Name: 耐甲氧西林实验性心内膜炎模型金黄色葡萄球菌（MRSA）的大鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习建立大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌实验性心内膜炎模型。该方法通过颈动脉插管和尾静脉注射实现感染，可用于研究感染机制和评估抗菌治疗效果。

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本工作由美国国立卫生研究院 [资助号 R01AI-39108，授予 A.S.B.] 和美国心脏协会 [资助号 SDG 0630219N 和 AID 09GRNT2180065，授予 Y.Q.X.] 提供支持。

1. 准备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株用于感染
<ol>
	<li>从-80 °C保存的菌种管中取一环耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌液，接种至绵羊血胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板（见特定试剂与设备列表），于37 °C培养过夜。</li>
	<li>检查血琼脂平板上菌落的纯度（菌落表型一致），确保无污染。</li>
	<li>从绵羊血TSA平板上挑取单个菌落，接种至含有5 ml胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）的15 ml带盖离心管中。</li>
	<li>于37 °C、200 rpm振荡条件下培养过夜。</li>
</ol>
2. 准备手术导管
将聚乙烯导管（PE10；Becton Dickinson，货号 427401）剪成 10 cm 长的节段，用无菌镊子按压一端使其熔封。封闭导管一端的目的是防止插管过程中发生出血。
3. 术前准备与麻醉
<ol>
	<li>将Sprague-Dawley大鼠（Harlan, Indianapolis, Ind.，雌性，250-300克）放入含有异氟烷-氧气混合气体（50%:50%）的麻醉 chamber 中，直至麻醉生效（例如肌肉松弛且足底反射消失），并在手术期间持续使用该混合气体维持动物的麻醉状态。</li>
	<li>用聚维酮碘（Betadine）和70%乙醇清洁从下巴至胸骨下方的颈部区域。</li>
</ol>
4. 手术操作
<ol>
	<li>手术全程须采用无菌操作技术。在胸骨上方的颈部皮肤层做一垂直切口（1-1.5 cm）。</li>
	<li>使用钝性分离法，用两把弯齿镊分离筋膜，暴露右侧颈总动脉。</li>
	<li>轻柔地将动脉从颈部组织中提起，在动脉下方穿入两根10 cm长的丝线缝合线，结扎暴露的近心端动脉，并在动脉上夹闭夹以防止出血。</li>
	<li>使用导管导入器（Becton Dickinson，货号 406999）在动脉顶部穿一小孔，用镊子将导管经此孔插入动脉，移除止血夹，将导管向心脏方向推进直至遇到阻力。</li>
	<li>当导管位置确认到位后（依据：i）插入导管的长度为4-5 cm；ii）继续推进时遇到阻力；iii）导管随心跳出现搏动），用丝线结扎动脉远心端，并用丝线固定导管位置。实验剩余时间内保持导管留置。</li>
	<li>剪除多余的缝线和导管末端，确保导管处无出血。将残留末端埋入颈部皮下，使用皮肤夹关闭切口。</li>
	<li>将大鼠置于温暖环境中的笼内，直至其从麻醉中恢复，并提供食物和饮水。在麻醉恢复期间及之后应频繁检查大鼠状态。</li>
	<li>该手术属于“E类”操作。由于伴随耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染，动物会产生痛苦，且镇痛药物无法缓解此类操作引起的疼痛。</li>
</ol>
5. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染
<ol>
	<li>感染可在术后1至7天内进行，但实验内应保持一致。</li>
	<li>用70%乙醇清洁大鼠尾部，使用27 G 1/2英寸针头通过尾静脉静脉注射0.5 ml MRSA，菌液浓度根据所需设定（大多数S. aureus菌株为每只动物104 - 106 cfu）。注意：MRSA培养物属于生物安全二级（BSL2），对人员和环境具有中等潜在危害。</li>
	<li>在将大鼠放回笼子前，需在注射部位施压直至止血。</li>
</ol>
6. 处死大鼠并培养靶组织
<ol>
	<li>感染后1至6天，通过腹腔注射戊巴比妥钠（200 mg/kg）处死大鼠。</li>
	<li>将大鼠仰卧放置，用70%乙醇擦拭胸部。</li>
	<li>在胸骨下方胸部做V形切口，剪开胸骨两侧肋骨的软骨以暴露心脏。</li>
	<li>轻轻提起心脏，靠近主动脉处剪断心肌组织，并向上解剖以游离心脏。</li>
	<li>将心脏置于内含4×4英寸纱布的无菌培养皿中，切开左心室内心壁，打开左侧心腔。</li>
	<li>肉眼检查导管位置，用剪刀和镊子检查并清除瓣膜上的赘生物。</li>
	<li>称重并匀浆赘生物，用PBS进行系列稀释，用于定量培养。</li>
</ol>
7. 代表性结果
将导管插入动脉并朝心脏方向推进约4-5 cm后，会遇到阻力。若未感觉到阻力，则导管可能未成功插入心室左侧，这可能影响导管的定位。此前已发表的正确导管放置位置见图19。
部分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染样本需要进行定量培养，以确定感染样本中确切的活菌数量及样本纯度。此外，从赘生物中回收的微生物应与接种物中使用的菌株一致。
表1展示了一株S. aureus在大鼠心内膜炎模型中的毒力示例，该数据此前已发表9。所有接种剂量为105和106 cfu的动物在感染后3至6天被处死，均发展为心内膜炎，并在心脏赘生物以及肾脏和脾脏中检测到高密度的S. aureus（表1）。瓣膜培养无菌的大鼠被视为未感染。
<img alt="显示生物学研究中内部结构的解剖组织，带标签的示意图用于科研分析。" src="/files/ftp_upload/3863/3863fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 导管位于正确位置（心腔左侧），主动脉瓣周围可见大量赘生物9。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>接种量（动物数量）</td>
			<td colspan="3">组织中平均 log10 CFU/g ± 标准差a：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>赘生物</td>
			<td>肾脏</td>
			<td>脾脏</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>106 CFU/动物 (9)</td>
			<td>10.36 ± 0.85</td>
			<td>7.30 ± 0.64</td>
			<td>6.70 ± 0.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>105 CFU/动物 (8)</td>
			<td>9.93 ± 0.53</td>
			<td>7.14 ± 0.53</td>
			<td>6.44 ± 0.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>104 CFU/动物 (7)</td>
			<td>3.46 ± 0.50*</td>
			<td>1.81 ± 0.74*</td>
			<td>1.58 ± 0.59*</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
a SD，标准差。P &lt; 0.001，相对于接种 105 或 106 CFU 的动物。 
表1. 在大鼠心内膜炎模型中，不同接种量下心脏赘生物中S. aureus的密度9。

