Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie hochwertige STORM-Super-Resolution-Bilder erzielt werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst eine fluoreszenzmarkierte Testprobe hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen Wechselpuffer vorzubereiten und anschließend die Bildgebungskammer mit diesem Puffer zu füllen.

Als Nächstes werden die Rohdaten an einem Storm-Mikroskop gewonnen. Der letzte Schritt besteht darin, Super-Auflösungs-Bilder aus den Rohdaten mithilfe der Rainstorm-Verarbeitungssoftware zu rekonstruieren. Abschließend dienen die Testproben dazu, zu veranschaulichen, wie hochwertige Rohdaten erfasst werden können, die anschließend verarbeitet werden, um STORM-Super-Auflösungsbilder von Zellen mit einer Auflösung zwischen 30 und 50 Nanometern zu erzeugen, was eine fünf- bis zehnfache Verbesserung der Auflösung gegenüber herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie-Methoden wie TURF und konfokaler Mikroskopie darstellt.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie die Bedeutung der Sammlung zahlreicher hochwertiger, sparsam verteilter Verknüpfungen nicht erkennen. Dies wird durch die Verwendung des Alexa-647-Farbstoffs im geeigneten Schaltpuffer erheblich erleichtert. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist unerlässlich, da die Gewinnung hochwertiger Rohdaten entscheidend für die Erzeugung von SPR-Auflösungsbildern ist.

Die rohen Videosequenzen dieser Technik sehen völlig anders aus als jede andere Form der Fluoreszenzmikroskopie. Beginnen Sie das Verfahren zur Beschichtung von Glas mit fluoreszierendem Dextrin, indem Sie 200 Mikroliter einer 0,01-%-Polylysin-Lösung in jede Vertiefung einer achtfachen Kammer-Deckglasplatte geben und 10 Minuten lang inkubieren. Nach 10 Minuten entfernen Sie die Polylysin-Lösung mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit zurückbleibt.

0,25 µL einer Stammlösung von zwei Milligramm pro Milliliter Dextrin-Alexa 647 in 25 µL entionisiertem Wasser, um eine 20-Mikrogramm-pro-Milliliter-Lösung herzustellen, um eine dichte Beschichtung mit Dextrin-Alexa 647-Lösung zu erzeugen.

Verdünnen Sie 20 Mikroliter der 20 Mikrogramm pro Milliliter-Lösung auf insgesamt 200 Mikroliter entionisiertes Wasser. Für eine mittlere Dichte verdünnen Sie zwei Mikroliter in 200 Mikroliter entionisiertes Wasser. Für eine verdünnte Lösung verdünnen Sie 0,2 Mikroliter.

In 200 Mikroliter entionisiertem Wasser 200 Mikroliter der verdünnten Dextrin Alexis X 47-Lösungen in jede Vertiefung geben und 10 Minuten inkubieren. Längere Inkubationszeiten können verwendet werden, was zu einer dichteren Dextrin-Beschichtung führen kann. Abschließend Dexter Xis X 47-Lösungen entfernen und dreimal mit Wasser waschen.

Um fluoreszierende Aktinfilamente auf Glas vorzubereiten, geben Sie zunächst 200 Mikroliter einer 0,01 %igen Polylysin-Lösung in jedes der Vertiefungen einer Acht-Kammer-Deckglasplatte. Inkubieren Sie 10 Minuten lang. Entfernen Sie die Flüssigkeit anschließend mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit zurückbleibt.

Fügen Sie jedem Kammer 90 µL allgemeines Aktin-Puffer hinzu, das zuvor gemäß den Herstelleranweisungen rekonstituiert wurde. Fügen Sie dann 10 µL einer 10 µM vorgebildeten Aktin-Filamentlösung und ein µL Foid und Alexa 647 hinzu, pipettieren Sie vorsichtig mehrmals auf und ab, um die Probe zu mischen, und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, um mikrosphärische fluoreszierende Kügelchen als fiduziale Marker vorzubereiten. Verdünnen Sie ein µL Tepec-Kügelchen in 200 µL PBS und mischen Sie. Geben Sie die verdünnten Kügelchen in die Abbildungskammer und warten Sie 15 Minuten.

