Name: Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: Lernen Sie die Präparation fluoreszenter Testproben für STORM-Mikroskopie mit Auflösungen von 30–50 nm. Diese Methode ermöglicht hochwertige Rohdatenerfassung und Bildrekonstruktion für zellbiologische Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir erkennen an, Mittel aus dem chemischen und biologischen Messtechnik-Programm von National Measurement Büro in Großbritannien. Wir danken Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi und Eric Rees für technische Beratung und Anregungen. Wir danken Miklos Erdelyi, Eric und Max Rees Ryadnov für hilfreiche Kommentare und Diskussionen zu diesem Manuskript.

Hinweis: In diesem Protokoll werden Tipps und Anregungen folgende bestimmte Schritte gefunden. Die Bezeichnung &quot;* 1&quot; zeigt an, dass Note 1 ist relevant für diesen bestimmten Schritt, und so weiter. 1. Leuchtstoff-Beschichtung von Glas-Dextran <ol><li> Nach Zugabe von 200 ul 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung in jede Vertiefung einer 8-Kammerdeckgläser und Inkubation für 10 min. Entfernen mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass keine Restflüssigkeit ist. </li><li> Rekonstituieren Dextran-Alexa 647 * 1 nach den Anweisungen des Herstellers, um eine 2 mg / ml Stammlösung erstellen. Daraus verdünnen 0,25 ul in 25 ul entionisiertem Wasser, um eine 20 ug / ml Lösung. </li><li> Um eine hohe Dichte der Beschichtungs Dextran-Alexa 647-Lösung zu erstellen verdünnt 20 &amp;mgr; l der 20 &amp;mgr; g / ml Lösung in einer Gesamtmenge von 200 &amp;mgr; l entionisiertem Wasser. Für eine mitteldichte Lösung zu verdünnen 2 ul in 200 ul de-ionisiertes Wasser (1:10.000 Verdünnung aus dem ursprünglichen Stammlösung). Für einen niedrigenDichte Lösung zu verdünnen 0,2 ul in 200 ul de-ionisiertes Wasser (1:100.000 Verdünnung aus dem ursprünglichen Stammlösung). </li><li> In 200 ul der verdünnten Dextran-Alexa 647-Lösungen in jede Vertiefung und Inkubation für 10 min. Längere Inkubationszeiten können verwendet werden, was zu einer dichteren Beschichtung Dextran zurückzuführen sind. Ausziehen und mit H 2 O dreimal * 2 </li></ol> Anmerkung 1: Andere Dextran-Farbstoff-Konjugate können verwendet werden. Unkonjugierten Dextran kann auch Farbstoffe konjugiert werden, falls gewünscht Kombinationen sind nicht im Handel erhältlich. Anmerkung 2: Die gleichen Dextran Kammern über einen Zeitraum von Wochen wieder abgebildet, obwohl die Gleichmäßigkeit der Fluoreszenz kann verringern. Lagerung bei 4 ° C in Abwesenheit eines Puffers wird empfohlen. 2. Leuchtstoff Aktin-Filamente auf Glas <ol><li> Nach Zugabe von 200 ul 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung in jede Vertiefung und Inkubieren der Kammer für 10 min * 3. Rebewegen sich mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit übrig ist. </li><li> Hinzufügen von 90 &amp;mgr; l Actin allgemeinen Puffer (gemäß den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert) zu jeder Kammer. In 10 ul von 10 uM vorgeformte Aktin-Filament-Lösung und 1 ul Phalloidin-Alexa 647 (0,2 Einheiten, wenn in 1,5 ml Methanol als den Anweisungen des Herstellers) gelöst und vorsichtig pipettieren, auf und ab zu mischen. Inkubation: 30 min * 4. </li></ol> Anmerkung 3: Eine Erhöhung des Volumens des Filaments Lösung innerhalb der Kammer zu weniger Filamente Bindung an die Poly-L-Lysin beschichteten Glas. Anmerkung 4: Die Inkubationszeiten von bis zu 48 Stunden bei 4 ° C mit guten Ergebnissen getestet. Bildqualität verschlechtert Aktin-Filament einmal Kammer Schaltpuffer so ist es nicht empfehlenswert, die dieselbe Probe für mehr als einen Tag benutzen ausgesetzt. 3. Microsphere Leuchtstoffkügelchen als Bezugsmarken <ol><li&gt; Verdünnen 1 ul TetraSpeck Perlen in 200 ul PBS und mischen. </li><li> Fügen Sie die verdünnt Perlen in einem bildgebenden Kammer und warten Sie 15 min * 5. Entfernen Sie die Lösung und 3 x waschen mit PBS vor der Bildgebung. </li></ol> Anmerkung 5 - die Verdünnung und Inkubationszeit kann angepasst werden, um unterschiedliche Dichten von Perlen zu erhalten. Dieses Protokoll führt in der Regel zwischen 3 bis 10 Perlen pro 20,5 x 20,5 um um Feld-of-view. 4. Epidermal Growth Factor Zellfärbung <ol><li> HeLa-Zellen in Kultur Abbildungskammern auf etwa 80% Konfluenz in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung ergänzt. </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen mit PBS. Dann fügen Sie 500 ul von 4% Formaldehydlösung (4 ml 10% Formaldehydlösung, 1 ml 10X PBS, 5 ml Wasser) für 10 min. Entfernen Sie die Formaldehyd und 3 x waschen mit PBS. Nicht in die Zellen d bleibenry und verwenden Sie immer PBS gepufferten Lösungen zu hypotone Stress zu vermeiden. </li></ol> ACHTUNG - Formaldehyd ist extrem giftig. Stellen Sie sicher, dass geeignete Schutzhandschuhe, Schutzbrille und Laborkittel getragen werden. Überprüfen Sie die lokalen Richtlinien für die Entsorgung von Formaldehyd. <ol start="3"><li> Rekonstituieren EGF-Alexa 647 nach Herstellerangaben um eine 50 ug / ml Stammlösung erstellen. In 2 ul dieser Stammlösung zu 200 ul 0,1% BSA-Lösung (in PBS). Entfernen Sie die PBS von den Zellen, fügen Sie den EGF-Lösung und Inkubation für 30 min. </li><li> Entfernen Lösung und wäscht 3 mal mit PBS vor der Zugabe einer Blockierungslösung aus 0,1% BSA (in PBS) für 15 min. Entfernen Sie diese und waschen noch 3 mal mit PBS vor der Bildgebung. </li></ol> 5. Schalt Buffer Vorbereitung <ol><li> Bilden eine Enzymstammlösung (A) mit 10 &amp;mgr; l Katalase (20 ug / ml), 20 ul 1 M Tris (2-carboxyelthyl) phosphin-Hydrochlorid (4 mM), 2,5 ml Glycerin (50%), 125 &amp;mgr; l1 M KCl (25 mM), 100 ul 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg Glucoseoxidase (1 mg / ml) und oben bis zu 5 ml Volumen mit diH20. Dies ist ausreichend, um 100 x 50 ul-Aliquots, die bei -20 ° C gelagert und für bis zu 1 Jahr verwendet werden kann, zu machen. </li><li> ) Machen Sie eine Glucose-Stammlösung (B) mit 4 g Glucose (100 mg / ml), 4 ml Glycerin (10%) und 36 ml diH20. Dies ist ausreichend, um 100 x 400 ul Aliquote, die gelagert werden können machen - 20 ° C und bis zu 1 Jahr verwendet. </li><li> Machen Sie eine Reduktionsmittel-Vorratslösung (C) mit 113,6 mg MEA-HCl (1M) und 1 ml diH 2 0. Verwenden Sie frische oder machen 10 x 100 ul Aliquots, die bei -20 ° C gelagert und für bis zu 1 Monat verwendet werden können (nicht Aliquots einfrieren). </li><li> Kurz vor der Bildgebung, mischen das Enzym (A), Glucose (B) und zusammen Reduktionsmittel (C) Stammlösungen im Verhältnis 50 ul, 400 ul, 100 ul und auf 1 ml mit PBS * 6. Dieser Puffer wird nun abfangen Sauerstoff und haben eine reduzierende Umgebung (100 mM MEA-HCl) * 7. * 8 8.5 (Einstellung ist normalerweise nicht notwendig) - Der endgültige pH-Wert sollte im Bereich von 6,0. </li></ol> Anmerkung 6 - dieser Puffer zur Verwendung mit Carbocyanin-Farbstoffe, wie Cy5 und Alexa 647. Anmerkung 7 - die endgültigen Enzymkonzentrationen sind 50 ug / ml (5 U / ml) Glucose-Oxidase und 1 ug / ml (40-60 Einheiten / ml) an Katalase. Die enzymatische Aktivität (Einheiten) wird von Lieferanten gegeben und können variieren. Die Berechnungen für Katalase annehmen, dass 1 ug / ml Endkonzentration nach dem Schritt 5.4 werden mit 50 Einheiten des Enzyms enthalten. Verschiedene Pufferzusammensetzungen einschließlich ähnlicher sauerstoffbindende Komponenten 21,30,40 gefunden werden. Für eine Zusammenfassung der Puffer-und Farbstoffkombinationen siehe Referenzen 28,29. Glycerin und TCEP sind für langfristige Lagerung bei -20 ° C erforderlich Anmerkung 8 - wenn die Bildgebung Aktinfilamente hinzufügen 2 mM MgCl 2 und 0,2 mM ATP zur Stabilisierung ter Filamente. 