Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Jane 通过体内电穿孔 Ling Wang、Han Jang 和 John Burgandy，俄勒冈健康与科学大学俄勒冈听力研究中心转移到发育中的小鼠内耳。我叫 John Burgandy。我的实验室位于俄勒冈健康与科学大学的俄勒冈听力研究中心。

我叫 Ang。我是 Johns 实验室的海报。我是 Ang，也是 Johns 实验室的研究助理。

我们的演示分为四个部分。首先是腹剖腹手术。我们演示了钠笔、基于巴比妥的麻醉、如何测试麻醉的充分性、角膜保护、手术部位的准备、消毒小鼠存活手术数据表、手术室腹侧中线切口穿过皮肤和腹壁以及子宫角的外化。

第二部分是经子宫显微注射。我们展示了胚胎在胚胎第 11.5 天和胚胎第 12.5 天的胚胎、胚胎、重新定位、显微注射、移液管、制造和显微注射到 Otis 中的透照。第 3 部分是体内电穿孔。

我们展示了胚胎第 11.5 天小鼠 O 辅助的桨式电极放置和电穿孔。第四部分是代表性结果。我们显示了 GFP 在胚胎晚期和出生后早期耳蜗中的表达。

这是由于在胚胎第 11.5 天腹侧剖腹手术中用表达质粒对 Otis 进行体内电穿孔。通过抓住脖子、尾巴和左后肢后面的皮肤来牢固地固定母缆。用 70% 乙醇擦拭腹部后，腹膜内注射基于戊巴比妥钠的麻醉剂。

将小鼠放在其家笼内四到五分钟，让麻醉剂发挥作用。捏脚和尾巴用于评估麻醉的充分性。这个水坝会因尾部挤压而关闭，还需要两分钟才能对有害刺激失去反应。

将无菌眼药膏涂抹在眼睛上，以保护角膜免受干燥。我们在化学通风橱中准备手术部位，以尽量减少毛皮和皮屑的扩散。用细刀片剃掉皮毛，露出覆盖腹壁的皮肤。

完全去除毛皮有助于术后切口愈合。腹部皮肤的消毒是通过交替通过 70% 乙醇 Betadine 和 70% 乙醇来实现的。始终从喙部滑动到蛤蜊处，并使用新的手术棉球或棉签涂抹器。

对于每一次通过，我们都会评估消毒过程中呼吸的深度和质量，以确保坝没有反应。在第二次 70% 乙醇通过后，我们立即将该死的腹面放在无菌窗帘上，并将她放在加热垫上两到三分钟以温暖她。这是在小鼠存活手术日志表上记录术前数据的便捷时间。我们附上了小鼠存活手术数据表作为补充信息。

考虑包括数据表和您的动物护理方案，以便您的机构动物护理和使用委员会可以看到您将如何监测术前和术后数据。我们为每个手术对象完成一份日志表。我们更喜欢在无菌环境中进行手术，尽管这通常不是啮齿动物所必需的。

工作表面与鼓风机电机和增压室外壳分开，因此不会将振动传递给用户。在显微注射过程中，我们附加了我们对层流罩所做的修改的示意图，以促进子宫内基因转移，基本变化是低 wat 挑战和轨道照明切口和仪器电源线的隐藏插座，以及用于附件电路的布线路径。手术室包括电动乳酸环形静脉输液袋、温水浴、XY、Z 机械手、立体荧光、解剖显微镜、光纤光源和手术器械。

脚踏板用于触发微型注射器，electro perter 进入焦点。内窥镜手术器械在高压灭菌器中消毒。必须使用玻璃珠灭菌器或在小鼠之间重新消毒器械，或通过重新高压灭菌针头驱动器。

Balli 剪刀、环形镊子和血管镊子是必不可少的工具。腹侧中线切口，用血管镊子抓住皮肤，用球形剪刀切除外皮，将切口延长 10 至 14 毫米。识别称为白线的连接组织的白色无血管带，腹部腹侧中线用球形剪刀切开线性白线。

小心不要划伤肠道或腹股沟脂肪垫。立即用无菌的 Prewarm 乳酸林格溶液冲洗腹部。评估皮肤和腹壁的切口部位是否有出血。

，用钝钳直接按压将阻止轻微出血，用环形镊子将左右子宫角外化。用镊子的一个环状端轻轻抓住右子宫角，然后将子宫拉向中线切口。用另一只手轻轻纵挡膜的侧面，以促进钩住子宫。

镊子从不用于压缩子宫并将其拉出。由于这可能会损坏子宫脉管系统或胚胎，因此对左子宫角重复外化程序。立即用预热的乳酸林格溶液冲洗新外化的子宫角，轻轻地重新插入体内脂肪垫或肠道（如果它们与子宫外化）。

