单层的合成，装配和表征蛋白质单分子膜的电化学保护的金纳米粒子薄膜
2011年10月4日
Alkanethiolate稳定的黄金被称为单层保护集群（储值卡）胶体合成，特点，并组装成薄膜作为一个简单的氧化还原蛋白的蛋白质单层的电化学像吸附接口绿脓杆菌阿苏林（AZ）和细胞色素 C（CYT C）。
以下实验的总体目标是合成称为单层保护簇或 MPC 的烷基化稳定金纳米颗粒，并将这些材料组装成薄膜组件，用作 azarin 蛋白单层电化学的吸收界面。这是通过首先用有机配体保护金胶体以产生被 Alcan Pholate 薄膜包围的金纳米颗粒来实现的。接下来，MPC 被锚定到金和玻璃基板上，并联网成多层共价连接的薄膜，其生长通过光学和电化学测量以及横截面显微镜进行跟踪。
然后电子转移蛋白 azarin 在界面处被吸收，并对蛋白质单层电化学进行循环拱室遥测。结果表明，通过该程序创建的 MPC 膜界面允许基于 MPC 膜对吸附蛋白进行更优化的电化学分析，提供更均匀的吸附界面和缺乏传统距离依赖性的快速电子转移动力学。与传统蛋白质电化学相比，该技术的主要优点是，当纳米颗粒膜提供吸收界面时，电极会发生变化，从而产生更理想的电化学行为，如循环光度法测量的那样。
这种方法的视觉演示至关重要，因为合成包括重要的视觉线索，而电影构建和表征涉及多个复杂的步骤和分析技术。NPC 薄膜可以通过交替 MPC 层和碎连接分子的浸渍循环方法组装在改性的金电极或载玻片上。因此，这些层可以通过电化学或光学方式跟踪到所需的薄膜厚度。
要在通风橱下合成金簇，首先将 1.1 克四氧化氢铵溶解在 30 毫升甲苯中，将 0.38 克硼氢化钠溶解在约 20 毫升 18 兆欧姆超纯水中，并使其在冰上冷却至少 30 分钟。接下来，使用另外 5 毫升超纯水，将四氯氢溶液定量转移到 tetra ide 溴化铵甲苯溶液中。为了将金水溶液相转移到非水溶液中，请轻轻加盖并剧烈搅拌 30 分钟。
因此，焦橙色水相和透明非水相充分混合。将透明的水性和烧焦的橙色非水相转移到分液漏斗中。丢弃水层，将非水层倒入干净的烧瓶中。
将 C 6 和二比一的比例添加到氢四氯或含有非水溶液的速率中。搅拌 30 分钟，形成金一聚合物，从红橙色变为淡黄色、几乎无色的溶液。将反应混合物转移到绝缘的冰浴中，在定量搅拌下冷却至零摄氏度至少 30 分钟，然后迅速将冷却的硼氢化钠溶液加入反应混合物中，以便在大腿存在的情况下将金 1 还原为金属金。
添加后，它将立即形成单层保护金簇或 MPC 的浓稠黑色溶液。第二天在 0 摄氏度下搅拌反应过夜。将反应混合物转移到分液漏斗中。
将水层丢弃到废烧杯中并旋转。将非水性甲苯层蒸发至接近完全干燥，在烧瓶中留下沉重的黑色污泥。通过添加乙基丁腈沉淀 MPC，并使用带有橡胶配件的中等孔隙玻璃熔块和带有吸气器的侧臂烧瓶让溶液静置过夜。
通过真空过滤收集 MPC，并用大量乙基丁腈冲洗。在电化学组装夹层电池后，通过在 0.2 至 0.9 伏、0.2 至 1.2 伏和 0.2 至 1.35 伏的电位窗口中执行循环体积遥测或 CV 来清洁金衬底，在 0.1 摩尔硫酸和 0.01 摩尔氯化钾的溶液中以 100 毫伏/秒的速度。通过在标准条件下进行 CV 来测量清洁后的裸金衬底的双电层充电电流，其中包括 0.1 至 0.4 伏的潜在窗口，与在磷酸钾缓冲液或 KPB 中以每秒 100 毫伏扫描的氯化银相比。
丢弃缓冲液，用超纯水和乙醇过度冲洗两次。将清洁后的金基材暴露在约 300 微升 5 毫摩尔 C 6 乙醇溶液中，并静置过夜以形成有序的 C 6 Sam。丢弃细胞中的 C six 溶液，并用乙醇和超纯水过度冲洗两次。
在标准条件下测量 SAM 的充电电流。丢弃 KPB 并用超纯水和乙醇过度冲洗两次。充电电流应明显减小。
从裸金测量结果来看，将 SAM 改性金基材暴露在约 300 微升 5 毫摩尔 NDT 乙醇溶液中，并静置 1 小时，以将 NDT 连接分子分散在 C 6 Sam 中。弃去无损检测溶液，用乙醇和超纯水彻底冲洗两次，然后用二胺甲烷冲洗一次。将金衬底暴露在 DIAM 甲烷的 MPC 溶液中，用氮气缓慢鼓泡 1 小时。
这是薄膜组件的锚定 MPC 层。丢弃 MPC 溶液，再次用二氯甲烷超纯水和 KPB 连续冲洗。在标准条件下测量 MPC 层的充电电流。
丢弃 KPB 并用超纯水和 DIAM 甲烷过度冲洗。用氮气缓慢鼓泡 20 分钟，将金衬底暴露在约 300 微升 5 毫摩尔 NDT 溶液的 DIAM 甲烷中，并搅拌。丢弃无损检测并用 DIAM 甲烷彻底冲洗以沉积第二层 MPC。
将薄膜组件重新浸入 DIAM 甲烷的 MPC 溶液中，并在冲洗前用氮气缓慢鼓泡一小时，使其搅拌。然后在标准条件下再次测量 MPC 层的充电电流，并使用相同的程序再次冲洗。如果需要，可以放置额外的 MPC 层。
网络化的 MPC 薄膜完成后，用 KPB 冲洗薄膜修饰的底物，以将 AZ 蛋白吸收到 MPC 薄膜组件上。将约 150 微升 5 至 10 微摩尔的 AZ 溶液注入 E chem 夹心池中，并加盖并冷藏至少一小时。ECM 池恢复到室温后，用 KPB 彻底冲洗，用 KPB 重新填充 ECM 池，并用氮气使 KPB 鼓泡 10 分钟。
在负 0.25 伏至 0.25 伏的电位窗口中执行单层电化学研究，例如 CV。在 KPB 中以每秒 100 毫伏的速度扫描用 DIAM 甲烷冲洗 3M PT MS 改性载玻片，并将其放入 DIAM 甲烷的 MPC 溶液中 1 小时，同时在摇床上低速搅拌。通过将 MPC 锚定到 Sane 的 ME captan 端基，完成了薄膜组件的第一层 MPC。
用 Dior 甲烷彻底冲洗载玻片，用氮气干燥，并在将载玻片浸泡在二甲烷的 NDT 溶液中后，采集载玻片的紫外可见光谱。将玻片放入 MPC 溶液中 1 小时，同时在摇床上低速搅拌。这样就完成了薄膜组件的第二个 MPC 层。
用 DIAM 甲烷彻底冲洗载玻片，用氮气干燥，并采集载玻片的紫外可见光谱。随着额外的 MPC 层被薄膜组件吸收，整个光谱的吸光度应该增加。将组装在 3M PT MS 改性载玻片上的 MPC 薄膜连接到标准显微镜载玻片上。
准备嵌入的 8 个 12 环氧树脂，并使其增稠至少 12 小时。用环氧树脂填充束胶囊，并将其倒置在 MPC 薄膜样品的顶部。对胶囊施加压力，使气泡上升到胶囊顶部，从而在环氧树脂和 MPC 薄膜样品之间形成密封。
让它在 60 摄氏度下聚合至少 18 小时，然后将封固的玻片冷却至室温。将已安装的载玻片在 200 摄氏度的铸铝热板上加热 20 秒，以便于在快速胶片上去除带有附加 MPC 的块。使用珠宝商锯片将含有薄膜的样品从束流胶囊块上切下，在硅平板模具中去除部分，MPC 薄膜面朝上面向硅内部。
在室温下用环氧树脂填充硅孔，并使其在 18 摄氏度下聚合至少 60 小时。然后将样品调至室温。使用金刚石刀在 Leica UCT 超薄切片机上切割 60 至 80 纳米的薄样品切片，切割垂直于刀口的切片，将切片放在 400 目铜网格上形成 VAR 碳支撑膜，并拍摄 MPC 薄膜组件横截面的 TEM 图像所示。