<ol><li>Petti, C. A., Fowler, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+bacteremia+and+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis.</a> Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).</li>
<li>Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Probl.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Update on infective endocarditis.</a> Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).</li>
<li>Fowler, V. G. Jr, Justice, A., Moore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+hematogenous+complications+of+intravascular+catheter-associated+Staphylococcus+aureus+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia.</a> Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals%3A+analysis+of+24%2C179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).</li>
<li>Hoen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+issues+in+the+management+of+infective+endocarditis+caused+by+gram-positive+cocci%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci.</a> Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).</li>
<li>Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+outcomes+when+utilizing+high-dose+%28%3E+or+%3D8+mg%2Fkg%29+daptomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (> or =8 mg/kg) daptomycin therapy.</a> Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).</li>
<li>Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcomes+of+patients+receiving+daptomycin+for+the+treatment+of+Staphylococcus+aureus+infections+and+assessment+of+clinical+factors+for+daptomycin+failure%3A+a+retrospective+cohort+study+utilizing+the+Cubicin+Outcomes+Registry+and+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Ther%22%5BJournal%5D)">Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience.</a> Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).</li>
<li>Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+evaluating+the+efficacy+of+antibiotics+in+a+rat+Staphylococcus+aureus+endocarditis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).</li>
<li>Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gC1qR%2Fp33+blockade+reduces+Staphylococcus+aureus+colonization+of+target+tissues+in+an+animal+model+of+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis.</a> Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).</li>
<li>Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+model+of+the+Staphylococcus+aureus+ClfA-fibrinogen+interaction+opens+new+avenues+for+the+design+of+anti-staphylococcal+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics.</a> PLoS Pathog. 4, e1000226(2008).</li>
<li>Boles, B. R., Horswill, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+biofilm+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal biofilm disassembly.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li>
<li>Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+Infection+of+Methicillin+Resistant+Staphylococcus+Aureus+%28MRSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA).</a> J. Vis. Exp. (48), e2528(2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