这种情况并不常见。第二部分 子宫显微注射。dam 布置在长工作距离物镜下方，软电缆光纤灯靠在子宫壁上。

用空闲的手的手指轻轻按压子宫。便于识别胚胎的方向。来自光纤电缆的光应处于准确评估胚胎方向所需的最低强度。

强光会将热量传递到子宫，这可能会导致并发症。我们一只手握住光纤灯和子宫，用另一只手上的手指通过轻柔的触诊重新定位胚胎。我们在以下三个视频中通过显微镜 EC 剪辑和子宫观察到的常见胚胎方向进行了演示。

观察者将看到我们在透射照明期间看到的微观视图，尽管在黑白子宫的透射照明允许检测胚胎在体内的方向。在此示例中，胚胎处于倒立位置，其腹面面向观察者。通过来回拨动子宫，我们可以检测到左右后肢、尾巴和左眼头骨。

在这个例子中，胚胎再次处于倒立位置，但相对于前后轴旋转了约 90 度。通过轻轻地来回切换子宫，我们可以看到定义左后肢和左肢的桨形状。后脑也很明显。

胚胎处于直立位置，左侧面向观察者。新生的第四脑室可在后脑中检测到一个明亮的斑块。左眼头肢、左四肢和左后肢也很明显。

对子宫的轻柔压力会稍微改变胚胎的方向，以便能够检测到初级头静脉的主干及其前支和后支，它们分别用白色和黑色星号标记。正如我们将看到的，Otis 位于初级头静脉的前支和后支之间的中间。奥蒂斯本身无法通过透照透过子宫看到。

我们在两个连续的视频显微镜剪辑中演示了如何重新定位胚胎以进行显微注射到 Otis assist 中。目标是确定允许对 otis 在侧头中的位置进行插值的胚胎标志。Mesen con，我们的目标是将胚胎从背侧重新定位到侧面位置，以便我们可以识别初级头部静脉。

中脑第四脑室和左肢体在背侧位置很明显。对子宫的轻柔压力会使胚胎的方向从背侧转移到稍后。左眼头颅、中脑和第四脑室很容易看到。

由星号指示的初级头静脉及其后支也很明显。初级头静脉的前支未被明确检测到。我们的目标再次是确定胚胎的方向，使其能够识别初级头静脉，但在适合子宫显微注射的更高放大倍率下。

子宫血管、蜕膜带和左眼在这个侧位视角中可见。对子宫的轻柔压力会改变胚胎的位置，因此我们可以检测到左眼第四脑室。初级头静脉及其后支以星号为标志，初级头静脉及其分支构成美式橄榄球立柱的形状。

囊无法通过子宫看到，但它位于立柱的中心。Lynn 已为一个胚胎启动了注射序列。她反式照亮子宫，重新定位胚胎以进行显微注射，并将装满快速绿色的微量注射移液管带入田间。

微量注射移液器连接到由 X、Y、z 微米纵器固定的移液器支架上。机械手磁性支架连接到带有特氟龙底座的钢板上，可轻松对微量注射移液器进行粗略定位。使用机械手上的前向千分尺控制旋钮适当地推进针头。

制造的移液器对于早期 Otis 期小鼠胚胎的创伤性显微注射至关重要。我们用水平移液器拉拔器拉动厚壁 borosil 玻璃毛细管。A 所示的移液器是用镊子在大约 14 至 16 微米的外径位置手动断裂的，如 B 中的箭头所示。

我们将移液器斜切约 20 度以锐化移液器吸头，如图 D 所示，用于拉动和斜切显微注射移液器的参数在随附的文本中提供。在接下来的两个视频显微镜剪辑中，我们在胚胎第 11.5 天和第 12.5 天展示了显微注射到小鼠耳部辅助中。我们的目标是证明子宫显微注射到胚胎日，11.5 小鼠 otics。

首先，我们在子宫不存在的情况下注射耳部，以明确显示正确靶向注射的效果。然后我们演示正宗的经子宫显微注射。对于第一次注射，将子宫切开，使内脏囊挤出覆盖在内脏卵黄囊上的蜕膜带。

胎盘仍然附着在子宫上，胚胎是活的。在局部切除子宫后，我们可以看到第四脑室、初级头静脉及其前支和后支、移液管和白色囊肿的大致位置。在该注射序列开始时，在内脏卵黄囊脉管系统中检测到血流。

移液管通过内脏卵黄囊推进，将 dai 注射到 osis note、背侧内淋巴管和耳部在立柱中心的位置。耳部位于初级头静脉的前支和后支之间，子宫显微注射到胚胎日。11.5 小鼠耳部需要检测初级头静脉及其至少一个分支，以估计耳部辅助的位置。

在这个图解示例中，我们的目标，初级头静脉的前支和后支都被检测到，OUC 区域标记为白色。胚胎的更真实表现是，仅检测到初级头静脉的主干及其一个分支，并且示例显示仅看到初级头静脉的后支，但这足以解释 otics 的位置。PT 通过子宫推进，并将染料注射到 otics 中。