Nach 15 Minuten die Lösung entfernen und vor der Bildgebung dreimal mit PBS waschen. Für dieses Experiment werden Zellen verwendet, die bis zu etwa 80 % Konfluenz kultiviert wurden. Das Kulturmedium entfernen und mit PBS waschen. Anschließend 500 Mikroliter einer 4 %igen Formaldehydlösung für 10 Minuten hinzufügen.

Entfernen Sie die Formaldehydlösung und waschen Sie dreimal mit PBS. Lassen Sie die Zellen nicht austrocknen und verwenden Sie stets mit PBS gepufferte Lösungen. Um hypotonischen Stress zu vermeiden, geben Sie zwei Mikroliter einer 50 Mikrogramm pro Milliliter Stammlösung von EGF Alexa 647 zu 200 Mikrolitern einer 0,1-%-BSA-Lösung und geben Sie diese Lösung anschließend zu den Hela-Zellen.

Ansatz 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung entfernen und dreimal mit PBS waschen. Eine Blockierungslösung mit 0,1 % BSA hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur belassen.

Entfernen Sie danach die Blockierungslösung und waschen Sie das Präparat anschließend dreimal mit PBS, bevor Sie die Bildaufnahme durchführen. Unmittelbar vor der Bildaufnahme stellen Sie den Schalt-Puffer her, indem Sie die Enzym-Glucose- und Reduktionsmittel-Stammlösungen im Verhältnis von 50 Mikrolitern, 400 Mikrolitern und 100 Mikrolitern mischen und PBS hinzufügen, um das Endvolumen auf einen Milliliter aufzufüllen. Entfernen Sie das PBS aus der Bildgebungskammer und füllen Sie diese dann bis zum Rand mit dem Schalt-Puffer auf.

Platzieren Sie vorsichtig ein Deckglas auf der Kammer, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keinerlei Blasen bilden und die gesamte Kammer bedeckt ist. Sollten Blasen sichtbar sein, füllen Sie zusätzliche Pufferlösung oder PBS nach. Andernfalls kann die Pufferleistung nachlassen.

Die Sammlung hochwertiger, spärlicher Verknüpfungsdaten ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens. Stellen Sie daher sicher, dass die Mikroskope korrekt fokussiert sind und die richtigen Aufnahmeeinstellungen verwendet werden. Suchen Sie eine zu bildgebende fluoreszierende Struktur von Interesse. Wählen Sie den gewünschten Beleuchtungswinkel aus.

In diesem Fall wird ein flacher Winkel oder ein stark geneigter Winkel empfohlen, da dies das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, indem Streulicht minimiert wird, was insbesondere für Zellproben von Vorteil ist. Erstellen Sie eine Referenz zur bruchweise begrenzten Abbildung der Struktur vor der STORM-Aufnahme. Erhöhen Sie den Anregungslaser auf eine hohe Leistung von etwa zwei Kilowatt pro Quadratzentimeter, während Sie mit Kameraeinstellungen von 10 Millisekunden Belichtungszeit und einer Zykluszeit von etwa 50 Hertz beziehungsweise Bildern pro Sekunde aufnehmen.

Sobald die Flora-Viers in ein spärliches Blinkmuster übergegangen sind, sammeln Sie 10.000 Bilder. Öffnen Sie zur Initiierung dieser Rekonstruktion die RAINSTORM-M-Datei innerhalb von MATLAB und führen Sie sie im Rainstorm-Fenster aus.

Wählen Sie die zu analysierende Bilddatei mithilfe der Schaltfläche „Durchsuchen“ aus. Es sollte sich um eine TIF-Datei handeln. Ändern Sie die Pixelbreite, um sie an die Rohdaten des Mikroskopsystems anzupassen, das zur Datenaufnahme verwendet wurde.

Belassen Sie die anderen Werte auf Standard. Drücken Sie die Schaltfläche „Bilder verarbeiten“ und warten Sie, bis ein vorläufiges Bild erscheint. Die Dauer der Verarbeitung hängt von der Dateigröße, der Computerleistung und der Anzahl der Kandidatenlinks in den Rohdaten ab.

Um ein aktualisiertes Super-Resolution-Bild zu erzeugen, drücken Sie die Schaltfläche „Reviewer öffnen“, woraufhin ein zweites Fenster erscheint. Drücken Sie die Schaltfläche „Kontrast anpassen“, um die Bildanzeige nach Wunsch zu verändern. In einigen Fällen, in denen das Bild sehr dunkel ist, sollte der Maximalwert verringert werden.

