Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie qualitativ hochwertige Bilder mit Superauflösung von Stürmen aufgenommen werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst eine fluoreszenzmarkierte Testprobe vorbereitet wird. Der zweite Schritt besteht darin, den Schaltpuffer vorzubereiten und dann die Bildgebungskammer mit dem Puffer zu füllen.

Anschließend werden die Rohdaten mit einem Sturmmikroskop aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, hochauflösende Bilder aus Rohdaten mit Hilfe einer Regensturmverarbeitungssoftware zu rekonstruieren. Letztendlich werden die Testproben verwendet, um zu zeigen, wie qualitativ hochwertige Rohdaten erfasst werden können, die dann verarbeitet werden können, um Sturm-Superauflösungsbilder in Zellen mit Auflösungen zwischen 30 und 50 Nanometern zu erzeugen, was eine fünf- bis zehnfache Auflösungssteigerung gegenüber herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopietechniken wie Rasen und Konfokal darstellt.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, weil sie nicht erkennen, wie wichtig es ist, viele qualitativ hochwertige spärliche Links zu sammeln. Dies wird durch die Verwendung von Alexa 6 4 7 Farbstoff im richtigen Schaltpuffer erheblich erleichtert. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist unerlässlich, da die Erfassung hochwertiger Rohdaten für die Erstellung von Bildern mit SPR-Auflösung von entscheidender Bedeutung ist.

Die Rohvideosequenzen dieser Technik sehen völlig anders aus als jede andere Form der Fluoreszenzmikroskopie. Um das Verfahren zum Beschichten von Glas mit fluoreszierendem Dextrin bei 200 Mikrolitern 0,01%iger Polylysinlösung in jede Vertiefung eines Achtkammer-Deckglases zu beginnen und 10 Minuten zu inkubieren. Entfernen Sie nach 10 Minuten die Polylysinlösung mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit verdünnt bleibt.

0,25 Mikroliter einer zwei Milligramm pro Milliliter Stammlösung von Dextrin. Alexa 6 47 in 25 Mikroliter deionisiertes Wasser geben, um eine Lösung von 20 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen, um eine Beschichtung mit hoher Dichte aus Dextrin zu erzeugen. Alexa 6 47 Lösung.

Verdünnen Sie 20 Mikroliter der 20 Mikrogramm pro Milliliter Lösung in insgesamt 200 Mikroliter deionisiertes Wasser. Für eine Lösung mittlerer Dichte verdünnen Sie zwei Mikroliter in 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser. Für eine Lösung mit niedriger Dichte 0,2 Mikroliter verdünnen.

In 200 Mikroliter entionisiertes Wasser 200 Mikroliter der verdünnten Dextrin-Lösungen Alexis X 47 in jede Vertiefung geben und 10 Minuten inkubieren. Es können längere Inkubationszeiten verwendet werden, was zu einer dichteren Dextrinbeschichtung führen kann. Zum Schluss Dexter Xis X 47 Lösungen entfernen und dreimal mit Wasser waschen.

Um fluoreszierende Aktinfilamente auf Glas herzustellen, geben Sie zuerst 200 Mikroliter 0,01%ige Polylysinlösung in jede Vertiefung einer acht Kammern. Decken Sie das Glas ab und inkubieren Sie es 10 Minuten lang. Mit einer Pipette entfernen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit zurückbleibt.

In jede Kammer werden 90 Mikroliter allgemeiner Aktinpuffer gegeben, der zuvor gemäß den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert wurde. Fügen Sie dann 10 Mikroliter 10 Mikromolare vorgeformte Aktin-Filamentlösung und einen Mikroliter Foid und Alexa 6 47 hinzu und pipetieren Sie vorsichtig auf und ab, um zu mischen, inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um Mikrosphären-Fluoreszenzkügelchen als Referenzmarker vorzubereiten, um einen Mikroliter Tepec-Kügelchen in 200 Mikroliter PBS zu verdünnen und zu mischen. Geben Sie die verdünnten Kügelchen in die Bildgebungskammer und warten Sie 15 Minuten.