大鼠心内膜炎是一种重要的、特征明确的动物模型，广泛用于研究细菌感染的发病机制以及抗菌药物的体内治疗效果9-11。此外，大鼠心内膜炎模型兼具急性与亚急性感染的特点，能高度模拟人类相应疾病及人类自体瓣膜心内膜炎。同时，当伴有留置导管时，该模型可代表典型的与生物膜相关的感染，这在临床实践中是一种常见且棘手的问题12。最重要的是，利用大鼠心内膜炎模型所获得的研究结果具有高度可重复性。
与其他动物模型一样，S. aureus 在大鼠心内膜炎模型中的致病性可能因多种参数而异，包括接种剂量、细菌生长阶段（对数期 versus 稳定期）、动物年龄以及动物遗传背景9, 13。手术成功率在很大程度上取决于研究人员的技术专长和外科操作技能。手术成功可通过以下指标进行评估：1）术后恢复的动物数量；2）处死时导管位于正确位置；3）心脏瓣膜上存在赘生物。
总之，大鼠心内膜炎模型具有可行性、可重复性，且能高度模拟临床情况，因此适用于脓毒症研究的各个领域，包...

<table><tbody><tr><td>血琼脂平板，含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>A10BX</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）</td><td>BD Biosciences</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Labnet International</td><td>I5311-DS</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>导管导入器</td><td>BD Biosciences</td><td>6999</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Western Medical Suppy, Inc</td><td>2147</td><td>遵循安全与操作说明</td></tr><tr><td>外科手术器械</td><td>Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc.</td><td></td><td>根据需求从这两家公司选择合适的器械</td></tr></tbody></table>

大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）实验性心内膜炎模型

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

血管内感染，包括心内膜炎，是危及生命的感染综合征1-3。金黄色葡萄球菌是全球此类综合征最常见的病因，即使采用适当的抗菌药物治疗，其发病率和死亡率仍高得难以接受4-6。由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的增加、万古霉素临床治疗失败率高以及利奈唑胺和达托霉素耐药问题日益严重，进一步加剧了此类感染患者的治疗难度，并导致医疗成本高昂7, 8。此外，应强调的是，最近有关抗生素治疗效果的研究大多基于临床环境，因此可能受到患者间个体差异等宿主因素的影响。因此，建立一种宿主因素在动物间相对一致的血管内感染相关动物模型，对于研究微生物致病机制以及新型抗菌药物的疗效尤为重要。大鼠心内膜炎是一种成熟的实验动物模型，能很好地模拟人类自体瓣膜心内膜炎，已被用于研究特定葡萄球菌毒力因子的作用以及抗葡萄球菌心内膜炎治疗方案的疗效。本报告中，我们描述了一种由MRSA引起的大鼠实验性心内膜炎模型，可用于研究细菌致病机制及对抗菌治疗的反应。

