E15小鼠胚胎在子宫内侧脑室注射和电穿孔

大家好，我是来自 Krete 实验室的 William Tis。今天，我和其他人将向您展示 E 15 小鼠胚胎的宫内注射。大家好，我是 Laura Elias。

今天，我将向您展示如何准备显微注射移液器，并加载移液器以进行我们将要进行的脑室内注射和电穿孔。我叫 David Castaneda，今天我将协助小鼠胚胎的体内子宫内注射。我们将质粒 DNA 注射到发育中的小鼠胚胎的侧脑室中。

我们以这些胚胎的 CE 皮层为目标，以便我们通过神经胶质细胞表达不同的分子，并在以后的发育中成为神经元。在进行这些宫内注射时，您需要使用一些重要的工具，我将向您展示它们。现在。我们使用一个更自由的几个附加镊子。

一对是锯齿状的，另一对末端有小齿。我们使用一对止血钳。这是一把剪刀。

然后我们使用这两个订书机。这是我们用于老鼠的较大的。这是我们用于小鼠的较小的一个。

使用七号订书钉，这是使用九号订书钉，它们只是弹簧加载的。我们在这里用来协助手术的一些东西，我们只使用一个简单的双头光纤光源。我们使用加热垫，它只是让温暖的 wa 热水通过那里循环以保持温暖。

工作表面，我们使用 BTX 制造的 por 电穿孔系统。我们有几种不同尺寸的桨，我们根据胚胎的大小来使用。蓝色的一面是积极的一面。

好的，那么对于小鼠，我们使用 iso 氟蒸发器。我们发现它提高了母亲和胚胎的存活率。它还使我们能够以非常可控的方式非常快速地将动物带入和退出意识。

因此，我们发现它非常有用。好了，现在我们要对注射移液器进行斜面处理。这一点非常重要，这样您的移液器就要有一个足够大的开口，这样您就可以加载 DNA，而且它非常非常锋利，这样在注射时不会损坏胚胎。

如果你在注射时损坏了胚胎，你的死亡率就会高得多。所以，这并不好。所以这实际上是一个非常重要的过程，就像这个手术一样。

首先，我们要在这块旋转的斜面石头上放一些水。然后我们要拿，让我们看看这里，只是一根、一根棍子。我们将用胶带将刚刚拉动的移液器放在这根棍子上。

我们将使用其中一个微型机械手将移液器固定在斜面上，并让它在这里斜面。所以，只需放置它，我们使用显微镜来观察移液器的尖端。我们只需将其直接放在斜面顶部的水中，以便有一点压力。

你可以看到尖端压在石头上。并让它斜切一段时间，你知道的，至少 15 分钟。我喜欢让他们甚至呆一个小时。

有时它们只是变得非常非常锋利，但这绝对取决于每个人将移液器斜切多长时间。好了，我们在这里，您可以看到在顶部我们有一个移液器，它已被拉出，但尚未斜面。因此，虽然它很尖锐，但它没有任何开口，你可以通过它加载你的 DNA。

现在底部移液器已经斜面，您现在可以看到这个漂亮的斜开口，这将允许您加载 DNA，但它仍然有一个锋利的尖端，因此您可以注射而不会造成任何损坏。好了，现在我们要用 DNA 填充我们的注射移液器。因此，以无内毒素的方式制备 DNA 非常重要，这样在注射 DNA 时就不会注射任何脂多糖。

所以我们要取我们的 DNA，实际上在这里，准备好我们的 paraform。所以你要在这里制作你的 paraform，你要收集你的 DNA，把它作为一个小点放在这个 para film 上。然后我们要取，所以我通常每 10 微升 DNA 取一点，我通常用的是从一微升到 1.5 到 1.7 微克。