6. Mikroskop Erwerb von STORM-Daten (mit Alexa 647-Farbstoff) <ol><li> Schalten Sie die STORM / PALM Mikroskop, vorzugsweise mindestens 3 Stunden vor der Belichtung, damit ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen. Vor diesem Abbildungs ​​eine erhöhte Chance Drift. </li><li> Setzen Sie die Bildraum in den Mikroskoptisch Probenhalter. Sicherzustellen, dass die Probe fest an der Halterung und ist flach. </li><li> Entfernen Sie die PBS von der Bildkammer und dann oben mit dem Schalt Puffer zu füllen. Ein Deckglas sorgfältig über die Oberseite der Kammer, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen an alle und die gesamte Kammer bedeckt. Füllen Sie zusätzliche Puffer oder PBS, wenn irgendwelche Luftblasen zu sehen sind sonst Puffer Leistung sinken kann. </li></ol> VORSICHT -, um die Chancen der lateralen und axialen Drift der Probe in Bezug auf die Objektivlinse zu minimieren, wird empfohlen, dass die Probe und der Puffer äquilibrieren gelassenauf Raumtemperatur für mindestens 15 min vor der Bilderzeugung. <ol start="4"><li> Suchen Sie eine Leuchtstoffstruktur von Interesse, die abgebildet werden. Wählen Sie den gewünschten Beleuchtungswinkel, in diesem Fall ein TIRF oder stark geneigten Winkel wird empfohlen, da dies verbessert das Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch Minimieren out-of-focus-Licht, die besonders von Vorteil für die Zellproben ist. Werfen Sie einen Referenzbeugungsbegrenzten Bild der Struktur vor der STORM-Bildgebung. </li><li> Erhöhung des Anregungslasers (mit einer geeigneten Anregungswellenlänge von ca. 640 nm) auf eine hohe Leistung, entsprechend etwa 2 kW / cm 2, während Bildgebung mit Kameraeinstellungen von 10 ms Belichtung und einer Zykluszeit von etwa 50 Hz (Frames pro Sekunde) . Sobald die Fluorophore sind in eine spärlich Blinkmuster (wahrscheinlich innerhalb von 10 Sekunden für die meisten Proben) umge sammeln 10.000 Frames * 9. </li></ol> Hinweis 9 - 10000 Rahmen ist für die hier beschriebenen Probenaber es kann notwendig sein, um die Rahmennummer zu 50.000 oder mehr für andere Proben zu erhöhen. 7. Die Rekonstruktion superauflösende Bilder von Raw-Daten (mit Regensturm) <ol><li> Öffnen Sie die Datei rainSTORM.m aus MATLAB und führen (Abbildung 1A). </li><li> In der Regensturm Fenster (Abbildung 1B) wählen Sie die Bilddatei mit der Schaltfläche Durchsuchen analysiert werden. Dies sollte ein. Tif-Datei (ImageJ kann verwendet werden, um andere Dateitypen in eine tif-Format zu konvertieren) sein. Ändern Sie die Pixelbreite, um die Rohdaten des Mikroskop-System verwendet, um die Daten zu erwerben * 10 entsprechen. Lassen Sie die anderen Werte auf die Standard. </li></ol> Anmerkung 10 - Eine typische EMCCD Kamera hat eine Pixelgröße von 16 um so auf ein System mit einem 100-fach Objektiv die Bildpunktgröße auf dem Bild 160 nm sein. Kommerziellen Systemen die Pixelgröße in der Regel innerhalb der Software angezeigt. Pixelgrößen variieren zwischen 100 nm und 160 nm für die meisten Lokalisierungs Mikroskopen.<ol start="3"><li> Drücken Sie die Taste &quot;Prozessbilder&quot; und warten, bis ein vorläufiges Bild erscheint. Die Dauer der Behandlung wird von der Dateigröße, Computer-Spezifikation und der Anzahl der Kandidaten blinkt in den Rohdaten * 11 ab. </li></ol> Anmerkung 11 - 10.000 Bildsequenzen von Aktin und EGF Daten dauerte 23 Sekunden und 25 Sekunden, um jeweils unter Verwendung eines PC mit einem Intel Xeon E5420 CPU. Mit dem gleichen Computer ohne Parallelverarbeitung Toolbox in MATLAB, oder mit einem Computer ohne Mehrkern-Verarbeitung, waren mal 66 sec und 81 sec auf. <ol start="4"><li> So generieren Sie einen aktualisierten Super-Resolution-Bild drücken Sie die Taste &quot;Open-Bewerter&quot; und ein zweites Fenster wird angezeigt (Abbildung 1C). Drücken Sie die &quot;Kontrast anpassen&quot;-Taste, um die Bildanzeige zu ändern wie gewünscht (1D). In einigen Fällen, wo das Bild sehr dunkel ist der Maximalwert verringert werden sollte. </li><li> Verwenden Sie die Drehzahliewer Fenster (Abbildung 1C), nützliche Bildqualitätsmetriken zu generieren und zu verfeinern, die Super-Resolution-Bild weiter. Stellen Sie die ersten drei Qualitätskontrollparameter auf Werte von 4.000, 0,1 und 0,8 bis 2,0 bzw. * 12. Aktualisieren Sie die Zählungen pro Photon-Wert, der entweder auf einem Photonenkalibrierungsmessung oder mit Photon-Kurve von der Kamera-Hersteller für einen bestimmten EM-Gain-Einstellung angegeben Eichkurve Werte beruhen sollte. Dies ist entscheidend für den Erhalt genaue Präzision und Auflösung * 13 Messungen. </li></ol> Anmerkung 12 - Signal Grafen lehnt blinkt basierend auf Helligkeit Kriterien. Je höher der Wert, desto heller die Blink sein muss, werden als Lokalisierungs im endgültigen Bild akzeptiert. Dies muss je nach den Photonenausgang des Farbstoffs und die Belichtungszeit und die Empfindlichkeit der Kamera verändert werden. Toleranz ablehnt blinkt, wenn eine signifikante quadratische Fehler zwischen dem Signal und der angepassten Gauß dh double Spitzen. PSF Sigma Bereich lehnt blinkt, wenn die Einbaubreite der PSF aus diesem Bereich liegt, kann also eine engere Bereich verwendet werden, um out-of-focus-Signale und großen aggregierten Blobs von konstanten Fluoreszenz abzulehnen. Mit einem breiteren Spektrum kann in Fehllokalisation Artefakte im endgültigen Bild erscheinen, führen. In der Praxis empfiehlt es sich, erste Qualitätskontrolle durchführen mit Hilfe der Lokalisierungsgenauigkeit Cutoff-Parameter. Anmerkung 13 - für mehr Auflösung Metriken siehe Referenzen 23,27. In Kürze durch das Wissen, die Anzahl der Photonen, die von jedem hergestellt blinken ist es möglich, die Lokalisierungsgenauigkeit jedes Lokalisierungs berechnen und somit ableiten Gesamtmittel Präzision Schätzungen für das gesamte Bild. Mit einem Andor Ixon DU-897E mit einem Gain-Einstellung von 200 den Grafen pro Photon-Wert beträgt 9,04. <ol start="6"><li> Ändern Sie die Lokalisierungsgenauigkeit Cutoff (1C), um zwischen