由耐甲氧西林S. aureus引起的实验性大鼠心内膜炎模型。

大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）实验性心内膜炎模型

血管内感染，包括心内膜炎，是危及生命的感染综合征1-3。金黄色葡萄球菌是全球最常见的病因……

本实验的总体目标是在大鼠中建立感染性心内膜炎的实验模型。首先通过培养金黄色葡萄球菌并制备用于感染的手术导管来实现该目标。接下来，准备手术区域并对动物进行麻醉。动物麻醉后，将导管经由右侧颈动脉插入并朝向心脏方向推进。最后一步是通过尾静脉注射使动物感染金黄色葡萄球菌（aureus）。最终，分离目标组织并进行定量培养的制备。与现有方法（如快速心内膜炎模型）相比，该技术的主要优势在于红心内膜炎模型可与体内成像系统（IVUS）联合使用。该方法有助于解答口腔致病机制领域的一些关键问题，例如病原体毒力及抗菌药物的疗效。通常，初次接触该技术的研究人员会面临一定困难，因为手术操作具有较高挑战性。首先，用接种环从冻存的 M SSA 菌种中取一环，接种至羊血三糖琼脂平板上。将培养物于 37 摄氏度培养过夜，确保无污染后，挑取平板上的单个菌落，接种至 15 毫升带螺帽的试管中含 5 毫升胰蛋白胨大豆肉汤的培养基中。将接种物在37摄氏度的摇床培养箱中孵育过夜。设置转速为200 RPM，以首先准备导管。将聚乙烯管剪成10厘米长的段，并在赛克斯消毒液中对导管进行消毒30分钟。接下来，用加热的无菌镊子按压无菌导管的一端使其熔化，制成导管，该导管将从右颈总动脉插入至左心室，并在心脏搏动时对心内膜造成损伤。然后将大鼠放入含有1:1异氟烷-氧气混合气体的麻醉室中进行麻醉，直至麻醉生效。通过检查肌肉是否松弛以及足底反射是否消失来确认麻醉效果。通过连接气体混合物的鼻罩在手术期间维持麻醉状态。在整个手术过程中，使用无菌技术，以聚维酮碘和70%乙醇清洁手术区域。将大鼠置于仰卧位，使用钝性分离法在胸骨上方颈部皮肤层垂直做切口。分离筋膜以暴露右侧颈总动脉。右侧颈总动脉位于锁骨上方中线略偏右侧的位置。小心将动脉从颈部腔隙中提起，并在动脉下方放置两根10厘米长的丝线缝合线，用于结扎暴露的头端。然后在动脉上放置一个夹子以防止出血。使用镊子和导管引入器在动脉顶端打一个小孔。将导管未封闭的一端通过动脉上的小孔插入。移除夹子，将导管向心脏方向推进。当遇到阻力时即为到位，此时导管应进入动脉4至5厘米，并随大鼠心跳而搏动。导管就位后，在动脉套管端周围打一松结缝线，固定导管位置。用丝线缝合，剪去多余的缝线和导管末端，然后将末端埋入颈部皮下。使用皮肤夹闭合皮肤。将大鼠置于清洁的笼子中，并放置在温暖处，直至从麻醉中恢复。在恢复期间及之后，需定期为大鼠提供食物和水，并频繁检查。感染可在术后1至7天内进行，但在同一实验中应保持时间一致。用70%乙醇清洁大鼠尾部，并在目标细胞处注射0.5毫升MRSA培养物。向尾静脉注射。使用27号半英寸针头，在将大鼠放回笼子前，对注射部位施加压力，直至出血停止。处死大鼠后，用70%乙醇擦拭胸部，然后在胸骨下方做V形切口。在胸骨两侧切断肋软骨。为暴露心脏，轻轻向上提起心脏，并在靠近主动脉处剪断周围组织，

experimental-endocarditis-model-methicillin-resistant-staphylococcus

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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急性心肌梗死（AMI）的大鼠模型可用于研究心肌梗死对心脏病理生理学和生理功能的影响。...

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小鼠皮肤和软组织感染模型用于评估耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的毒力功能及宿主免疫应答。本文介绍了一种用于皮肤和软组织感染的皮下感染模型。...

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的皮下感染

可视化 肺炎链球菌 心脏微损伤及其后续心脏重塑

本文介绍了一种在免疫功能健全的啮齿类动物中建立肺部感染的方法。熟练掌握后，该方法可快速、简便地用于诱导由多种S. pneumoniae、H. influenzae、P. aeruginosa、K. pneumoniae和A.

一种用于评估抗菌疗效的免疫健全啮齿类动物肺炎稳健模型S. pneumoniae,H. influenzae,K. pneumoniae,P. aeruginosa或A. baumannii

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Staphylococcus aureus（S. aureus）具有在体内扩散的能力，可导致持续性和反复性感染。为了更好地理解这些过程，本研究建立了一种S.

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