E15小鼠胚胎的子宫内脑室内注射与电穿孔技术

大家好，我是来自Krete实验室的William Tis。今天，我和同事们将向大家展示如何对E15小鼠胚胎进行子宫内注射。大家好，我叫Laura Elias。

今天我将向您展示如何制备显微注射移液管，并为即将进行的脑室内注射和电穿孔操作装载移液管。我叫David Castaneda，今天我将协助完成小鼠胚胎的活体子宫内注射。我们将把质粒DNA注射到发育中小鼠胚胎的侧脑室中。

我们以这些胚胎的CE皮层为靶区，以便获得胶质细胞表达的不同分子，并在后续发育过程中转变为神经元。进行子宫内注射时，需要使用几项重要工具，现在我将向您展示。我们使用的是持针器和几把显微镊子。

一种，一对带锯齿的，另一对末端带有一个小齿。我们使用一把止血钳。这是一把剪刀。

然后使用这两把吻合器。这是用于大鼠的较大型号，这是用于小鼠的较小型号。

使用7号订书钉，而这个使用9号订书钉，它们均为弹簧加载。我们在此处用于辅助手术的一些器械，仅包括一个带有双头的简易光纤光源。我们还使用加热垫，通过循环温水来维持温度。

工作台面，我们使用 BTX 公司生产的电穿孔系统。根据胚胎的大小，我们采用几种不同尺寸的电极板。蓝色一侧为正极。

对于小鼠，我们使用异氟烷蒸气麻醉机。我们发现，这能提高母鼠和胚胎的存活率。同时，它还能够让我们以非常快速且可控的方式使动物进入和脱离意识状态。

因此，我们发现这一步非常有用。好了，现在我们要对注射移液管进行切削打磨。这一步非常关键，因为移液管的开口必须足够大，以便能够装载DNA，同时尖端又必须非常锋利，以避免在注射时损伤胚胎。

如果在注射过程中损伤了胚胎，胚胎的死亡率会显著升高，因此这种情况是不利的。所以，这实际上是该手术中一个非常重要的环节。

首先，我们将一些水滴加到正在旋转的研磨石上。然后，我们取一根玻璃棒，用胶带将刚刚拉制好的移液管固定在玻璃棒上。

我们将使用其中一个显微操作器来固定移液管的斜面，并使其在此处形成斜面。然后将其放置到位，并使用显微镜观察移液管的尖端。我们将它直接放入斜面上方的水中，使其受到轻微的压力。

你可以看到尖端正抵住这里的结石。让其研磨一段时间，至少15分钟。我喜欢让其研磨更长时间，比如一小时。

有时情况就是这样，它们会变得非常、非常尖锐，但具体磨边时间的长短确实因人而异。好的，现在我们来看，如上图所示，顶部这支移液管已经拉制完成但尚未进行磨边处理。因此，尽管它很尖锐，但还没有形成可用于加载DNA的开口。

现在移液管的底部已被削成斜面，你可以看到这个漂亮的倾斜开口，它能够让你加载DNA，同时仍保留尖锐的尖端，以便在注射时不会造成任何损伤。好的，接下来我们将用DNA填充注射用移液管。需要注意的是，你必须以无内毒素的方式制备DNA，以确保在注射DNA时不会同时注入脂多糖。

因此，我们将取用我们的 DNA，并在此准备好封口膜。您需要在此处制作封口膜，收集您的 DNA，并将其以微小液滴的形式点样在封口膜上。然后，我们将取用 DNA；通常情况下，每 10 µL DNA 样品中，我会使用约 1.5 至 1.7 µg/µL 的浓度。