Verwenden Sie das Überprüfungsfenster, um nützliche Metriken zur Bildqualität zu erzeugen und das Super-Resolution-Bild weiter zu verfeinern. Belassen Sie die ersten drei Parameter der Qualitätskontrolle bei den Standardwerten von 5.000, 0,1 und 0,8 bis 3,5. Aktualisieren Sie den Wert für die Anzahl der Zählungen pro Photon.

Ändern Sie die Grenze der Lokalisierungsgenauigkeit, um einen Kompromiss zwischen der Optimierung der mittleren Lokalisierungsgenauigkeit und der Anzahl der Lokalisationen zu finden. Für das endgültige Bild werden Werte zwischen 30 und 50 Nanometern empfohlen, abhängig von der Qualität der Daten und der Probe. Der Standardwert für den Rekonstruktionsskalierungsfaktor beträgt fünf, wodurch Super-Resolution-Pixel von 32 Nanometern erzeugt werden, unter der Annahme, dass das Pixel in den ursprünglichen Bildern 160 Nanometer beträgt.

Wenn die Rohbilder eine Pixelgröße von 100 Nanometern aufweisen, erzeugt dies Überauflösungsbilder mit Pixeln von 20 Nanometern. Erhöhen Sie den Skalierungsfaktor, um kleinere Pixel in der Überauflösung zu erzeugen. Drücken Sie im endgültigen Bild die Schaltfläche „Reviewer ausführen“, um ein aktualisiertes Überauflösungsbild zu generieren.

Drücken Sie die Schaltfläche „Histogramme anzeigen“, um Bildqualitätsmetriken anzuzeigen. Zuletzt drücken Sie die Schaltfläche „Bild speichern“ im Betrachter, um alle diese Daten zu speichern. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie ein Bild auf die gleiche Weise wie zuvor gezeigt erzeugen.

Drücken Sie die Box-Tracking-Schaltfläche im Rezensenten und klicken Sie, während Sie ein Rechteck über die Referenzmarkierung im überprüften Bild ziehen. Warten Sie, bis ein neues Bild erscheint, das die markierten Positionen anzeigt. Speichern Sie dieses Bild, falls gewünscht, insbesondere dann, wenn das Objekt von Interesse eine Referenzmarkierung ist.

Wie hier der Fall, führen Sie eine Driftkorrektur durch, indem Sie auf die Schaltfläche „Anker festlegen“ und anschließend auf die Schaltfläche „Drift subtrahieren“ klicken. Klicken Sie abschließend erneut auf „Reviewer ausführen“, um ein neues STORM-Bild zu generieren. Eine erfolgreiche Beschichtung mit Dextrin sollte eine fluoreszierende Monoschicht ergeben, und typische Dextrin-Daten sind in dieser Abbildung dargestellt.

Die beugungsbegrenzten Aufnahmen zeigen unterschiedliche Konzentrationen von Dextrin vor der Storm-Aufnahme. Die superauflösenden Rekonstruktionen weisen eine Pixelgröße von 25 Nanometern auf. Es wurden 10.000 Bilder mit einer Bildgröße von 128 × 128 Pixeln aufgenommen, und einzelne Bilder dieser Sequenz werden hier dargestellt.

Bei hoher Dextrinkonzentration. Der fluoreszierende Monolage sollte relativ homogen erscheinen, wie in diesen Bildern und diesem Videoabschnitt veranschaulicht. Bei niedrigeren Konzentrationen erscheinen die Blinkpunkte seltener und fokussierter.

Da während dieser Bildakquisitionsphase bei konstanter Laserbeleuchtung keine offensichtliche Hintergrundfluoreszenz vorhanden ist, nimmt die Anzahl der Blinkereignisse im Laufe der Zeit ab, wie ein Vergleich zwischen Frame 2000 und Frame 8.000 in der hochkonzentrierten Probe veranschaulicht. Der Hauptunterschied zwischen den Super-Resolution-Bildern der hohen, mittleren und niedrigen Dextrinkonzentrationen ist die abnehmende Zahl der Lokalisierungen. Dieses Diagramm zeigt den Durchschnitt von drei Sequenzen mit jeweils 10.000 Frames für jede Dextrinkonzentration, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung angeben.