Nach 15 Minuten wird die Lösung entfernt und dreimal mit PBS gewaschen, bevor die Bildgebung a Zellen verwendet werden, die auf etwa 80 % Co-Flüssigkeit kultiviert wurden. Entfernen Sie das Nährmedium und waschen Sie es mit PBS. Fügen Sie dann 500 Mikroliter 4%ige Formaldehydlösung für 10 Minuten hinzu.

Entfernen Sie das Formaldehyd und waschen Sie es dreimal mit PBS. Lassen Sie die Zellen nicht trocken bleiben und verwenden Sie immer PBS-gepufferte Lösungen. Um hypotonen Stress zu vermeiden, fügen Sie zwei Mikroliter einer Stammlösung von 50 Mikrogramm pro Milliliter EGF Alexa, 6 47 bis 200 Mikroliter 0,1%ige BSA-Lösung hinzu und geben Sie diese Lösung dann zu den Hela-Zellen.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Fügen Sie eine Blockierungslösung von 0,1 % BSA hinzu und lassen Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.

Entfernen Sie danach die Blockierungslösung und waschen Sie sie vor der Bildgebung weitere drei Mal mit PBS. Bereiten Sie kurz vor der Bildgebung den Schaltpuffer vor, indem Sie das Enzym Glukose und die Reduktionsmittel-Stammlösungen miteinander mischen. In einem Verhältnis von 50 Mikrolitern, 400 Mikrolitern und 100 Mikrolitern fügen Sie PBS hinzu, um das endgültige Volumen auf einen Milliliter zu erhöhen. Nehmen Sie das PBS aus der Bildgebungskammer und füllen Sie es bis zum Rand mit dem Schaltpuffer.

Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über die Oberseite der Kammer und achten Sie darauf, dass überhaupt keine Blasen vorhanden sind und die gesamte Kammer abgedeckt ist. Wenn Blasen zu sehen sind, füllen Sie mit zusätzlichem Puffer oder PBS auf. Andernfalls kann die Pufferleistung sinken.

Die Erfassung von qualitativ hochwertigen, spärlichen Verknüpfungsdaten ist für den Erfolg dieses Verfahrens unerlässlich, stellen Sie also sicher, dass die Mikroskope richtig fokussiert sind und die richtigen Aufnahmeeinstellungen verwendet werden. Lokalisieren Sie eine fluoreszierende Struktur, die abgebildet werden soll. Wählen Sie den gewünschten Beleuchtungswinkel.

In diesem Fall wird ein Rasen- oder stark geneigter Winkel empfohlen, da dies das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, indem das unscharfe Licht minimiert wird, was insbesondere für Zellproben von Vorteil ist. Nehmen Sie einen Verweis auf ein fraktionsbegrenztes Bild der Struktur vor der Sturmbildgebung. Erhöhen Sie den Anregungslaser auf eine hohe Leistung, die etwa zwei Kilowatt pro Quadratzentimeter entspricht, während die Bildgebung mit Kameraeinstellungen von 10 Millisekunden Belichtung und einer Zykluszeit von etwa 50 Hertz oder Bildern pro Sekunde erfolgt.

Sobald die Flora Fours in ein spärliches Blinkmuster übergegangen sind, sammelst du 10.000 Frames. Um mit dieser Rekonstruktion zu beginnen. Öffnen Sie die Datei RAINSTORM M in MATLAB und führen Sie sie im Rainstorm-Fenster aus.

Wählen Sie die Bilddatei, die analysiert werden soll, über die Schaltfläche "Durchsuchen" aus. Dabei sollte es sich um eine TIF-Datei handeln. Ändern Sie die Pixelbreite so, dass sie den Rohdaten des Mikroskopsystems entspricht, mit dem die Daten erfasst wurden.

Behalten Sie die Standardwerte für die anderen Werte bei. Drücken Sie die Schaltfläche Bilder verarbeiten und warten Sie, bis ein vorläufiges Bild angezeigt wird. Die Dauer der Verarbeitung hängt von der Dateigröße, der Computerspezifikation und der Anzahl der Kandidatenlinks in den Rohdaten ab.

