蛋白质，可通过调整Brust合成条件，例如改变硫醇与金的比例、反应温度或试剂加入速率，获得...

<table><tbody><tr><td>四辛基溴化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>294136</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>四氯金酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169-5G</td><td></td></tr><tr><td>1-己硫醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>234192</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>核磁共振波谱仪</td><td>Bruker Corporation</td><td>300 MHz</td><td></td></tr><tr><td>铜网（400目）上覆Formvar/碳支持膜</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>金基底</td><td>Evaporated Metal Films Corp.</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl参比电极</td><td>Microelectrodes, Inc.</td><td>MI-401F</td><td></td></tr><tr><td>电化学工作站</td><td>CH Instruments, Inc.</td><td>CHI650A, CHI610B</td><td></td></tr><tr><td>1,9-壬二硫醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N29805</td><td></td></tr><tr><td>(3-巯丙基)三甲氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175617</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Agilent Technologies</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812环氧树脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>&quot;00&quot; BEEM胶囊</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70000-B</td><td></td></tr><tr><td>硅平面模具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀</td><td>Diatome</td><td>21-ULE, S12801</td><td></td></tr></tbody></table>

单层保护金纳米颗粒薄膜的合成、组装及表征用于蛋白质单层电化学研究

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

通过烷基硫醇配体保护的胶体金纳米颗粒，即单层保护金团簇（MPCs），被合成并进一步整合到薄膜组装体中，作为蛋白质单层电化学（PME）的吸附平台。PME被用作研究氧化还原蛋白电化学性质的模型体系，通过将其限制在修饰电极上的吸附平台中，该平台同时作为电子转移（ET）反应的氧化还原伴侣。研究表明，与传统的采用烷基硫醇自组装单分子层（SAM）修饰的体系相比，此类金纳米颗粒薄膜组装体可提供更均一的蛋白质吸附环境，并促进无距离依赖性的电子转移。1-3 本文中，采用改进的Brust反应4合成了以己硫醇配体功能化的MPCs，并通过紫外-可见（UV-Vis）光谱、透射电子显微镜（TEM）以及质子（1H）核磁共振（NMR）进行表征。通过“浸渍循环”法，在SAM修饰的金电极界面交替沉积MPC层与二硫醇连接分子，从而构建MPC薄膜。通过测量系统双电层充电电流的变化，可电化学监测金电极上薄膜的生长过程。在硅烷修饰的玻璃载片上构建的类似薄膜可用于光学监测薄膜生长，而横截面TEM分析可估算薄膜厚度。在薄膜组装过程中，调控MPC配体保护层及颗粒间连接机制，可形成网络化薄膜，便于适应不同吸附机制的氧化还原蛋白界面连接。例如，Pseudomonas aeruginosa 蓝铜蛋白（AZ）可通过疏水作用吸附于由己硫醇MPCs构成的二硫醇连接薄膜，而细胞色素c（cyt c）则可通过静电作用固定在羧基修饰的MPC界面层。本报告中，我们仅聚焦于AZ体系的薄膜制备方案。对蛋白质在MPC修饰的合成平台上吸附行为的研究，有望进一步揭示生物分子与人工材料之间的相互作用，进而推动生物传感器设计、电子转移模型系统以及合成生物相容材料的发展。5-8

已知的单层保护簇（MPCs）是由烷硫醇盐稳定的金胶体，其被合成、表征并组装成薄膜，作为简单氧化还原蛋白如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的质体蓝素（AZ）和细胞色素c（cyt c）单层蛋白质电化学的吸附界面。