Jedoch ist diese proportionale Beziehung zwischen der Konzentration der fluoreszierenden Moleküle, der Anzahl der Blinks in den Rohdaten und der Anzahl der Lokalisationen nicht einfach linear, wie in dieser Darstellung der Anzahl akzeptierter Lokalisationen pro Bild gezeigt. Bei Verwendung eines gleitenden Mittelwerts über 100 Bilder ist die Software bei sehr hohen Moleküldichten nicht in der Lage, Moleküle erfolgreich zu lokalisieren, unabhängig von der Probe. Ein häufiges Problem kann das Vorhandensein eines hellen, aber unscharfen fluoreszierenden Schleiers über das gesamte Bild sein, der durch Fluorophore verursacht wird, die durch das Medium diffundieren.

Diese abgelösten fluoreszierenden Moleküle können verhindert oder entfernt werden, indem die Anzahl der Waschschritte mit PBS vor dem Hinzufügen des Umschalt-Puffers erhöht wird, oder indem frischer Umschalt-Puffer der Kammer zugegeben wird. Die Verarbeitung und der Vergleich der Daten aus jeder Bildsequenz führen zu sehr unterschiedlichen Super-Auflösungs-Bildern. Die Panel C und D zeigen Konstruktionen von Super-Auflösungs-Aufnahmen, die den in den Panel A und B gesammelten Daten entsprechen. Dieses Diagramm zeigt die Anzahl der akzeptierten Lokalisationen pro Einzelbild, berechnet als gleitender Durchschnitt über 100 Einzelbilder.

Die rote Linie entspricht der Sturmsequenz A und C mit hohem Hintergrund, die blaue Linie entspricht B und D mit niedrigem Hintergrund. Die akzeptierte Lokalisierungszahl für die Bilder, die den Daten mit hohem bzw. niedrigem Hintergrund entsprechen, ist im zweiten Diagramm dargestellt. Diese drei diffraktionsbegrenzten Bilder zeigen typische Daten von vorformierten Aktinfilamenten, die vor der Zugabe des Schaltbuffers und der STORM-Aufnahme an der Glasoberfläche haften.

Es sind Filamente mit variablen Längen zu erkennen. Sehr helle Filamente sind oft mehrere miteinander verstrickte Filamente. Die Auswahl einzelner, relativ heller Filamente anstelle verstrickter Bereiche führt in der Erfassungsphase zu Bildern besserer Qualität.

Helle, scharf fokussierte Aufblitze sollten entlang der gesamten Länge des Filaments sichtbar sein. Während der Erfassungsphase sollten nur vereinzelte Aufblitze zu sehen sein, und anschließend im verarbeiteten Datensatz. Es sollte ein dünner, durchgehender Faden sichtbar sein; die Lokalisationen pro Bild zeigen dabei einen allmählichen Rückgang.

Typischerweise wird die volle Breite bei halber Höhe (FWHM) eines Filaments als empirische Schätzung der Auflösung angegeben, indem eine Gerade durch einen vergrößerten Bereich des Aktinfilaments mithilfe der Plot-Profil-Funktion in ImageJ gezogen und anschließend eine Gauß-Anpassung durchgeführt wird. Die FWHM beträgt 43,2 Nanometer. Es kann ein Problem der Fehllokalisation auftreten, wenn mehrere Aktinfilamente verzweigen und/oder sich überschneiden, indem Teilmengen von Einzelbildern verarbeitet und die ersten und letzten 5.000 Einzelbilder verglichen werden.

Ein anderes Bild wird im superauflösenden Bild unter Verwendung der ersten 5.000 Bilder erzeugt. Zahlreiche Lokalisationen sind in der Bildmitte zu erkennen. Wenn hingegen die letzten 5.000 Bilder verwendet werden, sind nur noch sehr wenige dieser Lokalisationen sichtbar, und lediglich die Filamente verbleiben, wenn auch aufgrund der geringen Anzahl an Lokalisationen im Bild teilweise als zusammenhängende Strukturen.