以下是 MPC 薄膜生长的双层充电电流监测结果，总共五个浸渍周期，涉及交替暴露于 MPC 和 NDT 溶液。充电电流随着每个 diping 循环而系统地增加。在胶片上添加 MPC 层。
这是用于 AZ 的典型循环 Volta Graham 对 MPC 薄膜组件进行添加吸收，使用负 0.25 至正 0.25 伏的电位窗口在 4.4 毫摩尔磷酸钾缓冲液中以每秒 100 毫伏扫描。这里显示了在 3M PT MS 改性载玻片上二醇连接的 MPC 薄膜生长的代表性紫外可见分光光度计监测。浸渍循环包括将载玻片暴露于 NDT 连接剂溶液中，然后暴露于 MPC 溶液中。
每次后续浸渍都会导致薄膜厚度增加，同时吸光度增加。该图显示了 DIA 连接的 MPC 薄膜组件的透射电子显微镜横截面图像分析。插图显示了薄膜组装 TEM 分析中使用的六甲醇功能化 MPC 的典型 TEM 图像。
使用图 J 确定 MPC 的平均金芯直径约为 2 纳米。观看本视频后，您应该对如何合成、表征和组装 MPC 黄金窄帕胶片有很好的了解，这些胶片充当氧化还原蛋白吸收和后续电化学分析的界面。通过纵 MPC 合成程序以及内部颗粒键机制，可以很容易地适应薄膜组装过程，以适应各种蛋白质的吸收。
虽然这种方法可以深入了解蛋白质吸收对改性合成平台的电化学，但它也可以应用于电子转移建模系统、生物传感方案和合成生物相容性材料的开发。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究重点关注烷硫醇稳定的金胶体的合成和表征，即被称为单层保护簇（MPCs）的单层保护簇。这些MPCs被组装成薄膜，用于蛋白质单层电化学，特别是氧化还原蛋白，如假单胞菌蓝铜蛋白和细胞色素c。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米粒子合成
- 电化学
- 蛋白质相互作用
背景
- 金纳米粒子可以用有机配体稳定。
- 单层保护簇（MPCs）增强电化学性能。
- 蛋白质单层电化学对于理解电子转移至关重要。
- 薄膜可以优化蛋白质的吸附界面。
研究目的
- 合成MPCs以改进电化学分析。
- 创建更均匀的蛋白质吸附界面。
- 使用MPC薄膜研究蛋白质的电子转移动力学。
所用方法
- 合成烷硫醇稳定的金纳米粒子。
- 将MPCs组装成薄的多层薄膜。
- 光学和电化学测量以跟踪薄膜生长。
- 循环伏安法用于蛋白质单层电化学。
主要结果
- MPC薄膜为吸附蛋白提供了优化的电化学行为。
- 观察到快速的电子转移动力学，具有较少的距离依赖性。
- 用纳米粒子薄膜修饰的电极增强了电化学分析。
- 结果表明相比传统方法有显著改进。
结论
- MPC薄膜作为蛋白质电化学的有效界面。
- 该技术在电化学行为和动力学方面提供优势。
- 这种方法可以引领蛋白质分析方法的进步。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables reproducible, homogeneous protein adsorption interfaces for redox protein electrochemistry, addressing a key challenge in biosensor development and electron transfer modeling. By eliminating distance-dependent electron transfer limitations observed in traditional alkanethiol SAM systems, it improves predictive confidence in protein-electrode interaction studies. The adaptable film assembly supports mechanistic de-risking in early discovery by providing a tunable platform for diverse protein adsorption mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of protein-electrode interactions through controlled adsorption environments that reduce mechanistic ambiguity in redox protein studies.
- Operational Value: Supports functional target validation by providing a stable, reproducible interface for assessing electron transfer kinetics of candidate proteins.
- Predictive Value: Enhances confidence in lead identification by delivering quantitative, distance-independent electron transfer data critical for structure-function relationship modeling.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, multilayer films with trackable growth via electrochemical and optical measurements, enabling reliable platform qualification for protein screening.
- Reproducibility: The dip-cycle assembly method ensures layer-by-layer control, supporting assay standardization across runs and laboratories.
- Scalability: Films can be assembled on both electrode and glass substrates, allowing parallel optical and electrochemical monitoring for high-throughput adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: The protein monolayer electrochemistry (PME) readout directly interfaces with preclinical validation by modeling physiological electron transfer processes in a reductionist system.