der Optimierung mittlere Lokalisierungs precis KompromissIonen gegen Lokalisierungsnummer in dem endgültigen Bild. Werte von 30-50 nm in Abhängigkeit von der Qualität der Daten und der Probe empfohlen. Beide die Histogramme und die info.txt Dateien können verwendet werden, um diese Entscheidung (1F und 1G) zu informieren. </li><li> Die Rekonstruktion Skalierungsfaktor (Abbildung 1C) Standard ist 5, die Super-Resolution-Pixel des 32-nm-Annahme, dass die Pixelbreite in der Originalbilder ist 160 nm erzeugen wird. Wenn die RAW-Bilder haben eine Pixelgröße von 100 nm das wird super-aufgelöste Bilder mit Pixeln von 20 nm zu erzeugen. Erhöhen Sie den Skalierungsfaktor, der kleiner Super-Resolution-Pixel im fertigen Bild * 14 zu produzieren. </li></ol> Anmerkung 14 - Auflösung der Lokalisationsmikroskopie, hängt von der für die Visualisierung (dh die Pixelgröße von einem einfachen Histogramm-Rekonstruktion) sowie die Lokalisierungsgenauigkeit erforderlich Glättung. In der Praxis sollte die Rekonstruktionspixelgröße in der Regel kleiner als die Lokalisierungs seinPräzision (siehe mittlere Präzisionsschätz Metrik in der Info-Text-Datei - Schritte 6.11 &amp; 6.12). In diesem Fall ist der Auflösungsverlust durch Rekonstruktion Pixelgröße klein 23,27 sein. Beispielsweise können die Durchschnittsgenauigkeit Schätzungen in der Zeilen-und Spaltenrichtung von Fig. 4E sind 16,1 nm und 16,2 nm aufweist. Eine Pixelgröße von 16 nm wurde verwendet, um diese Daten (Rekonstruktion Skalierungsfaktor von 10 mit einem ursprünglichen Pixelbreite von 160 nm) sichtbar zu machen. <ol start="8"><li> Ändern Sie die Grenze Frame-Bereich (1C), um den Wiederaufbau, um Teilmengen der Rohdaten zu beschränken, zum Beispiel [2001-inf] würde die ersten 2000 Bilder von Rohdaten aus. </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Run Rezensent&quot; (1C), um eine aktualisierte Super-Resolution-Bild (1E) zu erzeugen. </li><li> Drücken Sie die &#39;Ansicht Histogramme &quot;-Taste (Abbildung 1C), um die Bildqualitätsmetriken (1F) * 15 anzuzeigen. </li></ol&gt; Anmerkung 15 - Die Grafik oben rechts, welches die Anzahl der angenommenen Lokalisierungen gegen Kamerarahmennummer und der Thompson-Lokalisierung Precisions Histogramm in der rechten unteren Ecke (1F) kann verwendet werden, um die Option Lokalisierungsgenauigkeit Cutoff-Rezension zu informieren. Zum Beispiel würde unter Verwendung einer 50 nm-Sperr alle Lokalisationen mit schlechter Genauigkeit von in dem endgültigen Bild Superauflösungs aufnehmen lässt. <ol start="11"><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Bild speichern&quot; in der Gutachter (1C), um alle diese Daten * 16 speichern. </li></ol> Anmerkung 16 - Zwischen 3 und 5-Dateien können je nach den gewählten (Bild Summe, STORMdataImage, STORMprocessed, Infos &amp; hists) Optionen gespeichert werden, siehe Abb. 1G. Die STORM verarbeitete Bild mit modifizierten Kontrast und Farbkarten angezeigt. Die STORMdataImage ist ein Graustufenbild, bei dem der Grauwert jedes Pixels entspricht der tauber von Lokalisierungen, die in ihm identifiziert wurden. <ol start="12"><li> Nach Prüfung der Daten (zB Info.txt Datei und Histogramme) Rückkehr zum Schritt 7.6 und wiederholen Sie die nachfolgenden Schritte mit verschiedenen Rezensent Parameter, falls gewünscht. Mit &#39;Save Image &quot;in Schritt 7.11 werden die zuvor gespeicherten Daten überschreiben. </li></ol> 8. Box-Tracking-und Drift-Korrektur (mit Regensturm) <ol><li> Folgen Sie den Schritten von 7,1 bis 7,9, um ein Bild in der üblichen Weise zu erzeugen. </li><li> Drücken Sie die Taste &#39;Box-Tracking&#39; in der Rezensent (1C), und klicken und ziehen Sie eine Box auf das Bezugsmarken oder die Struktur der Zinsen auf das Bild überprüft. </li><li> Warten Sie, bis ein neues Bild erscheint, die die &quot;Boxed Positionen&quot; (siehe 6B, 6C und 6F für Beispiele) angezeigt wird. Speichern Sie dieses Bild, wenn gewünscht. </li><li> Wenn das Objekt von Interesse ist ein Referenz-Markers dann Driftkorrektur kann durch Anklicken des &#39;Set Anchor &quot;-Taste gefolgt von der&quot; Sub durchgeführt werdenTrakt Drift &quot;-Taste. Schließlich klicken Sie auf &quot;Run Rezensent &#39;wieder eine neue STORM Bild, das jetzt werden alle Lokalisierungen nach den Bezugsmarken Positionen korrigiert generieren. Die Wulst Positionen werden von der endgültigen Bewertung Bild gelöscht. </li><li> Wenn es andere Bezugsmarkierungen im endgültigen Bild Drift korrigiert, können diese durch Drücken von &quot;Box-Tracking &#39;entfernt werden,&#39; Löschen Boxed &#39;und dann so oft&#39; Run-Bewerter&quot;, wie gewünscht. </li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir zeigen, mit einigen einfachen Testproben und der frei verfügbaren Software-Verarbeitung Rainstorm ist es möglich, STORM Super-Resolution Imaging optimieren. Diese Werkzeuge und Methoden wird nützliche Startpunkte für neue Benutzer und Möglichkeiten für erfahrene Benutzer das Vertrauen in ihre Mikroskope und ihre Verwendung von ihnen für die biologische und zelluläre Strukturen mit bisher unerreichter Genauigkeit untersuchen zu erhöhen. Durch Verwendung einer Kombination von Proben mit bekannter oder gut verstanden Strukturen und einem Algorithmus, der eine Anzahl von nützlichen Bildqualitätsmetriken, wie Mittelwert Präzisionsschätzungen Lokalisierungsnummer und Histogramme, ist es möglich, die Bildqualität zu verbessern und mehr Vertrauen haben, erzeugen kann, in der bildgebenden Verfahren STORM. Es gibt keine one-size fits all Ansatz zur Erfassung der Daten, da es eine Reihe von verschiedenen kommerziellen und selbst gebauten Mikroskop-Konfigurationen, die verwendet werden können. Darüber hinaus gibt es viele Probenvorbereitung und Bildaufnahmeschritte, die beeinflussen könnenReferenz das endgültige Bild daher mit Software-Tools und Testmuster ist entscheidend für das Verständnis und die Optimierung STORM Bildqualität. Darüber hinaus können diese Protokolle nützliche und weniger zweideutig Möglichkeiten der Fehlerbehebung von Problemen, die auftreten können. Beispielsweise das Dextran Probe ist ein sehr nützlicher Weg, um zu ermitteln, ob es eine Fehljustierungen oder ungleichmäßige Beleuchtung der Probe. Wenn es Bedenken, dass die Schaltpuffer kann nicht arbeiten eine sehr einfache Sichtprüfung, um zu sehen, ob es eine &quot;blinkende &#39;wird Ihnen helfen. Aktinfilamente sind eine nützliche Methode zur Messung der Auflösung mit FWHM Vergleiche sowie Hervorhebung Drift und Fehllokalisation Artefakte. Es sollte jedoch angemerkt, daß als Lokalisierung basierte Superauflösungsverfahren können Fluorophor Dichte empfindlich sein, ungeachtet der anderen Faktoren, wie Belichtungszeit, Bildrate, Laserleistung und der Art und Weise wird das Bild verarbeitet werden, ist es unmöglich, zuweisen Der Beschluss, eineninsbesondere