Um ein aktualisiertes Bild in Superauflösung zu generieren, drücken Sie die Schaltfläche "Reviewer öffnen" und ein zweites Fenster wird angezeigt. Drücken Sie die Taste zum Anpassen des Kontrasts, um die Bildanzeige wie gewünscht zu ändern. In einigen Fällen, in denen das Bild sehr dunkel ist, sollte der Maximalwert verringert werden.

Verwenden Sie das Prüferfenster, um nützliche Bildqualitätsmetriken zu generieren und das hochauflösende Bild weiter zu verfeinern. Behalten Sie für die ersten drei Parameter für die Qualitätskontrolle die Standardwerte 5.000, 0,1 bzw. 0,8 bis 3,5 bei. Aktualisieren Sie die Anzahl pro Photon.

Ändern Sie den Grenzwert für die Lokalisierungsgenauigkeit, um einen Kompromiss zwischen der Optimierung der mittleren Lokalisierung, der Genauigkeit und der Lokalisierungszahl einzugehen. Im finalen Bild werden Werte von 30 bis 50 Nanometern empfohlen, abhängig von der Qualität der Daten und der Probe. Der Standardwert für den Rekonstruktionsskalierungsfaktor ist fünf, wodurch hochauflösende Pixel von 32 Nanometern erzeugt werden, wobei davon ausgegangen wird, dass das Pixel in den Originalbildern 160 Nanometer beträgt.

Wenn die Rohbilder eine Pixelgröße von 100 Nanometern haben, entstehen superhochauflösende Bilder mit Pixeln von 20 Nanometern. Erhöhen Sie den Skalierungsfaktor, um kleinere Pixel mit Superauflösung zu erzeugen. Drücken Sie im endgültigen Bild die Schaltfläche "Reviewer ausführen", um ein aktualisiertes Bild mit Superauflösung zu generieren.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Histogramme anzeigen, um die Bildqualitätsmetriken anzuzeigen. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Bild speichern im Reviewer, um alle diese Daten zu speichern. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie ein Bild auf die gleiche Weise wie zuvor gezeigt generieren.

Drücken Sie die Schaltfläche für die Box-Verfolgung im Reviewer und klicken Sie auf ein Feld und ziehen Sie es über die Passermarkenmarkierung auf dem überprüften Bild. Warten Sie, bis ein neues Bild erscheint, in dem die geschachtelten Positionen angezeigt werden. Speichern Sie dieses Bild bei Bedarf, wenn es sich bei dem Objekt von Interesse um eine Passermarkenmarkierung handelt.

Führen Sie die Drift-Korrektur wie hier durch, indem Sie auf die Schaltfläche Anker setzen und dann auf die Schaltfläche Drift subtrahieren klicken. Klicken Sie abschließend erneut auf Prüfer ausführen, um ein neues Sturmbild zu generieren. Eine erfolgreiche Beschichtung mit Dextrin sollte eine fluoreszierende Monoschicht erzeugen, und typische Dextrindaten sind in dieser Abbildung dargestellt.

Die beugungsbegrenzten Bilder zeigen unterschiedliche Konzentrationen von Dextrin vor der Sturmbildgebung. Superauflösende Rekonstruktionen haben eine Pixelgröße von 25 Nanometern. Es wurden 10.000 Bilder mit einer Bildgröße von 1 28 x 1 28 Pixeln gesammelt, und einzelne Bilder aus dieser Sequenz werden angezeigt.

Bei einer hohen Dextrinkonzentration. Die fluoreszierende Monoschicht sollte relativ gleichmäßig erscheinen, wie in diesen Bildern und diesem Videoausschnitt dargestellt. Bei niedrigeren Konzentrationen erscheinen die Blinzeln spärlicher und scharf

Da es während dieser Bildaufnahmephase bei konstanter Laserbeleuchtung keinen offensichtlichen Hintergrund gibt, nimmt die Anzahl der Blinzeln mit der Zeit ab, wie ein Vergleich zwischen Bild 2000 und Bild 8.000 in der Probe mit hoher Dichte zeigt. Der Hauptunterschied zwischen den superhochauflösenden Bildern der hohen, mittleren und niedrigen Dextrinkonzentrationen ist die abnehmende Anzahl von Lokalisationen. Dieses Diagramm zeigt einen Durchschnitt von drei 10.000 Bildsequenzen jeder Dextrinkonzentration, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung anzeigen.

