小鼠视网膜神经节细胞的转染在体内电穿孔

以下实验的总体目标是在出生后小鼠中使用体内电穿孔转染单个或一小群视网膜神经节细胞，以研究视网膜神经节投影的发育。这是通过手术暴露眼球并将少量血浆 DNA 溶液直接注射到视网膜中来实现的。作为第二步，将电极直接放置在注射部位上方的眼球上，并施加电脉冲，这允许将血浆 DNA 转移到视网膜神经元中。

接下来，在所需的年龄，收获电穿孔的视网膜和大脑以可视化转染的视网膜神经节细胞，并获得它们对 CNS 结果的投影，显示标记的视网膜神经节细胞在其各种皮层下靶结构中的树突和轴突 ARB 的荧光标记。与现有方法（如子宫内视网膜电穿孔）相比，该技术的主要优点是该技术侵入性较小，并且不会干扰早期轴突导向事件，例如在视交叉处交叉。它还允许我们通过精确的空间和时间控制来标记出生后小鼠中的小群体或单个视网膜神经节细胞。

要制作用于电穿孔的电极，请从一对 dumont 5 号镊子上折断一个插脚，然后在每个插脚的底部焊接一根电线。用绝缘层、胶带将底座包裹起来，并在插脚之间安装塑料垫片以提供弹簧作用。将电极放在一起后，将电线从一个插脚连接到脚踏板，脚踏板串联连接到电刺激器。

当踩下脚踏板时，电流流过电极。接下来，将电线从另一个插脚连接到电刺激器。最后，将电刺激器连接到示波器和音频监视器。

使用移液器拉拔器将进样器系统安装到工作台上的三轴微型纵器上。使用 nano Inject two 随附的针头制作具有长锥度和小尖端的拉动玻璃移液器。用矿物油回填拉出的移液器，并将其固定在微量注射器上。

使用锋利的显微解剖剪刀。切开已安装的移液器的尖端，形成一个 2 到 3 微米的开口。通过打开的尖端向上抽取注射液，将注射液填充到移液器中。

通过低温麻醉出生后 H 4 至 5 天的小鼠弹出。并使用脚趾捏合确认麻醉状态。将麻醉的小鼠放在解剖镜下，沿着未来眼睑的长度切割，通过手术打开眼睑 用显微解剖剪刀打开，用一对镊子轻轻地在眼窝周围施加压力，突出眼球。

通过调整微型纵器，将移液器放置在眼球附近。踩下显微注射系统的脚踏板，确保移液器吸头不会被一只手堵塞。用另一只镊子捏住眼窝周围的皮肤，稳定突出的眼球。

移动微型纵器，使移液器刺穿视网膜色素、上皮并进入视网膜。踩下脚踏板，缩回移液器，将电极尖端直接放在注射部位上，分配所需量的溶液。在眼球刚接触表面的两侧，踩下连接到刺激器的脚踏板以完成电路并对眼球进行电泳。

轻轻地将眼球推回眼窝，并在伤口上涂抹眼药膏。将小鼠放在保持在 36 摄氏度的加热垫上，直到它们恢复意识并将它们放回仅转染 RG CS 的母亲。使用质粒和编码 Cree 重组酶和羊群终止剂，EGFP 能够表达。

EGFP 单细胞标记是通过使用相对低浓度的 Cree 质粒实现的，EGFP 标记的单视网膜神经节，细胞树突和轴突可以在平面视网膜中可视化。其他视网膜细胞类型，如星爆 omicron 细胞，也可以用这种技术标记。在这里，我们看到了出生后第 14 天平面视网膜中的一组 EGFP 标记的视网膜神经元簇的示例，包括 RG CS 和 omicron 细胞。

使用这种技术，一旦掌握，我们可以从同一只鼠标的所有四个主要视网膜坐标中分析整个安装上结肠中 RG CS 的视网膜主题靶向。如果执行得当，这种技术可以在四到五分钟内完成。看完这个视频，你应该对如何将血浆 DNA 等溶液进行局部注射到出生后视网膜中，以及使用电穿孔对视网膜神经元进行体内转染有一个很好的了解。