Mikroskop und davon ausgehen, dass alle Bilder wird diese Auflösung haben. Was ist möglich, jedoch ist es, verschiedene Aspekte der Auflösung wie Mittelwert Lokalisierungsgenauigkeiten, Lokalisierung Zahl messen und Drift-27. Auch wenn Bezugsmarkierungen können nicht in jedem Versuch sie können eingearbeitet werden, zumindest, verwendet, um ein Mikroskop-System, seine Umwelt besser zu verstehen, zu charakterisieren und operativen Überlegungen wie, wie viel Zeit erforderlich ist, um das thermische Gleichgewicht erreicht nach dem Start werden. Sowie Korrektur von lateralen Drift können Bezugsmarkierungen verwendet werden, zu charakterisieren und zu korrigieren Axialdrift, obwohl dies erfordert die Verwendung einer astigmatischen Linse und einen Rückkopplungsmechanismus, um die Probenposition zu korrigieren, während die Bilder erworben 43. Handels Super-Resolution-Systeme gehören in der Regel eine Art von Stabilitätskontrolle oder Fokus-Lock-Mechanismus, der eine praktische Lösung für die Korrektur Fokusdrift sein können. Es gibt eineWieder Alternativen zu unspezifisch Beschichten des Glases mit Dextran, wie die Verwendung von Farbstoffen, die direkt oder anderen konjugierten Moleküle, wie Sekundärantikörper. Eine Einschränkung dieser Ansätze ist, dass die Anzahl der Moleküle an der Glas gebunden ist nicht bekannt. Alternative filamentöse Strukturen, die verwendet wurden, schließen Mikrotubuli 28 und 21 DNA. Die Kombination von sehr geringer Größe und bequem im Handel erhältlichen Reagenzien machen jedoch Aktin eine attraktive Alternative, insbesondere der Abstand des divergierenden oder verzweigte Filamente können auch eine nützliche Messung der Systemleistung 27 sein. Es gibt Raum für die weitere Entwicklung von Testproben, trotz der jüngsten Fortschritte in diesem Bereich 28,29,46,47. Insbesondere stellt Multi-Color-Imaging eine Reihe von Herausforderungen in allen drei Hauptaspekte der Bildgebung, Probenkennzeichnung, Bildaufnahme (Hardware) und Software (Bildverarbeitung und Ausrichtung). Es gibt ein seiteine Reihe von Publikationen die Lösung dieser Fragen 4-6 und es ist daher klar, dass geeignete Testproben und Methoden kritisch zu erzeugen und zuverlässig Interpretation dieser Bildtypen. In der Tat, vor kurzem wurde gezeigt, dass dSTORM könnte verwendet werden, um zwei Farbbilder zu nehmen, und zu beheben, die hochsymmetrische Natur der Kernporenkomplex und die Autoren vermuten, dass dies eine ideale Möglichkeit, um die Leistung der chromatischen Aberration 45 Korrekturen zu beurteilen. Ein weiterer interessanter Ansatz ist die Verwendung von DNA-Origami, ein nanoruler, die die Möglichkeit der Positionierung Fluorophore zu bestimmten Unter-Beugungs Abständen 46 schafft erstellen. Dies bietet eine Möglichkeit zur Beurteilung Auflösung und macht Abstandsmessungen. Jedoch ist das letztendliche Ziel, diese Superauflösungstechniken, um nicht-idealisierten Proben, wie Zellen, die komplexe dreidimensionale Strukturen anzuwenden. In diesem Fall wird eine Kombination aus gründlicheres Verständnis ter Technik kombiniert mit Software-Tools, die den Anwender bei der Erfassung von Daten, die Verarbeitung in geeigneter Weise, und Bereitstellung von Bild Metriken helfen, ist wahrscheinlich die letzte Antwort sein. 28,29,47,48

Vor kurzem wurde ein Bereich der optischen Mikroskopie Techniken entwickelt worden, die typischerweise als Super-Resolution-Mikroskopie oder Nanoskopie, die die Beugungsgrenze zu umgehen und erzeugen Bilder mit einer Auflösung von 100 nm oder besser 1,2 können bezeichnet. Seit der Ankündigung von Super-Resolution-Mikroskopie als die Nature Methods Verfahren des Jahres 2008 gab es eine große Entwicklung von Lokalisierungs-basierten Mikroskopen. Zum Beispiel gibt es Mehrfarbanwendungen 3-6, 7-12 3D-Implementierungen und Anwendungen auch mit lebenden Zellen 5,13-17. Darüber hinaus, da diese Systeme werden in die Hände von Zellbiologen kommerzialisiert und werden nun ihren Weg aus der Optik Laboratorien gibt es wahrscheinlich eine weitere Erhöhung ihrer Verwendung und Anwendung der biomedizinischen Fragen. Ein Zweig dieser Familie ist die Lokalisierungsbasierte Methoden, die durch den Aufbau eines Bildes Molekül-für-Molekül zu arbeiten. Ichn Um dies zu tun, muss der Großteil der Fluoreszenzmoleküle in der Probe aus, so dass nur wenige räumlich getrennten Moleküle zu einem Zeitpunkt aktiv geschaltet sein. Diese Moleküle werden dann schnell ein-und ausgeschaltet, und viele Bilder aufgenommen werden, so dass ein beträchtlicher Teil der Bevölkerung ist abgebildet, um die darunterliegende Struktur mit Unter-Beugungs Präzision wiedergeben. Eine Reihe von Ansätzen veröffentlicht einschließlich GSDIM 18, 19 PALM, FPALM 20, 21 und STORM RESOLFT 22. Algorithmen, die die Position eines Einzelmoleküldetektion messen kann dann verwendet werden, um die tatsächliche Position des Moleküls mit Genauigkeiten besser als 20 nm unter Verwendung von Gauß-Fitting 23 zu lokalisieren, beispielsweise rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 und palm3d Regensturm 27. Bei der Abbildung Zelle oder anderen biologischen Proben, die eine hohe Moleküldichte haben, ist es daher erforderlich, viele Tausende von Rahmen zu nehmendiese blinkt, räumlich getrennten, Signals, um Bild ein erheblicher Anteil der markierten Moleküle. Stochastische optischen Rekonstruktion Mikroskopie (STORM) und der eng verwandten dSTORM und GSDIM Methoden-basierte Lokalisierungs Super-Resolution-Methoden, die gezeigt wurde, dass mit handelsüblichen organischen Farbstoffen 21 zu arbeiten. Sie haben sich seit gezeigt wurde für eine Reihe von verschiedenen Farbstoffen 28-30, die die Methodik insbesondere wegen der Spezifität und der relativen Bequemlichkeit der etablierten Immunmarkierung Ansätze zur Fluoreszenzmikroskopie durch attraktiv zu sein. Folglich gibt es einen einfachen Zugang zu einer Reihe von Farbstoff-Antikörper-und Farbstoff-Biomolekül-Konjugate, die das Potenzial in der Lokalisierung Basis-Superauflösende Bildgebung verwendet werden müssen. Während die allgemeinen Grundsätze des STORM und ähnliche Ansätze sind relativ einfach, und auf den ersten Blick die Hardware und die Probenvorbereitung scheinen relativ straightforward, gibt es eine Reihe von Schritten in dem Prozess, der entscheidend für die Erreichung hoher Qualität, artefaktfrei, Super-Resolution-Bilder sind. Wie bei allen Mikroskopie-Techniken kann der Prozess des in 3 Hauptschritte betrachtet werden: erstens, Probenvorbereitung, zweite Bildaufnahme und, drittens, die Bildverarbeitung und / oder Bildanalyse und Interpretation. Die zusätzliche Auflösungsvermögen und Verfahren zur Erzeugung von Super-Resolution-Bildern mit einem Lokalisierungs-Ansatz führt einige neue Probleme und Überlegungen 31-33. Beginnend mit der Probenvorbereitung bei der Durchführung