Diese proportionale Beziehung zwischen der Konzentration der fluoreszierenden Moleküle, der Anzahl der Blinzeln in den Rohdaten und der Anzahl der Lokalisierungen ist jedoch keine einfache lineare Beziehung, wie in diesem Diagramm der Anzahl der akzeptierten Lokalisierungen pro Frame dargestellt wird. Bei Verwendung eines gleitenden Mittelwerts von 100 Bildern bei sehr hohen Moleküldichten ist die Software nicht in der Lage, Moleküle bei der Abbildung einer Probe erfolgreich zu lokalisieren. Ein häufiges Problem kann das Vorhandensein von hellem, aber unfokussiertem Fluoreszenzschleier im Bild sein, der durch die Fluorkraft verursacht wird, die durch das Medium diffundiert.

Diese abgelösten fluoreszierenden Moleküle können verhindert oder entfernt werden, indem die Anzahl der Waschschritte mit PBS vor der Zugabe des Schaltpuffers erhöht wird oder indem der Kammer frischer Schaltpuffer hinzugefügt wird. Die Verarbeitung und der Vergleich der Daten aus jeder Bildsequenz führt zu sehr unterschiedlichen hochauflösenden Bildern. Panel C und D sind superaufgelöste Bildkonstruktionen, die den in Panel A bzw. B gesammelten Daten entsprechen. Dieses Diagramm stellt die Anzahl der akzeptierten Lokalisierungen pro Frame unter Verwendung eines gleitenden Durchschnitts von 100 Frames dar.

Die rote Linie entspricht der Gewittersequenz A und C mit hohem Hintergrund, die blaue Linie mit B und D, wo der Hintergrund niedrig ist. Die akzeptierte Lokalisierungsnummer für die Bilder, die den hohen und niedrigen Hintergrunddaten entsprechen, ist in der zweiten Grafik dargestellt. Diese drei beugungsbegrenzten Bilder zeigen typische Daten von vorgeformten Aktinfilamenten, die vor der Zugabe von Schaltpuffer und Sturmbildgebung an der Oberfläche des Glases haften.

Variable Längen der Filamente sind zu sehen. Bei sehr hellen Filamenten handelt es sich oft um mehrere miteinander verwickelte Filamente. Die Auswahl einzelner, relativ heller Filamente anstelle von verworrenen Bereichen führt zu einer besseren Bildqualität während der Aufnahmephase.

Helles Blinken im Fokus sollte über die gesamte Länge des Filaments zu sehen sein. Während der Erfassungsphase und anschließend in den Prozessdaten sollte ein spärliches Blinken zu sehen sein. Es sollte ein dünnes kontinuierliches Filament in den Lokalisierungen pro Frame vorhanden sein, sollte eine allmähliche Abnahme zeigen.

Typischerweise wird das volle mit halbem Maximum oder FWHM eines Filaments als empirische Schätzung der Auflösung gegeben, indem eine gerade Linie durch einen vergrößerten Bereich des Aktinfilaments unter Verwendung des Plotprofilmerkmals in Bild J gezeichnet und anschließend eine Gaußsche Anpassung durchgeführt wird. Der FWHM wird mit 43,2 Nanometern berechnet. Ein mis-Lokalisierungsproblem kann auftreten, wenn sich eine Reihe von Aktinfilamenten verzweigen und/oder kreuzen, indem Teilmengen von Frames verarbeitet und die ersten und letzten 5.000 Frames verglichen werden.

Im hochauflösenden Bild wird mit den ersten 5.000 Bildern ein anderes Bild erzeugt. Viele Lokalisierungen sind in der Mitte des Bildes zu sehen. Wenn man jedoch die letzten 5.000 Bilder verwendet, sind nur sehr wenige dieser Lokalisierungen erkennbar und nur die Filamente sind übrig geblieben, wenn auch aufgrund der geringen Anzahl von Lokalisierungen im Bild.