Wenn eine zu hohe Blinkdichte vermutet wird, kann ein Vergleich der Bilder mit den Lokalisierungen pro Einzelbild stark darauf hindeuten, dass dieses Problem während des ersten Bildserienabschnitts auftritt. Die durchschnittliche Anzahl an Lokalisationen pro Einzelbild liegt hier mit über 10 deutlich über der des letzten Abschnitts, wo sie etwa vier beträgt. Ein weiteres potenzielles Problem in der STORM-Mikroskopie ist Drift, das auftritt, wenn sich die Probe in Bezug auf die Objektivlinse bewegt. Obwohl Drift während der Bildakquisition äußerst schwer zu erkennen ist, kann es in den Super-Auflösungs-Bildern bekannter Strukturen wie Aktinfilamenten nachträglich identifiziert werden.

Das erste Anzeichen dafür, dass eine laterale Drift aufgetreten sein könnte, ist, dass die Struktur größer ist als erwartet. Zum Beispiel bei einer relativ großen Volllinienbreite bei halber Höhe im Vergleich zu den Präzisionsgrenzdaten von Regenstürmen, in diesem Fall 90 Nanometer im Vergleich zu 67 Nanometern. Eine bessere Möglichkeit, eine Drift zu erkennen, besteht darin, die Lokalisierungen als Funktion der Zeit zu vergleichen, also zu prüfen, ob die Lokalisierungen in späteren Einzelbildern im Vergleich zu denen in frühen Einzelbildern verschoben sind.

Dies ist deutlich am Beispiel von Aktinfilamenten zu erkennen, wenn diese mit einer Farbcodierung dargestellt werden. Mithilfe der Box-Tracking-Funktion in Rainstorm, wie in den Paneln B und C gezeigt, werden Lokalisationen mit einer Farbe dargestellt, die der Bildnummer entspricht, zu der sie aufgenommen wurden. Zum Beispiel sind Lokalisationen aus frühen Phasen der Aufnahme blau, während Lokalisationen aus späteren Phasen der Aufnahme rot sind.

Die verschobenen Farben weisen darauf hin, dass eine Drift aufgetreten ist, um diese zu messen und zu korrigieren. Zur Drift-Korrektur können fluoreszierende Perlen mit einem Durchmesser von 100 Nanometern als Referenzmarker verwendet werden. Die Zahlen eins bis vier zeigen einzeln beschnittene und vergrößerte Perlenbilder. In einem Beispiel, in dem während einer Aufnahmezeit von drei Minuten und 10 Sekunden eine relativ starke Drift von etwa 100 Nanometern auftritt, kann dieselbe Box-Tracking-Funktion verwendet werden, um die Drift farblich zu kodieren und zu bestätigen. Wie hier gezeigt, weisen alle vier Perlen nahezu identische Drift auf. In diesem Fall ist es möglich, eine der Perlen – hier Perle zwei – als Referenz auszuwählen und die Drift von den anderen Perlen zu subtrahieren.

Ein Vergleich mit Panel E zeigt, dass die laterale Drift korrigiert wurde. Schließlich können epidermale Wachstumsfaktor-gefärbte HeLa-Zellen verwendet werden, um ein realistisches Beispiel der Bildauflösung zu geben. Bei den Zellen zeigt Panel A ein beugungsbegrenztes Bild eines Teils einer HeLa-Zelle, das auf die basale Zelloberfläche fokussiert ist, wobei die gelben Kästchen vergrößerte Bereiche von Interesse anzeigen, die in den Panels B und C im Gegensatz zu den unscharfen vergrößerten Bereichen von Interesse im beugungsbegrenzten Bild dargestellt sind.

Die Super-Auflösungs-Bilder sollten ein Gemisch aus Haufen mit gelegentlich isolierten Einzelpixeln zeigen. Die Haufen haben einen Durchmesser von etwa 100 Nanometern und entsprechen vermutlich entstehenden Gruben und Vesikeln. Der Weg, über den EGF vorwiegend herunterreguliert und die Endozytose-Lokalisationen pro Bild aus Panel D in Diagramm G dargestellt werden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einfache Testproben herstellt, Daten aufnimmt und hochwertige STORM-Bilder mit hoher Auflösung rekonstruiert.

Mithilfe dieser Methoden lassen sich einige häufige Probleme bei der Anpassung, wie z. B. Drift, vermeiden und Ihr STORM-Verfahren optimieren. Siehe Auflösungsexperimente.