der Immunmarkierung, insbesondere indirekte Immunfluoreszenz, wo eine primäre und sekundäre Antikörperkombination verwendet wird, ist anzumerken, dass der fluoreszierende Farbstoff kann bis zu 20 nm von dem Molekül von Interesse sein werden. Im Fall von Mikrotubuli, führt dies zu Durchmessern von 35-50 nm im Vergleich mit einer erwarteten Mikrotubuli-Durchmesser von 25 nm 28,30. Auch sollte die Markierungsdichte meet die Nyquist-Kriterien, um eine hohe Bildqualität 14 zu erzeugen. Zum Beispiel für eine erwartete Bildauflösung von 20 nm entlang einer filamentösen Struktur sollte ein Farbstoffmolekül mindestens alle 10 nm 27 sein. Während viele Farbstoffe sind veröffentlicht worden, um für die Lokalisierung Basis nähert sich die Gesamtleistung des Farbstoffs ist eine Mischung aus mindestens vier wichtige Kriterien, nämlich detektierten Photonen pro Schaltereignis (die Helligkeit jedes Blinzeln - heller ist besser) arbeiten, das Gleichgewicht auf -off-Arbeitszyklus (das Kontrastverhältnis von Farbstoffen in der Aus-Zustand gegenüber - mehr ist im Allgemeinen besser ab), die Überlebensfraktion (eine geringe Bleichrate ist besser) und die Anzahl der Schaltzyklen (die Anzahl der Blinkzeichen pro Fluorophor - mehr ist besser für hohe Auflösung, obwohl ein Aufblinken pro Fluorophor kann ein Vorteil für die Molekül-Zwecke Zählen sein). Die Situation wird weiter durch die Tatsache, dass diese Eigenschaften für einen bestimmten Farbstoff kann in verschiedenen Pufferbedingungen variieren und kompliziertLaserleistung mit 28,29. Zudem sowie diese einzigartige STORM Erwägungen kann die Bildqualität durch die Optimierung der Probenvorbereitung in der gleichen Weise wie traditionelle Fluoreszenzmikroskopie-Techniken beispielsweise durch Minimierung von Eigenfluoreszenz durch Modifikation Fixierungsbedingungen und die Verwendung von Reagenzien Abschrecken verbessert werden. Auch ist die Minimierung nicht-spezifisch gebundenen Fluorophore wichtig, welche durch Einstellen Etikett Konzentrationen, Inkubationszeiten und Blockieren und Waschschritte durchgeführt werden können. Der zweite Schritt der Bildaufnahme ist ebenfalls kritisch. Die optimalen Einstellungen des Mikroskops wird auf die Farbstoff, Pufferbedingungen Markierungsdichte und Probentyp, z. B. Monoschichten auf Glas, Zellen oder Gewebeproben ab. Die wichtigsten Überlegungen sind Kamera Belichtungszeit, Bildnummer, Beleuchtungswinkel (TIRF, Hilo, Epi) und Laserleistung. Das Ziel ist, so viele helle räumlich getrennten blinkt so schnell wie möglich zu sammeln. Wenn der Hintergrund is sehr hoch ist oder die blinkt nicht sehr hell, mit anderen Worten, das Signal-zu-Rauschverhältnis schlecht ist, wobei der Rekonstruktionsalgorithmus nicht in der Lage, die Positionen so genau zu lokalisieren. Sowie die Maximierung der Lokalisierungsgenauigkeit, also die Genauigkeit, mit jedem Molekül Position gemessen werden kann, hängt die Bildqualität auch bei einer hohen Anzahl von Lokalisierungen. Wenn eine unzureichende Anzahl der Moleküle von Interesse sind abgebildet, entweder aufgrund der schlechten Markierungseffizienz, übermäßiges Ausbleichen oder eine unzureichende Bildnummer, dann das resultierende Bild Super-Resolution wird punktiert und diskontinuierlich sein als Nyquist-Kriterien nicht eingehalten, 14,27 . Und schließlich ist der dritte Schritt, Bildverarbeitung, besonders wichtig im Vergleich mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken. Es gibt eine Reihe von frei im Handel erhältlich und Algorithmen, die sowohl ein Vorteil, in Bezug auf Auswahl, und ein Nachteil ist, dass es verwirrend sein kann zu wissen, welche am besten geeignet ist, um zu verwenden. Wenn zum Beispiel die Rohdaten gut verteilte räumlich getrennte blinkt dann eine Einzelmolekül-Anpassungsalgorithmus sehr genau und effizient zu sein, beispielsweise durch die spärlich Anpassungsalgorithmen im Regensturm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 und 26 QuickPALM Software . Wenn die Rohdaten enthält eine Menge von überlappenden Signalen dann Algorithmen, die besser geeignet sein können, umfassen DAOSTORM 34, 35 und 3B deconSTORM 36. Darüber hinaus sind diese Algorithmen enthalten Schwellenwerte für verschiedene Kriterien wie Signal zählt, oder Photonen pro Blinken, sowie verschiedene Bilddarstellungsmöglichkeiten wie die Visualisierung mit geglätteter Gauß-Funktionen oder als Histogramme mit Pixelraster, wo der Super-Auflösungspixelgröße kann durch den Benutzer ausgewählt. Alle diese Optionen ändern das Aussehen des fertigen Bildes und haben Auswirkungen auf die Bildinterpretation und-analyse. <p class="jove_content"&gt; Daher präsentieren wir 3 Testproben, die den neuen Benutzer mit einem Ausgangspunkt für Dye-Lokalisierung Basis Super-Resolution-Experimente, die aus Gründen der Klarheit werden wir so STORM zu beziehen und erfahrene Anwender die Möglichkeit bieten wird, um weiter zu optimieren, ihre Experimente. Erstens ist es möglich, die Oberfläche des Glases mit einer fluoreszierenden Schicht von Dextran-Farbstoff-Konjugat. Dies bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, um festzustellen, dass das Mikroskop-, Farbstoff-und Puffer arbeiten daran, blinkt Fluoreszenzsignal erzeugen. Das Verfahren kann dann durch den Vergleich mittlere Lokalisierungsgenauigkeit und Anzahl von Regensturm Metriken erzeugt werden, um Pufferbedingungen zu optimieren, Bildaufnahme-Einstellungen und testen verschiedene Farbstoffe erweitert werden. Zweitens stellen wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von Aktin-Filamenten auf Glas, das leicht mit Phalloidin-Farbstoff-Konjugaten markiert werden können. Diese bieten ideale Strukturen, um Messungen der Auflösung in der Regel 27 und der Halbwertsbreite (FWHM) nehmender ein Faden wird als eine empirische Abschätzung der Resolution 37 gegeben. Es ist zu beachten, dass die Auflösung variiert zwischen den Proben und zwischen den Bildern innerhalb der gleichen Probe, weil Auflösung in der Lokalisierung Basis Super-Resolution-Mikroskopie ist eine Funktion der Fluorophor Helligkeit, Hintergrundgeräusche und Lokalisierung Dichte 27 und das sind nicht unbedingt konstant über der Probe werden. Aktin-Filamente werden verwendet, um mögliche Artefakte wie mislocalizations demonstrieren und treiben und wie sie mit Software-Funktionen innerhalb von Rainstorm identifiziert werden. Außerdem beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Bezugsmarkierungen sowohl richtige Maß und Drift. Und drittens die Färbung der Zellen mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Farbstoff-Konjugate beschrieben. EGF ein nützlicher Indikator für die superauflösenden Bildern, weil ein Teil des Rezeptors auf der Zelloberfläche eine Endocytose durchläuft über Vesikel, die Unter-Beugungsstrukturen Größe von etwa 50-150 nm Durchmesser 27,38,39.