Wenn eine zu hohe Blinkdichte vermutet wird, kann der Vergleich der Bilder mit der Lokalisierung pro Frame-Daten stark darauf hindeuten, dass dieses Problem während des ersten Frame-Satzes auftritt. Es gibt eine durchschnittliche Anzahl von Lokalisierungen pro Frame von über 10, verglichen mit der letzten Gruppe von Frames, bei der es ungefähr vier sind. Ein weiteres potenzielles Problem in der Sturmmikroskopie ist die Drift, die auftritt, wenn sich die Probe in Bezug auf die Objektivlinse bewegt. Obwohl es in der Phase der Datenerfassung sehr schwierig ist, während der Bildaufnahmephase zu erkennen, kann die Drift in den hochauflösenden Bildern bekannter Strukturen wie Aktinfilamente nachgewiesen werden.

Das erste Anzeichen dafür, dass eine seitliche Drift aufgetreten sein könnte, ist, dass die Struktur größer ist als erwartet. Zum Beispiel mit einem relativ großen Vollen mit halbem Maximum im Vergleich zu den Präzisionsgrenzwertdaten von Regenstürmen, in diesem Fall 90 Nanometer im Vergleich zu 67 Nanometern. Eine bessere Möglichkeit, Drift zu erkennen, besteht darin, die Lokalisierungen als Funktion der Zeit IE zu vergleichen und zu sehen, ob die Lokalisierungen in den späteren Frames im Vergleich zu denen in frühen Frames verschoben sind.

Dies ist bei Aktinfilamenten deutlich zu erkennen, wenn sie mit einem Farbcode angezeigt werden. Bei Verwendung der Box-Tracking-Funktion in Rainstorm, wie in den Feldern B und C gezeigt, werden die Lokalisierungen mit einer Farbe angezeigt, die der Frame-Nummer entspricht, als sie aufgenommen wurden. Zum Beispiel sind Lokalisierungen aus dem frühen Stadium der Akquisitionssequenz blau, während Lokalisierungen aus dem späten Stadium der Akquisitionssequenz rot sind.

Die verschobenen Farben zeigen an, dass eine Drift stattgefunden hat, um zu messen und zu korrigieren. Für Drift können fluoreszierende Kügelchen mit einem Durchmesser von 100 Nanometern als Passermarken verwendet werden, die Nummern eins bis vier zeigen beschnittene und gezoomte Kügelchen einzeln an. In einem Beispiel, in dem es während der Erfassungsphase eine relativ starke Drift von etwa 100 Nanometern über einen Zeitraum von drei Minuten und 10 Sekunden gibt, kann dieselbe Box-Tracking-Funktion verwendet werden, um die Drift farblich zu kennzeichnen und zu bestätigen, da alle vier Kügelchen in diesem Beispiel nahezu identische Drift aufweisen, es ist möglich, eine von ihnen auszuwählen, in diesem Fall Perle zwei, um sie als Referenz zu verwenden und die Drift zu subtrahieren von den anderen Perlen.

Ein Vergleich mit Panel E zeigt, dass die Querdrift korrigiert wurde. Schließlich können mit epidermalen Wachstumsfaktoren gefärbte Fernazellen verwendet werden, um ein realistisches Beispiel für die Bildauflösung zu geben. In Zellen zeigt Feld A ein beugungsbegrenztes Bild eines Teils einer Helazelle, das auf die Oberfläche der Basalzelle fokussiert ist, wobei die gelben Kästchen die in den Feldern B und C gezeigten interessierenden Bereiche vergrößern, im Gegensatz zu den undeutlichen vergrößerten Interessenbereichen im beugungsbegrenzten Bild.

Die hochauflösenden Bilder sollten eine Mischung aus Clustern zeigen, gelegentlich isolierte einzelne Pixel. Die Cluster werden einen Durchmesser von etwa 100 Nanometern haben und wahrscheinlich der Bildung von Gruben und Vesikeln entsprechen. Der Weg, über den EGF überwiegend herunterreguliert und endozytierte Lokalisationen pro Frame Daten aus Panel D sind, sind in Grafik G dargestellt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einige einfache Testproben erstellt, Daten erfasst und qualitativ hochwertige Stürme rekonstruiert, siehe Auflösungsbilder.

Diese Methoden helfen dabei, einige häufige Fallstricke wie Abdrift zu vermeiden und Ihren Sturm zu optimieren. Siehe Auflösungsexperimente.