以烷基硫醇盐配体保护的胶体金纳米粒子，即单层保护金簇（MPCs），被合成并随后……

以下实验的总体目标是合成经烷基稳定化的金纳米颗粒，即单层保护簇（MPCs），并将这些材料组装成薄膜结构，用作偶氮蛋白单分子层电化学的吸附界面。该过程首先通过有机配体保护金胶体，形成被烷基硫醇膜包围的金纳米颗粒。随后，将MPCs锚定在金和玻璃基底上，并交联形成多层共价连接的薄膜，通过光学和电化学测量以及横截面显微技术监测薄膜的生长过程。然后，电子传递蛋白azurin在界面处吸附，并对蛋白单分子层进行循环伏安法电化学检测。结果表明，通过该方法构建的MPC薄膜界面能够基于MPC薄膜实现更优化的吸附蛋白电化学分析，提供更均一的吸附界面以及不依赖于传统距离效应的快速电子传递动力学。该技术相较于传统蛋白电化学的主要优势在于，采用纳米粒子薄膜修饰的电极可提供一种吸附界面，从而在循环伏安法测定中表现出更理想的电化学行为。该方法的可视化演示至关重要，因为合成过程包含重要的视觉提示，而薄膜的构建与表征涉及多个复杂的步骤和分析技术。NPC薄膜可通过浸渍循环法在经修饰的金电极或玻璃载片上组装，该方法交替使用MPC层和双功能连接分子。随后，可通过电化学或光学手段对这些层进行追踪，以达到所需的薄膜厚度。在通风良好的通风橱中合成金簇时，首先将 1.1 克四正丁基溴化铵溶解于 30 毫升甲苯中，再将 0.38 克硼氢化钠溶解于约 20 毫升 18 兆欧超纯水中，并置于冰上冷却至少 30 分钟。接下来，使用额外的 5 毫升超纯水，将氯金酸水溶液定量转移至四正丁基溴化铵的甲苯溶液中。为将水相中的金溶液转移至非水相中，需轻轻盖紧容器并剧烈搅拌 30 分钟。因此，将棕橙色的水相和澄清的非水相充分混合。将澄清的水相和棕橙色的非水相一同转移至分液漏斗中。弃去水相层，将非水相层倾入洁净的烧瓶中。向含有非水溶液的四氯氢或盐中加入C六和二比一的比例。搅拌30分钟，直至观察到颜色由红橙色变为浅黄色、近乎无色的溶液，表明生成了金一聚合物。将反应混合物转移至隔热冰浴中，在搅拌条件下冷却至0摄氏度，持续至少30分钟；随后定量且迅速地将预冷的硼氢化钠溶液加入反应混合物中，以在 thighs 存在下将金一还原为金属金。加入后，将立即形成深黑色的单层保护金簇（MPCs）溶液。将反应液在0°C下搅拌过夜。次日，将反应混合物转移至分液漏斗中。将水相弃入废液杯中并进行旋转蒸发。将非水相甲苯层蒸至接近完全干燥，烧瓶中残留浓稠的黑色油泥。加入乙腈使MPCs沉淀，并将溶液在带有橡胶接头和侧臂烧瓶的中等孔隙度玻璃砂芯漏斗装置中静置过夜，使用水流抽气泵进行抽滤。通过真空过滤收集MPCs，并用大量乙腈冲洗。电化学组装三明治电池后，在0.1摩尔硫酸和0.01摩尔氯化钾溶液中，以100毫伏每秒的扫描速率，在0.2至0.9伏、0.2至1.2伏和0.2至1.35伏的电位窗口内进行循环伏安法（CV）以清洁金基底。在标准条件下对清洁后的裸金基底进行循环伏安法（CV）测量双电层充电电流，标准条件包括在磷酸钾缓冲液（KPB）中，相对于银/氯化银参比电极，电位窗口为0.1至0.4伏，扫描速率为100毫伏每秒。弃去缓冲液，并用超纯水和乙醇各过量冲洗两次。将清洗后的金基底浸入约300微升的5毫摩尔C6乙醇溶液中，静置过夜，以形成有序的C6自组装单分子膜。从样品池中弃去C6溶液，并用乙醇和超纯水各过量冲洗两次。在标准条件下测量自组装单分子膜（SAM）的充电电流。弃去磷酸钾缓冲液（KPB），用超纯水和乙醇分别彻底冲洗两次。充电电流应显著降低。与裸金测量结果相比，将自组装单分子膜（SAM）修饰的金基底暴露于约300微升乙醇中的5毫摩尔NDT溶液中，静置一小时，使NDT连接分子在C6 SAM中充分分散。弃去NDT溶液，用乙醇和超纯水彻底冲洗两次，再用二氯甲烷冲洗一次。将金基底置于二氯甲烷中的MPC溶液中，并通过氮气缓慢鼓泡搅拌一小时。这是薄膜组装中的锚定MPC层。弃去MPC溶液，再依次用二氯甲烷、超纯水和KPB冲洗。在标准条件下测量MPC层的充电电流。弃去KPB溶液，并用超纯水和DIAM甲烷大量冲洗。