<table><tbody><tr><td>Labtek Imaging Chamberglass</td><td>Fisher</td><td>CBR-166-390E</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop </td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>* Alternativen siehe unten</td></tr><tr><td>100 X TIRF Objektiv</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF*</td> <td>Alternativen siehe unten</td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>* Alternativen siehe unten</td></tr><tr><td>640 nm Laser</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW - für die Bildgebung von Alexa 647 oder Cy5 Farbstoffen</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>*Erfassungssoftware (Steuerung der Hardware)</td></tr><tr><td>PC </td><td>Dell</td><td></td><td>Windows XP (64 Bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Gerätesteuerung und Bildverarbeitung</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Bildanalyse und -verarbeitung <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>rainSTORM</td><td>Laser Analytics Group (Cambridge) Software</td><td></td><td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Running rainSTORM</td><td></td><td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td></tr><tr><td>*Beispiel für selbstgebaute STORM/PALM-Mikroskope</td><td></td><td></td><td>Siehe auch Referenz 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</ a</td></tr><tr><td>>*Kommerzielle STORM/PALM Super-Resolution-Mikroskope</td><td></td><td></td><td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternativen zu selbstgebauten Mikroskopen</td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 1. Materialien & Ausrüstung </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1; 2; 3; 4</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1; 2.1</td></tr><tr><td>Dextran-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>Allgemeiner Aktinpuffer</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Preformierte Aktinfilamente</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Phallodin-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>TetraSpeck Mikrosphären (0,1 μm)</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>VX10500064</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pen/Step</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Kunststoffschalen</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>Formaldehyd - 10 % Lösung EM grade</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>Sigma</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G2289</td><td>5.1; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 2. Reagenzien</td></tr></tbody></table>

testproben zur optimierung storm super resolution mikroskopie

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM ist eine neu entwickelte Super-Resolution-Mikroskopie-Technik mit bis zu 10-mal höhere Auflösung als Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken. Jedoch, wie das Bild in eine ganz andere Weise als normal erworben, durch den Aufbau eines Bildes Molekül-für-Molekül, gibt es einige bedeutende Herausforderungen für die Nutzer in die versuchen, ihre Bildaufnahme zu optimieren. Um diesen Prozess zu unterstützen und gewinnen mehr Einblick, wie STORM arbeitet präsentieren wir die Herstellung von 3 Testproben und die Methodik der Erfassung und Verarbeitung von STORM Super-Resolution-Bilder mit typischen Auflösungen von 30-50 nm auf. Durch die Kombination der Testproben mit der Verwendung der frei verfügbaren Rainstorm Verarbeitungssoftware ist es möglich, eine große Menge an Informationen über Bildqualität und Auflösung zu erhalten. Mit Hilfe dieser Messdaten ist es dann möglich, die Bildgebungsverfahren von der Optik zu optimieren, die Vorbereitung, Farbstoff Wahl, Pufferbedingungen, und Bildaufnahme-Einstellungen probieren. Wir sind einelso zeigen Beispiele für einige häufige Probleme, die zu einer schlechten Bildqualität führen, wie laterale Drift, wo die Probe bewegt sich während der Bildaufnahme und Dichte bezogene Probleme, die in der &quot;Fehllokalisation&quot; Phänomen.

Wir beschreiben die Herstellung von drei Prüfmustern und wie sie verwendet werden, um beurteilen zu optimieren und die Leistung der STORM-Mikroskope. Mit diesen Beispielen zeigen wir, wie Roh-Daten zu erfassen und verarbeiten sie zu Super-Resolution-Bilder in Zellen von ca. 30-50 nm Auflösung zu erwerben.

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie hochwertige STORM-Super-Resolution-Bilder erzielt werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst eine fluoreszenzmarkierte Testprobe hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen Wechselpuffer vorzubereiten und anschließend die Bildgebungskammer mit diesem Puffer zu füllen.Als Nächstes werden die Rohdaten an einem Storm-Mikroskop gewonnen. Der letzte Schritt besteht darin, Super-Auflösungs-Bilder aus den Rohdaten mithilfe der Rainstorm-Verarbeitungssoftware zu rekonstruieren. Abschließend dienen die Testproben dazu, zu veranschaulichen, wie hochwertige Rohdaten erfasst werden können, die anschließend verarbeitet werden, um STORM-Super-Auflösungsbilder von Zellen mit einer Auflösung zwischen 30 und 50 Nanometern zu erzeugen, was eine fünf- bis zehnfache Verbesserung der Auflösung gegenüber herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie-Methoden wie TURF und konfokaler Mikroskopie darstellt.Im Allgemeinen haben Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie die Bedeutung der Sammlung zahlreicher hochwertiger, sparsam verteilter Verknüpfungen nicht erkennen. Dies wird durch die Verwendung des Alexa-647-Farbstoffs im geeigneten Schaltpuffer erheblich erleichtert. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist unerlässlich, da die Gewinnung hochwertiger Rohdaten entscheidend für die Erzeugung von SPR-Auflösungsbildern ist.Die rohen Videosequenzen dieser Technik sehen völlig anders aus als jede andere Form der Fluoreszenzmikroskopie. Beginnen Sie das Verfahren zur Beschichtung von Glas mit fluoreszierendem Dextrin, indem Sie 200 Mikroliter einer 0,01-%-Polylysin-Lösung in jede Vertiefung einer achtfachen Kammer-Deckglasplatte geben und 10 Minuten lang inkubieren. Nach 10 Minuten entfernen Sie die Polylysin-Lösung mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit zurückbleibt.0,25 µL einer Stammlösung von zwei Milligramm pro Milliliter Dextrin-Alexa 647 in 25 µL entionisiertem Wasser, um eine 20-Mikrogramm-pro-Milliliter-Lösung herzustellen, um eine dichte Beschichtung mit Dextrin-Alexa 647-Lösung zu erzeugen.Verdünnen Sie 20 Mikroliter der 20 Mikrogramm pro Milliliter-Lösung auf insgesamt 200 Mikroliter entionisiertes Wasser. Für eine mittlere Dichte verdünnen Sie zwei Mikroliter in 200 Mikroliter entionisiertes Wasser. Für eine verdünnte Lösung verdünnen Sie 0,2 Mikroliter.In 200 Mikroliter entionisiertem Wasser 200 Mikroliter der verdünnten Dextrin Alexis X 47-Lösungen in jede Vertiefung geben und 10 Minuten inkubieren. Längere Inkubationszeiten können verwendet werden, was zu einer dichteren Dextrin-Beschichtung führen kann. Abschließend Dexter Xis X 47-Lösungen entfernen und dreimal mit Wasser waschen.Um fluoreszierende Aktinfilamente auf Glas vorzubereiten, geben Sie zunächst 200 Mikroliter einer 0,01 %igen Polylysin-Lösung in jedes der Vertiefungen einer Acht-Kammer-Deckglasplatte. Inkubieren Sie 10 Minuten lang. Entfernen Sie die Flüssigkeit anschließend mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit zurückbleibt.Fügen Sie jedem Kammer 90 µL allgemeines Aktin-Puffer hinzu, das zuvor gemäß den Herstelleranweisungen rekonstituiert wurde. Fügen Sie dann 10 µL einer 10 µM vorgebildeten Aktin-Filamentlösung und ein µL Foid und Alexa 647 hinzu, pipettieren Sie vorsichtig mehrmals auf und ab, um die Probe zu mischen, und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, um mikrosphärische fluoreszierende Kügelchen als fiduziale Marker vorzubereiten. Verdünnen Sie ein