- Biomarker Alignment: Enables screening of redox-active proteins or mutants with altered electron transfer properties, supporting translational biomarker discovery in oxidative stress pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides go/no-go criteria based on electron transfer kinetics and adsorption homogeneity, reducing failure risk in biosensor or ET model development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where controlled protein immobilization and quantitative electron transfer measurement inform early structure-activity relationships.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of protein surface interactions and electron transfer mechanisms by eliminating confounding variables from heterogeneous adsorption.
- Screening: Delivers assay-ready platforms with quantifiable film growth metrics, enabling consistent protein immobilization for comparative screening campaigns.
- Analytics: Generates electrochemical (double-layer charging current, cyclic voltammetry) and optical (UV-Vis) outputs that allow teams to correlate film thickness with functional protein response.
- Translational Research: Connects discovery-stage protein characterization to preclinical modeling by simulating interfacial electron transfer in biomaterial contexts.
- Enterprise Reuse: The modular film assembly—separable synthesis, linkage, and protein adsorption steps—allows reuse across multiple protein targets and electrode materials.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein electrochemistry by providing a tunable, homogeneous interface that minimizes artifacts from irregular adsorption.
- Operational Value: Enables standardization through measurable film growth via charging current and absorbance, reducing variability in protein immobilization efficiency.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality in biosensor development by delivering mechanistic electron transfer data less prone to distance-dependent artifacts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of protein candidates based on quantifiable electron transfer kinetics and adsorption stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle synthesis, electrochemical techniques, and protein handling under anaerobic or controlled conditions.
- Depends on access to UV-Vis spectrophotometers, potentiostats, TEM, and nitrogen-purged electrochemical cells for film assembly and protein adsorption.
- Necessitates standardization of dip-cycle timing, rinsing protocols, and solution concentrations to ensure film uniformity across users and labs.
- Adaptation to different proteins requires modification of ligand chemistry (e.g., carboxylate for electrostatic linkage) or linkage chemistry while maintaining film integrity.
- Practical limitations include sensitivity to aggregation during synthesis and the need for rigorous purification to remove excess ligands or reducing agents that could interfere with protein adsorption.