我将使用约一微升的这种快绿染料。这有助于我们定位注射位置，并确保成功将样品注入脑室。接下来，我将这种快绿染料与我的DNA混合。

然后取出注射电极，通过回拉活塞来填充移液管。如图所示，如果移液管的斜面打磨正确且开口足够大，DNI 应能较容易地吸入。有时需要来回移动活塞，以帮助其正确加载。

然后就可以像这样装填移液器。此时DNA已完全装入移液器中，准备进行注射。好的，接下来我将用酒精和碘液清洗动物，但首先当然要进行足部夹捏测试，以确认动物已完全处于麻醉状态，看起来情况良好。

因此，我可以继续开始操作。首先，与大鼠实验类似，我们进行三次系列处理，起始使用乙醇。好的，碘液。

为了尽量降低感染风险，请注意威廉在打开湿巾时，会使用未被手指触碰过的部分来清洁动物，以最大程度确保清洁区域的无菌。其次，他仅进行一次擦拭，以避免将细菌扩散到腹部表面。

好的，很好。现在我将稍作清理，然后戴上外科手套。好的。好的。好的。接下来，我将打开小鼠体腔，取出子宫角，首先用手指轻轻夹起一点皮肤。

我再进行一次足趾夹捏，以确认她已完全麻醉，这样就可以了。因此，我会捏住皮肤，使其形成一个小褶皱突起，便于剪切。同样，我们需要沿着动物体的正中线做切口，以避开任何血管。

我通常这样切开皮肤，然后将其分离，暴露出肌肉。一旦完成这一步，就能清楚地看到肌肉中的中线，非常清晰明确。

我会在这里取一些肌肉组织，剪开，这是一个大小合适的切口，我不希望切得比这更大。然后我用这个分离器将肌肉和皮肤轻轻抬起，将其拉向一侧，接着非常轻柔地用探针探入此处，尝试将分离器置于两个胚胎之间，以便能够轻柔地将它们拉出，而完全不造成任何损伤。

有时候这比其他情况更容易。好了，就这样轻轻地把它拉出来，一旦我把它拉出来，就可以轻轻推动将它们取出。

切勿挤压胚胎，而应轻柔引导，稍作推动即可。一旦将胚胎取出，务必始终保持其处于充分湿润状态，避免胚胎干燥。

让我们再用一次我的取骨器，探查一下周围。好了，就是这样。非常好。

因此，我总是要确保将它们全部取出，因为如果不检查卵巢，很容易会遗漏其中一个。所以，我会再次非常轻柔地将它们拉出，同时仔细观察末端是否存在卵巢，就在这里。在这个动物体内，卵巢看起来 just 像一小团红色的组织。

然后将它们翻转过来，返回并检查另一面，我可以看到它们在那里。因此，请务必保持胚胎湿润，这样我们就准备就绪了。需要指出的一点是，操作时不要用力抓取，应非常轻柔地仅抓取胚胎本身。

不要抓取有血管的部位，因为这些区域很容易受损，导致动物发生出血，其存活率将显著下降。因此，我们首先要确定的是，在需要注射DNA的胚胎中，头部的位置在哪里。我们通过轻轻旋转动物并观察其每个腹侧部分来实现这一点。

在这个特定示例中，我的右侧是胚胎的头部，左侧靠近尾部。中线位于此位置，William 将会把胚胎调整到合适的位置，以便我进行注射，就像在大鼠中操作一样。我总是将胚胎头部朝向母鼠右侧，并朝向我自己放置。

现在我开始操作。好的，你可以看到左侧的颅底部分，稍微移动一下，就能清楚地看到中线位置。我再稍微调整旋转一下，以便大卫能处于合适的位置。

好的，现在我将开始注射左心室。我们可以看到，左心室已完全充满DNA。我们还可以观察到，部分染料已扩散至右心室以及此处的第三和第四脑室。

这是注射效果良好的一个良好指标。接下来，我们将进行电穿孔，将DNA导入细胞中。此处需要特别注意的是，必须明确哪一侧电极为正极。

我们知道，此处带有蓝色手柄的是正极，该侧应放置于我们希望将DNA电穿孔导入的一侧。由于我们已将大部分DNA注射到左侧心室，因此我会将正极置于左侧，然后施加五个脉冲，即完成操作。重要的是，电极必须完全浸润在PBS中，以确保电极与子宫之间接触良好，从而保证电脉冲的有效传递。