µL Tepec-Kügelchen in 200 µL PBS und mischen Sie. Geben Sie die verdünnten Kügelchen in die Abbildungskammer und warten Sie 15 Minuten.Nach 15 Minuten die Lösung entfernen und vor der Bildgebung dreimal mit PBS waschen. Für dieses Experiment werden Zellen verwendet, die bis zu etwa 80 % Konfluenz kultiviert wurden. Das Kulturmedium entfernen und mit PBS waschen. Anschließend 500 Mikroliter einer 4 %igen Formaldehydlösung für 10 Minuten hinzufügen.Entfernen Sie die Formaldehydlösung und waschen Sie dreimal mit PBS. Lassen Sie die Zellen nicht austrocknen und verwenden Sie stets mit PBS gepufferte Lösungen. Um hypotonischen Stress zu vermeiden, geben Sie zwei Mikroliter einer 50 Mikrogramm pro Milliliter Stammlösung von EGF Alexa 647 zu 200 Mikrolitern einer 0,1-%-BSA-Lösung und geben Sie diese Lösung anschließend zu den Hela-Zellen.Ansatz 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung entfernen und dreimal mit PBS waschen. Eine Blockierungslösung mit 0,1 % BSA hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur belassen.Entfernen Sie danach die Blockierungslösung und waschen Sie das Präparat anschließend dreimal mit PBS, bevor Sie die Bildaufnahme durchführen. Unmittelbar vor der Bildaufnahme stellen Sie den Schalt-Puffer her, indem Sie die Enzym-Glucose- und Reduktionsmittel-Stammlösungen im Verhältnis von 50 Mikrolitern, 400 Mikrolitern und 100 Mikrolitern mischen und PBS hinzufügen, um das Endvolumen auf einen Milliliter aufzufüllen. Entfernen Sie das PBS aus der Bildgebungskammer und füllen Sie diese dann bis zum Rand mit dem Schalt-Puffer auf.Platzieren Sie vorsichtig ein Deckglas auf der Kammer, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keinerlei Blasen bilden und die gesamte Kammer bedeckt ist. Sollten Blasen sichtbar sein, füllen Sie zusätzliche Pufferlösung oder PBS nach. Andernfalls kann die Pufferleistung nachlassen.Die Sammlung hochwertiger, spärlicher Verknüpfungsdaten ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens. Stellen Sie daher sicher, dass die Mikroskope korrekt fokussiert sind und die richtigen Aufnahmeeinstellungen verwendet werden. Suchen Sie eine zu bildgebende fluoreszierende Struktur von Interesse. Wählen Sie den gewünschten Beleuchtungswinkel aus.In diesem Fall wird ein flacher Winkel oder ein stark geneigter Winkel empfohlen, da dies das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, indem Streulicht minimiert wird, was insbesondere für Zellproben von Vorteil ist. Erstellen Sie eine Referenz zur bruchweise begrenzten Abbildung der Struktur vor der STORM-Aufnahme. Erhöhen Sie den Anregungslaser auf eine hohe Leistung von etwa zwei Kilowatt pro Quadratzentimeter, während Sie mit Kameraeinstellungen von 10 Millisekunden Belichtungszeit und einer Zykluszeit von etwa 50 Hertz beziehungsweise Bildern pro Sekunde aufnehmen.Sobald die Flora-Viers in ein spärliches Blinkmuster übergegangen sind, sammeln Sie 10.000 Bilder. Öffnen Sie zur Initiierung dieser Rekonstruktion die RAINSTORM-M-Datei innerhalb von MATLAB und führen Sie sie im Rainstorm-Fenster aus.Wählen Sie die zu analysierende Bilddatei mithilfe der Schaltfläche „Durchsuchen“ aus. Es sollte sich um eine TIF-Datei handeln. Ändern Sie die Pixelbreite, um sie an die Rohdaten des Mikroskopsystems anzupassen, das zur Datenaufnahme verwendet wurde.Belassen Sie die anderen Werte auf Standard. Drücken Sie die Schaltfläche „Bilder verarbeiten“ und warten Sie, bis ein vorläufiges Bild erscheint. Die Dauer der Verarbeitung hängt von der Dateigröße, der Computerleistung und der Anzahl der Kandidatenlinks in den Rohdaten ab.Um ein aktualisiertes Super-Resolution-Bild zu erzeugen, drücken Sie die Schaltfläche „Reviewer öffnen“, woraufhin ein zweites Fenster erscheint. Drücken Sie die Schaltfläche „Kontrast anpassen“, um die Bildanzeige nach Wunsch zu verändern. In einigen Fällen, in denen das Bild sehr dunkel ist, sollte der Maximalwert verringert werden.Verwenden Sie das Überprüfungsfenster, um nützliche Metriken zur Bildqualität zu erzeugen und das Super-Resolution-Bild weiter zu verfeinern. Belassen Sie die ersten drei Parameter der Qualitätskontrolle bei den Standardwerten von 5.000, 0,1 und 0,8 bis 3,5. Aktualisieren Sie den Wert für die Anzahl der Zählungen pro Photon.Ändern Sie die Grenze der Lokalisierungsgenauigkeit, um einen Kompromiss zwischen der Optimierung der mittleren Lokalisierungsgenauigkeit und der Anzahl der Lokalisationen zu finden. Für das endgültige Bild werden Werte zwischen 30 und 50 Nanometern empfohlen, abhängig von der Qualität der Daten und der Probe. Der Standardwert für den Rekonstruktionsskalierungsfaktor beträgt fünf, wodurch Super-Resolution-Pixel von 32 Nanometern erzeugt werden, unter der Annahme, dass das Pixel in den ursprünglichen Bildern 160 Nanometer beträgt.Wenn die Rohbilder eine Pixelgröße von 100 Nanometern aufweisen, erzeugt dies Überauflösungsbilder mit Pixeln von 20 Nanometern. Erhöhen Sie den Skalierungsfaktor, um kleinere Pixel in der Überauflösung zu erzeugen. Drücken Sie im endgültigen Bild die Schaltfläche „Reviewer ausführen“, um ein aktualisiertes Überauflösungsbild zu generieren.Drücken Sie die Schaltfläche „Histogramme anzeigen“, um Bildqualitätsmetriken anzuzeigen. Zuletzt drücken Sie die Schaltfläche „Bild speichern“ im Betrachter, um alle diese Daten zu speichern. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie ein Bild auf die gleiche Weise wie zuvor gezeigt erzeugen.Drücken Sie die Box-Tracking-Schaltfläche im Rezensenten und klicken Sie, während Sie ein Rechteck über die Referenzmarkierung im überprüften Bild ziehen. Warten Sie, bis ein neues Bild erscheint, das die markierten Positionen anzeigt. Speichern Sie dieses Bild, falls gewünscht, insbesondere dann, wenn das Objekt von Interesse eine Referenzmarkierung ist.Wie hier der Fall, führen Sie eine Driftkorrektur durch, indem Sie auf die Schaltfläche „Anker festlegen“ und anschließend auf die Schaltfläche „Drift subtrahieren“ klicken. Klicken Sie abschließend erneut auf „Reviewer ausführen“, um ein neues STORM-Bild zu generieren. Eine erfolgreiche Beschichtung mit Dextrin sollte eine fluoreszierende Monoschicht ergeben, und typische Dextrin-Daten sind in dieser Abbildung dargestellt.Die beugungsbegrenzten Aufnahmen zeigen unterschiedliche Konzentrationen von Dextrin vor der Storm-Aufnahme. Die superauflösenden Rekonstruktionen weisen eine Pixelgröße von 25 Nanometern auf. Es wurden 10.000 Bilder mit einer Bildgröße von 128 × 128 Pixeln aufgenommen, und einzelne Bilder dieser Sequenz werden hier dargestellt.Bei hoher Dextrinkonzentration. Der fluoreszierende Monolage sollte relativ homogen erscheinen, wie in diesen Bildern und diesem Videoabschnitt veranschaulicht. Bei niedrigeren Konzentrationen erscheinen die Blinkpunkte seltener und fokussierter.Da während dieser Bildakquisitionsphase bei konstanter Laserbeleuchtung keine offensichtliche Hintergrundfluoreszenz vorhanden ist, nimmt die Anzahl der Blinkereignisse im Laufe der Zeit ab, wie ein Vergleich zwischen Frame 2000 und Frame 8.000 in der hochkonzentrierten Probe veranschaulicht. Der Hauptunterschied zwischen den Super-Resolution-Bildern der hohen, mittleren und niedrigen Dextrinkonzentrationen ist die abnehmende Zahl der Lokalisierungen. Dieses Diagramm zeigt den Durchschnitt von drei Sequenzen mit jeweils 10.000 Frames für jede Dextrinkonzentration, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung angeben.Jedoch ist diese proportionale Beziehung zwischen der Konzentration der fluoreszierenden Moleküle, der Anzahl der Blinks in den Rohdaten und der Anzahl der Lokalisationen nicht einfach linear, wie in dieser Darstellung der Anzahl akzeptierter Lokalisationen pro Bild gezeigt. Bei Verwendung eines gleitenden Mittelwerts über 100 Bilder ist die Software bei sehr hohen Moleküldichten nicht in der Lage, Moleküle erfolgreich zu lokalisieren, unabhängig von der Probe. Ein