我们等待 30 秒，让造影剂从羊膜腔中清除，此时我们可以看到背侧的内淋巴管和前庭。我们以我们刚刚注射的囊肿的胚胎的低放大倍率视图作为结论，以提供解剖学视角，在这个视图中，可以看到第四脑室、左眼和子宫脉管系统。我们展示了对胚胎第 12 天的小鼠耳囊肿进行反式和显微注射，并将显微注射到后脑新生的第四脑室中。

透照使我们能够在这个左侧视角以及眼睛中检测头部初级静脉。移液管通过子宫进入耳囊，然后注射以充满其管腔。为了注射第四脑室，我们将胚胎旋转 90 度以获得后脑的背视图。

注射的左侧囊肿现在位于左侧。移液管穿过子宫，快速绿色与 lor 混合。将结合的葡聚糖注射到第四脑室中。

请注意，注射的染料体积在体内不会进入中脑。注射后评估荧光以验证葡聚糖在第四脑室中的定位。然后将胚胎从背侧位置重新定位到侧面位置。

在这个侧位视图中，内淋巴管位于第四脑室的腹侧。体内荧光验证了葡聚糖在第四脑室中的定位。出生时，我们使用 epi 荧光筛选幼仔在第四脑室中的绿色荧光。

解剖显微镜下后脑发出绿色荧光的幼仔有一个内耳，该内耳在胚胎发生第三部分体内电穿孔过程中纵。用表达质粒填充囊肿后，用预热的乳酸林格溶液新鲜冲洗子宫。透射有助于将 ODU 囊肿在电极场中居中。

光纤灯的金属头从子宫表面缩回。在启动方波脉冲序列之前，我们在下一个视频显微镜剪辑中演示了体内完整的电穿孔循环。胚胎日 11.5 小鼠耳囊肿的电穿孔需要在子宫上轻轻放置桨式电极。

在这个例子中，左侧耳囊肿已经充满了表达质粒，子宫已经用乳酸林格菌新鲜冲洗。阴极相对于填充的耳囊肿横向定位，和 ode 位于化序开始时的内侧，耳囊肿位于桨场的中心。轻轻压缩子宫，并通过脚踏板开关启动方波脉冲序列。

理想情况下，每个脉冲提供 60 到 100 毫安的电流。然后释放子宫并立即冲洗。用环形镊子轻轻按压，将新鲜冲洗的子宫送回腹腔。

一旦子宫内化，腹腔就会用大约 4 mil 的乳酸林格冲洗，在腹腔中留下大约 1 mil 的乳酸林格，以帮助维持 dam 的水合作用，dam 在腹部手术后会立即喝比平时少的水。使用针头驱动器用可吸收缝合线闭合腹壁和皮肤。我们的针头驱动器有一个内置的剪刀，可以简化闭合。

我们更喜欢对腹壁和皮肤进行连续缝合。我们每隔一针锁定一次，以在切口部位提供额外的支撑。在将 dam 放入恢复笼之前，我们会皮下注射非甾体抗炎药。

请咨询您的兽医工作人员，了解您所在机构的动物护理和使用委员会首选哪种预防性镇痛药。坝子坐落在无菌窗帘中，并放置在加热的回收笼的地板上。回收笼包含筑巢材料、用于覆盖的红色管子、实验室食物和一个水瓶。

手术后早上，将笼子重新组装，并在顶部安装过滤器罩。Dam 梳理得很漂亮，可以走动，并且能够用后肢保持平衡，以询问敞开的笼子顶部。腹部的缝合线干净、干燥，没有分离、发红或肿胀的迹象。

我们附上了一份文件，讨论了子宫内基因转移的动物护理方案开发。该文件包含的语言可能在您与动物护理和使用委员会协商后设计机构特定方案时有用。第四部分，代表性结果。

代表性结果面板 A 和 B 显示了来自出生后第 6 天幼崽的代表性耳蜗，其 Otis 在胚胎第 11.5 天注射了增强的绿色荧光蛋白表达质粒，然后注射了电。耳蜗侧壁从中期和心尖切除。从耳蜗的基部到中期仅存在 GFP 表达，并遵循图 B 中所示的毛细胞标志物肌球蛋白 7 A 的分布。

18.5 用肌球蛋白 7 A 抗体转染的小鼠 corde immune 器官分布在整个 corde 器官中。图 D 显示了胚胎日的高放大倍率共聚焦投影。18.5 Cin 染色的 Corde 小鼠器官。七。

在内毛细胞和外毛细胞、指间细胞、柱细胞和 TER 细胞中检测到 GFP 表达。电穿孔介导的基因在胚胎第 11.5 天转移到 Otis 11.5 转染祖细胞，在 corde 器官内产生所有组成细胞类型。