好的，现在探索已经完成，我将把角轻轻放回原位。具体操作方法是：先将角非常轻柔地移向一侧，然后伸手进去抓住肌肉和皮肤，再一点一点轻柔地将其推回原位。好了，很好。

注意膀胱。我可以处理另一侧。然后，我们只需轻轻摇晃她一下，使它们在体内安放妥当。

可以稍微使用游离器轻轻将其压平。然后，我将用3毫升的抗生素-抗真菌剂进行冲洗。在开始缝合之前，让我们进行足趾夹捏测试，以确保她已完全处于麻醉状态。

这看起来不错。我将使用亨利·夏恩（Henry Shine）的六号外科缝线。

我更喜欢缝合打结。我认为这样更牢固。我们先将针穿过去，拉出来，绕三圈，抓住末端，再拉出来即可。

1、2、3，剪掉多余的线头。接下来，沿着切口均匀地继续缝合，并拉紧。一直缝到切口结束位置之外，再打结固定一次。

我现在正在处理这个部位。将组织或皮肤稍微向后拉开，这里有一点出血。

应该没问题。我们手边常备着电灼器，以防出现偶尔发生的出血情况。而且电灼器在止血方面效果很好。

好了，我已经超过了切口位置，就在这里停止。将线拉出，打一个环，旋转三圈，抓住线环并将其拉紧。

旋转三圈，抓住线圈，将其穿过，并剪掉多余部分。将针头放入锐器盒中，然后我们将使用缝合器。

我们将对这只动物使用7号订书钉。小鼠使用7号，大鼠使用9号。

只需捏住皮肤，轻轻提起，然后开始剪开。再次夹住组织。我们需要沿着切口向下均匀地进行，稍微超出切口即可，这样就可以了。

随后用酒精擦拭整个区域。然后我们将给她注射布托啡诺，以确保她不会感到任何疼痛。在接下来的几天里，我们将持续监测她的情况，以确保她保持健康且无任何疼痛症状。

好了，现在我们已经给小鼠注射了布托啡诺，接下来要将它放回原来的笼子中，以便它在苏醒时感到舒适。然后把笼子放入培养箱，让小鼠在里面停留大约20分钟，直到它完全清醒并且身体干燥。我们将向您展示如何进行活体子宫内质粒DNA的电穿孔操作。我们可以注射任何分子。

可能是方格图案 D，也可能是药物。生长因子会死亡。如果你需要将这些分子递送进细胞，而它们无法通过被动扩散穿过细胞膜，你就需要使用电穿孔法，而为此，这些分子必须带有电荷。

但基本上，可能性是无限的。一种将基因导入细胞的替代载体是病毒。

过去，我们曾使用逆转录病毒通过 DNA 标记胶质细胞（gls），以观察它们如何分裂并转变为神经元，最终迁移至大脑皮层。在利用病毒标记细胞，或采用电穿孔技术，或注射药物及其他分子来影响大脑发育之后，可通过多种技术手段对此过程进行研究。其中一种方法是进行活细胞时间推移成像（TimeLapse），该方法需要建立器官型脑片培养体系。

然后，您将使用显微镜追踪细胞的命运。正如您在此处所见，时间为 0.0。我们从一群非常靠近侧脑室的细胞开始。

随着时间的推移，我们可以观察到细胞开始从脑室区迁移出来，向皮层板移动。此外，我们还会固定胚胎，进行免疫组织化学实验，以研究不同分子的分布情况，或确定这些不同细胞的命运。另一种可行的方法是进行电生理学实验。

我们识别标记的细胞，然后研究它们的电学特性。好了，感谢您今天的参与。希望您喜欢我们的演示，并在实验中取得成功。

如果您有任何疑问，请随时与我们联系。祝您好运。