我将使用大约 1 微升的这种快速绿色染料。这只是为了帮助我们定位注射并确保我们已成功注射到心室。那么，我将这种快速的绿色染料与我的 DNA 混合。

然后，您拿起注射电极，我们将通过向后拉柱塞来填充移液器。您可以在此处看到，如果移液器正确斜面并且具有足够大的开口，则 DNI 应该很容易加载。有时您只需来回移动柱塞即可帮助它正确加载。

然后，您可以像这样加载移液器。因此，我们将 DNA 完全加载到移液器中，即可进行注射。好的，我现在要用酒精和碘酒清洗动物，但首先我当然想捏一下脚趾，以确保动物完全在下面，看起来不错。

所以我可以继续开始。我从老鼠开始，我们做一系列三个系列，其中从乙醇开始。好的，碘。

为了最大限度地降低感染风险，请注意，当 William 打开湿巾时，他会用手指没有接触的部分清洁动物。这样才能最大限度地使该区域保持清洁。其次，他只擦拭一次，以避免将细菌散布在腹部表面。

好的，太好了。现在我要清理一下，我们戴上一些外科手套。好了。好了。现在我要打开鼠标，取出子宫角，先捏一下皮肤

让我在这里再捏一下脚趾，以确保她完全在下面，这很好。所以我会捏住皮肤，在那里画一点波纹，然后竖起来，这样我就更容易剪了。同样，我们想沿着动物的中线做切口，以避免任何血管。

我通常像那样切开皮肤，然后把它分开，露出肌肉。一旦你这样做了，你就可以很容易地看到肌肉中的中线。它非常明确。

我要在那里剪一些肌肉，这是一个大小合适的切口。我真的不想再大了。然后我用这个自由剂来抬起肌肉和皮肤，把它拉到一边，然后我在这里做一个非常温和的探针，尝试将自由剂放在两个胚胎之间，在两个胚胎之间，这样我就可以轻轻地把它们拉出来，而不会损坏它们。

有时它比其他方法更容易。好了。所以，只要轻轻地把它拉过来，一旦我把它拉过来，我就可以把他们推出去。

永远不要捏胚胎很重要，但你只想引导它们，只是轻推它们。一旦你把它们拿出来，我想确保它们总是保持非常湿润。您不想让它们干燥。

让我们看看，我在这里再次使用我的自由人，四处试探。好了。真棒。

所以我总是想确保我把它们都取出来，因为如果你不检查卵巢，很容易把一个留在里面。所以我总是非常轻柔地再次将它们拉出，但寻找并看到末端的卵巢，它就在那里。它看起来就像这只动物身上的一小块红色组织。

然后把它们翻过来，回来检查另一边，我可以看到它们在那里。所以一定要让他们保持水分，我们已经准备好了。我想指出的是，你不要，你应该非常轻柔地抓住胚胎，只抓住胚胎。

不要抓住血管所在的地方，因为它们会变得很容易受损，而且它们会受损，动物会出血，存活率会急剧下降。所以我们首先要确定的是头部在胚胎中的位置，我们想要注射 DNA。我们通过轻轻旋转动物并观察腹侧、每个腹侧部分来做到这一点。

所以在这个特定的例子中，我们的头在我的右边，尾巴靠近我的左边。中线在这个位置，William 将继续以适当的方式定位胚胎，这样我就可以像在大鼠中一样注射它。我总是把它们放在头上，妈妈的右侧朝向我。

所以我现在就开始吧。好的，你可以看到那里的左地板杆，稍微移动一下，你肯定可以看到那里的中线。我会试着把它调高一点，这样它就对 David 有利了。

好的，现在我要继续注射左心室。我们在这里可以看到，左心室完全、完全充满了 DNA。我们可以看到一些死亡已经扩散到右心室，也扩散到这里的第三心室和第四心室。

这是注射良好的一个很好的指标。所以现在我们继续将 DNA 电入细胞中。这里重要的考虑因素是知道哪个电极是正极。

我们知道这里带有蓝色手柄的那个是正极，那一侧应该位于我们想要将 DNA 电穿孔到的一侧。所以既然我们有，我们向左心室注射了大部分 DNAI，将正极像这样定位在左侧，然后我们将施加五个脉冲，就是这样。在 PBS 中使电极完全湿润很重要，这样电极和子宫之间的接触是好的，电脉冲的传输是适当的。