将金基底暴露于约300微升的NDT溶液中，该溶液为五毫摩尔浓度的NDT溶于DIAM甲烷中，通过缓慢通入氮气搅拌反应20分钟。弃去NDT溶液，并用DIAM甲烷彻底冲洗，以沉积第二层MPC。将薄膜组件重新浸入DIAM甲烷的MPC溶液中，缓慢通入氮气鼓泡搅拌，静置一小时后再进行冲洗。随后在标准条件下再次测量MPC层的充电电流，并使用相同程序再次冲洗。如有需要，可继续沉积额外的MPC层。网络化 MPC 薄膜制备完成后，用 KPB 冲洗经薄膜修饰的基底，以将 AZ 蛋白吸附到 MPC 薄膜组装体上。将约 150 微升浓度为 5 至 10 微摩尔的 AZ 溶液（溶于 KPB）注入 E chem 三明治池中，盖紧后于冰箱中静置至少一小时。待 ECM 池恢复至室温后，用 KPB 充分冲洗，重新注入 KPB，并用氮气鼓泡 10 分钟。在 -0.25 伏至 0.25 伏的电位窗口内进行单层电化学研究，如循环伏安法（CV）。在 KPB 中以 100 毫伏/秒的速率扫描，用去离子甲烷冲洗经 3M PT MS 修饰的玻片，然后将其置于含去离子甲烷的 MPC 溶液中，在摇床上低速振荡条件下孵育一小时。通过将 MPC 锚定在硅烷的 ME 丙硫醇末端基团上，完成薄膜组装的第一层 MPC 构建。用二氯甲烷彻底冲洗载玻片，用氮气吹干，然后在将载玻片浸泡于二氯甲烷中的NDT溶液后，对载玻片进行紫外-可见光谱测定。将载玻片置于MPC溶液中，于低速摇床上振荡反应一小时。至此完成薄膜组装的第二层MPC修饰。用二甲基甲烷彻底冲洗载玻片，用氮气吹干，并对载玻片进行紫外-可见光谱扫描。随着更多的MPC层被吸附到薄膜组装体上，整个光谱范围内的吸光度应逐渐增加。将组装在经3M PT MS修饰的玻璃载玻片上的MPC薄膜转移至标准显微镜载玻片上。制备嵌入八-12环氧树脂，并使其增稠至少12小时。用环氧树脂填充一个梁式胶囊，然后将其倒置在MPC薄膜样品上。对胶囊施加压力，使气泡上升至胶囊顶部，从而在环氧树脂与MPC薄膜样品之间形成密封。在60摄氏度下使其聚合至少18小时，然后将封固的载玻片冷却至室温。将封固的载玻片置于铸铝加热板上，在200摄氏度下加热20秒，以促进将带有附着MPC的块体从快速胶片上分离。使用珠宝锯将含有薄膜的样品从光束胶囊块上切下，并将移除的部分放入硅胶平模中，使MPC薄膜面朝上，面向硅胶内部。在室温下将环氧树脂填充至硅胶模具中，并在60摄氏度下使其聚合至少18小时。随后将样品冷却至室温。使用Leica UCT超薄切片机和金刚石刀切割60至80纳米的薄片，切片方向垂直于刀刃边缘。将切下的薄片置于400目铜网的form VAR碳支持膜上，并对所示MPC薄膜组件的横截面进行透射电子显微镜（TEM）成像。以下是MPC薄膜生长过程中双层充电电流监测的结果，共进行了五次浸渍循环，交替暴露于MPC和NDT溶液中。随着每次浸渍循环的进行，充电电流系统性增加，表明MPC层在薄膜上不断累积。以下是在4.4毫摩尔磷酸钾缓冲液中，采用−0.25至+0.25伏电压范围、以100毫伏/秒扫描速率测得的典型AZ加成MPC薄膜组装循环伏安曲线（Graham法）。此处展示了在3M PT MS修饰的载玻片上，通过UV-vis光谱监测二醇连接MPC薄膜生长过程的代表性结果。一个浸渍循环包括将载玻片依次暴露于NDT交联剂溶液，随后暴露于MPC溶液。每次后续浸渍均会导致薄膜厚度增加，同时吸光度相应升高。该图展示了通过DIA连接的MPC薄膜组装体的透射电子显微镜截面图像分析。插图显示了用于薄膜组装体透射电镜分析的六甲醇功能化MPC的典型透射电镜图像。使用 Image J 测定 MPC 的平均金核直径约为 2 纳米。观看本视频后，您应充分了解如何合成、表征和组装 MPC 金纳米薄膜，此类薄膜可作为氧化还原蛋白吸附及后续电化学分析的界面。通过调整 MPC 的合成方法以及颗粒内部的连接机制，该薄膜组装过程可轻松适应多种不同类型蛋白质的吸附需求。尽管该方法可为蛋白质在经修饰的合成平台上的电化学吸附提供见解，但也可应用于电子传递模型系统、生物传感方案以及合成生物相容性材料的开发。

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