Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entnahme von Proben aus Kryo-Boxen und Kryo-Röhrchen aus mit flüssigem Stickstoff gefüllten Duo-Tanks mithilfe einer einfach herzustellenden Vorrichtung zu erleichtern. Dies wird erreicht, indem zunächst ein oder zwei Gefriergutträger aus dem Tank entfernt werden, um Platz für die Handhabung zu schaffen und die Vorrichtung vertikal in den Tank einzuführen. Der zweite Schritt besteht darin, vorsichtig mit der Vorrichtung entlang des Tankbodens zu schaben.

Ziehen Sie anschließend das Gerät entlang der Wände des Behälters nach oben, um die Gefriertablette aus dem Tank zu heben. Der letzte Schritt besteht darin, die aus dem Boden des Behälters entnommene Box zu greifen und die entfernten Gefrierregale wieder einzusetzen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie dem Abgießen, bei dem der Behälter vollständig mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, liegt darin, dass sie eine einfache, sichere und schnelle Alternative bietet, die die Probenechtheit erhält und von einer einzelnen Person durchgeführt werden kann. Um mit dem Zusammenbau des kryotoleranten Geräts zu beginnen, verwenden Sie eine Zange, um eine Seite eines dreiseitigen Befestigungsbandes geradezubiegen, um so ein LHA-Befestigungsband herzustellen.

Wie hier zu sehen ist, können die Abmessungen der stabilen Klammer je nach Durchmesser des Halses des Geräts gewählt werden. Es sollten zwei solcher stabiler Klammern angefertigt werden, um dem Gerät das Herausholen von Cryoboxen mit den Maßen fünf einhalb mal fünf einhalb Zoll zu ermöglichen. Befestigen Sie diese mit einem TST-Bandsystem für stabile Klammern unter Verwendung einer Kronenmutter, einer Unterlegscheibe und einer Schraube, um die Basis der Cryoschaufel zu bilden.

Das Gerät sollte nun wie hier gezeigt angezeigt werden. Richten Sie nun mithilfe einer geschlitzten Platte die Schlitze des Strong-Tie-T-Trägers mit den Schlitzen an einem Ende der geschlitzten Platte aus. Befestigen Sie beide anschließend mit Hillman-Sechskantmuttern und -schrauben.

Bohren Sie Löcher für die Befestigung, falls die Lochplatte und die Winkelbinder keine vorgebohrten Löcher aufweisen. Falls gewünscht, kann ein Griff gebildet werden, indem das andere Ende der Lochplatte gebogen und mit Schaumstoff umwickelt wird. Um das Gerät besser greifen zu können, entfernen Sie den Schaumstoff vor dem Eintauchen ins Wasser.

Die kältetolerante, selbstgebaute Abholvorrichtung kann auch zur Entnahme von Kryoröhrchen angepasst werden. Dazu wird der flache Boden durch ein verändertes Edelstahlsieb ersetzt, das zum Herausholen der Röhrchen aus der Flüssigkeit geeignet ist. Zum Beginn der Montage zunächst die Kronmuttern und -schrauben lösen und den robusten Reifenschlauch an der geschlitzten Platte befestigen.

Dann, bevor der Edelstahlsieb an die geschlitzte Platte befestigt wird, vorsichtig den Hals des Siebs mit Hilfe einer Zange verbogen, um die Basis in einem Winkel auszurichten, sodass sie einer Kelle ähnelt. Falls der verwendete Sieb über eine Kante verfügt, die Kante mit der Zange nach unten biegen. Dies erleichtert die Handhabung des Geräts.

Richten Sie die Bohrung am Griff des Siebs mit den Bohrungen auf der geschlitzten Platte aus und befestigen Sie das Sieb mit Hillman-Sechskantmuttern und -schrauben. Bohren Sie Löcher, falls das Sieb nicht bereits vorgebohrt ist. Um mit dem Herausnehmen von Kryo-Boxen aus einem Behälter zu beginnen, ziehen Sie zuerst kryogene Handschuhe an.

Entfernen Sie anschließend ein oder zwei Gefriergutregale aus dem Behälter, um ausreichend Platz für die Handhabung des Geräts zu schaffen. Verwenden Sie danach das aufrechte, kryotolerante, selbstgebaute Entnahmegerät, das mit der stabilen Bindemittelbasis ausgestattet ist, um vorsichtig entlang des Bodens des Behälters zu kratzen und die Box aufzusammeln, die auf den Boden des Behältertanks gefallen ist. Ziehen Sie anschließend das Gerät entlang der Wände des Behälters nach oben, um die Gefrierbox aus dem Tank zu heben.

Beachten Sie, dass das Gerät vertikal gehalten und gerade nach oben gezogen werden sollte, um zu verhindern, dass die Box wieder in den Doer hineinrutscht. Um Kryo-Fläschchen zu entnehmen, verwenden Sie die mit einem Sieb ausgestattete Kryo-Schaufel, um vorsichtig den Boden des Doers abzukratzen, ähnlich wie beim Herausholen von Kryo-Boxen. Ziehen Sie das Gerät dann aufrecht nach oben und nehmen Sie die im Sieb gesammelten Fläschchen heraus. Eine große Herausforderung bei Genexpressionsstudien besteht darin, dass die Qualität von RNA von den Lagerbedingungen sowohl für gefrorene Gewebeproben als auch für extrahierte RNA abhängt.

Diese Abbildung zeigt den Einfluss der Probenvorbereitung auf die Integrität der gesamten RNA. Gesamte RNA aus derselben Gewebeprobe wurde vor dem Experiment unterschiedlichen Probenvorbereitungsverfahren unterzogen. Intakte gesamte RNA zeigt klare 28S- und 18S-Ribosomen-RNA-Banden, wobei die 28S-Ribosomen-RNA-Bande etwa doppelt so intensiv ist wie die 18S-Ribosomen-RNA-Bande. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die RNA intakt ist. Die Gelen 3 und 4 zeigen Proben mit erheblicher Degradation infolge wiederholten teilweisen Auftauens durch kurzfristige Entnahmen aus dem Gefrierschrank, wodurch die Langzeitlagerung mit periodischem Entnehmen modelliert wird, das notwendig wird, wenn Vials aus den Boxen heruntergefallen sind.

Jedoch enthalten Proben, die im Doer-Service mit dem DIY-Gerät gelagert und somit keiner teilweisen Auftauung ausgesetzt wurden, in Lane zwei intakte RNA. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben aus dem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Dvar entnehmen kann, ohne diesen umfüllen zu müssen.