好了，现在探索已经完成，我将继续将角放回内部。我要做的是，我非常轻柔地将角移到一侧，伸手到这里，抓住肌肉和皮肤，然后轻轻地、轻柔地回到那里。好的，很好。

小心膀胱。我可以做另一边。然后我们所做的就是给她一点点摇晃，让他们在那里安顿下来。

可以稍微使用自由剂轻轻地将它们压平。然后我要做的是用 3 mil 的抗生素抗真菌药冲洗。让我们捏一下脚趾，确保在我开始缝合之前她完全出来。

这看起来不错。我将使用 Henry Shine。第六，手术缝合。

我更喜欢做块状缝合。我认为他们表现得更好。我们首先将针头穿过那里，拉过，绕圈三圈，抓住末端，拉过。

1、2、3，切掉多余的部分。所以你只想继续沿着线均匀地走，拉紧。你想越过切口停止的地方并再次系紧。

我现在正在接近那个目标。将组织向后拉或将皮肤向后拉一点。那里有一点流血。

应该没问题。我们确实会随身携带烧灼剂，以防我们流血，这种情况偶尔会发生。它的烧灼剂可以很好地阻止这种情况。

所以，好吧，我已经超越了切口。我就到此为止。拉过，绕一个圈，旋转三圈，抓住圈子并把它拉下来。

旋转 3 次，抓住环，将其拉过，然后关闭多余的部分。将针头插入尖锐的针头。然后我们将使用订书机。

我们将在这只动物身上使用 7 码的订书钉。我们用 7 个来表示老鼠。大鼠 9 个。

只需抓住皮肤，将其向上拉一点，然后开始剪辑。再次抓取剪辑。我们希望一直均匀分布到切口之外一点点，这很好。

随后对整个区域进行酒精擦拭。然后我们要给她注射丁丙诺啡，以确保她不会感到任何疼痛。在接下来的几天里，我们将继续监测她，以确保她保持健康，没有任何形式的疼痛。

好的，既然我们已经给她注射了丁丙诺啡，我们要把她放回原来的笼子里，让她醒来时感觉舒服，把它放进保温箱里，让她在里面呆 20 分钟左右，直到她完全清醒并擦干。我们向您展示了如何在子宫内进行体内检测、血浆电穿孔、DNA。我们可以注射任何分子。

可能是格子 D，也可能是毒品。生长因子死亡。如果您需要将这些分子输送到细胞中，并且它们不通过被动扩散，您将需要电穿孔，为此，必须对分子进行充电。

但基本上可能性是无限的。将基因递送到细胞中的替代载体的一个例子。我们的病毒。

过去，我们使用逆转录病毒用 DNA 标记 gl，并展示它们如何分裂并成为神经元，在用病毒或使用电穿孔标记细胞后，或者注射药物或任何其他分子来影响大脑的发育，最终迁移到皮层。您可以通过多种技术来研究这一点。其中之一是做 TimeLapse，您将在其中进行器官型切片培养。

然后您将使用显微镜跟踪细胞的命运。正如你在这里看到的，时间 0.0。我们从非常靠近侧脑室的一组细胞开始。

随着时间的推移，我们可以看到细胞开始从心室区迁移到皮质板。此外，我们固定胚胎并进行免疫组化，以研究不同分子的不同分布，或确定这些不同细胞的命运。另一种可能性是做电生理学。

我们识别标记细胞，然后研究它们的电学特性。好的，感谢你今天和我们在一起。我们希望您喜欢我们的演示，并希望您能成功地进行实验。

如果您有任何问题，请随时与我们联系。你知道的，祝你好运。