häufiges Problem kann das Vorhandensein eines hellen, aber unscharfen fluoreszierenden Schleiers über das gesamte Bild sein, der durch Fluorophore verursacht wird, die durch das Medium diffundieren.Diese abgelösten fluoreszierenden Moleküle können verhindert oder entfernt werden, indem die Anzahl der Waschschritte mit PBS vor dem Hinzufügen des Umschalt-Puffers erhöht wird, oder indem frischer Umschalt-Puffer der Kammer zugegeben wird. Die Verarbeitung und der Vergleich der Daten aus jeder Bildsequenz führen zu sehr unterschiedlichen Super-Auflösungs-Bildern. Die Panel C und D zeigen Konstruktionen von Super-Auflösungs-Aufnahmen, die den in den Panel A und B gesammelten Daten entsprechen. Dieses Diagramm zeigt die Anzahl der akzeptierten Lokalisationen pro Einzelbild, berechnet als gleitender Durchschnitt über 100 Einzelbilder.Die rote Linie entspricht der Sturmsequenz A und C mit hohem Hintergrund, die blaue Linie entspricht B und D mit niedrigem Hintergrund. Die akzeptierte Lokalisierungszahl für die Bilder, die den Daten mit hohem bzw. niedrigem Hintergrund entsprechen, ist im zweiten Diagramm dargestellt. Diese drei diffraktionsbegrenzten Bilder zeigen typische Daten von vorformierten Aktinfilamenten, die vor der Zugabe des Schaltbuffers und der STORM-Aufnahme an der Glasoberfläche haften.Es sind Filamente mit variablen Längen zu erkennen. Sehr helle Filamente sind oft mehrere miteinander verstrickte Filamente. Die Auswahl einzelner, relativ heller Filamente anstelle verstrickter Bereiche führt in der Erfassungsphase zu Bildern besserer Qualität.Helle, scharf fokussierte Aufblitze sollten entlang der gesamten Länge des Filaments sichtbar sein. Während der Erfassungsphase sollten nur vereinzelte Aufblitze zu sehen sein, und anschließend im verarbeiteten Datensatz. Es sollte ein dünner, durchgehender Faden sichtbar sein; die Lokalisationen pro Bild zeigen dabei einen allmählichen Rückgang.Typischerweise wird die volle Breite bei halber Höhe (FWHM) eines Filaments als empirische Schätzung der Auflösung angegeben, indem eine Gerade durch einen vergrößerten Bereich des Aktinfilaments mithilfe der Plot-Profil-Funktion in ImageJ gezogen und anschließend eine Gauß-Anpassung durchgeführt wird. Die FWHM beträgt 43,2 Nanometer. Es kann ein Problem der Fehllokalisation auftreten, wenn mehrere Aktinfilamente verzweigen und/oder sich überschneiden, indem Teilmengen von Einzelbildern verarbeitet und die ersten und letzten 5.000 Einzelbilder verglichen werden.Ein anderes Bild wird im superauflösenden Bild unter Verwendung der ersten 5.000 Bilder erzeugt. Zahlreiche Lokalisationen sind in der Bildmitte zu erkennen. Wenn hingegen die letzten 5.000 Bilder verwendet werden, sind nur noch sehr wenige dieser Lokalisationen sichtbar, und lediglich die Filamente verbleiben, wenn auch aufgrund der geringen Anzahl an Lokalisationen im Bild teilweise als zusammenhängende Strukturen. Wenn eine zu hohe Blinkdichte vermutet wird, kann ein Vergleich der Bilder mit den Lokalisierungen pro Einzelbild stark darauf hindeuten, dass dieses Problem während des ersten Bildserienabschnitts auftritt. Die durchschnittliche Anzahl an Lokalisationen pro Einzelbild liegt hier mit über 10 deutlich über der des letzten Abschnitts, wo sie etwa vier beträgt. Ein weiteres potenzielles Problem in der STORM-Mikroskopie ist Drift, das auftritt, wenn sich die Probe in Bezug auf die Objektivlinse bewegt. Obwohl Drift während der Bildakquisition äußerst schwer zu erkennen ist, kann es in den Super-Auflösungs-Bildern bekannter Strukturen wie Aktinfilamenten nachträglich identifiziert werden.Das erste Anzeichen dafür, dass eine laterale Drift aufgetreten sein könnte, ist, dass die Struktur größer ist als erwartet. Zum Beispiel bei einer relativ großen Volllinienbreite bei halber Höhe im Vergleich zu den Präzisionsgrenzdaten von Regenstürmen, in diesem Fall 90 Nanometer im Vergleich zu 67 Nanometern. Eine bessere Möglichkeit, eine Drift zu erkennen, besteht darin, die Lokalisierungen als Funktion der Zeit zu vergleichen, also zu prüfen, ob die Lokalisierungen in späteren Einzelbildern im Vergleich zu denen in frühen Einzelbildern verschoben sind.Dies ist deutlich am Beispiel von Aktinfilamenten zu erkennen, wenn diese mit einer Farbcodierung dargestellt werden. Mithilfe der Box-Tracking-Funktion in Rainstorm, wie in den Paneln B und C gezeigt, werden Lokalisationen mit einer Farbe dargestellt, die der Bildnummer entspricht, zu der sie aufgenommen wurden. Zum Beispiel sind Lokalisationen aus frühen Phasen der Aufnahme blau, während Lokalisationen aus späteren Phasen der Aufnahme rot sind.Die verschobenen Farben weisen darauf hin, dass eine Drift aufgetreten ist, um diese zu messen und zu korrigieren. Zur Drift-Korrektur können fluoreszierende Perlen mit einem Durchmesser von 100 Nanometern als Referenzmarker verwendet werden. Die Zahlen eins bis vier zeigen einzeln beschnittene und vergrößerte Perlenbilder. In einem Beispiel, in dem während einer Aufnahmezeit von drei Minuten und 10 Sekunden eine relativ starke Drift von etwa 100 Nanometern auftritt, kann dieselbe Box-Tracking-Funktion verwendet werden, um die Drift farblich zu kodieren und zu bestätigen. Wie hier gezeigt, weisen alle vier Perlen nahezu identische Drift auf. In diesem Fall ist es möglich, eine der Perlen – hier Perle zwei – als Referenz auszuwählen und die Drift von den anderen Perlen zu subtrahieren.Ein Vergleich mit Panel E zeigt, dass die laterale Drift korrigiert wurde. Schließlich können epidermale Wachstumsfaktor-gefärbte HeLa-Zellen verwendet werden, um ein realistisches Beispiel der Bildauflösung zu geben. Bei den Zellen zeigt Panel A ein beugungsbegrenztes Bild eines Teils einer HeLa-Zelle, das auf die basale Zelloberfläche fokussiert ist, wobei die gelben Kästchen vergrößerte Bereiche von Interesse anzeigen, die in den Panels B und C im Gegensatz zu den unscharfen vergrößerten Bereichen von Interesse im beugungsbegrenzten Bild dargestellt sind. Die Super-Auflösungs-Bilder sollten ein Gemisch aus Haufen mit gelegentlich isolierten Einzelpixeln zeigen. Die Haufen haben einen Durchmesser von etwa 100 Nanometern und entsprechen vermutlich entstehenden Gruben und Vesikeln. Der Weg, über den EGF vorwiegend herunterreguliert und die Endozytose-Lokalisationen pro Bild aus Panel D in Diagramm G dargestellt werden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einfache Testproben herstellt, Daten aufnimmt und hochwertige STORM-Bilder mit hoher Auflösung rekonstruiert.Mithilfe dieser Methoden lassen sich einige häufige Probleme bei der Anpassung, wie z. B. Drift, vermeiden und Ihr STORM-Verfahren optimieren. Siehe Auflösungsexperimente.

test-samples-for-optimizing-storm-super-resolution-microscopy

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir zeigen eine Methode, um mehrere Moleküle innerhalb heterogener Nanostrukturen bei Einzelmolekülgenauigkeit unter Verwendung sequentieller Bindung und Elution von fluoreszenzmarkierten Antikörpern abzubilden.

Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur subzellulären Protein Lokalisierung auf Zebrafisch Netzhaut Ergebnisse korrelieren Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie Bilder scannen.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optimalen Versuchsbedingungen von Probenvorbereitung zur Bildaufnahme und zum Wiederaufbau zu geben, um 2D dual dSTORM Farbbilder von Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente in festen Zellen...

Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie

Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-Methode, um die Autofluoreszenz der Cyanobakterien zu reduzieren. Nach Immunofluoreszenz wird stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie verwendet, um dreidimensionale Höchstauflösung Bilder der Cyanobakterien FtsZ Ring zu erhalten.

Immunofluoreszenz ermöglicht Höchstauflösung Bildgebung des FtsZ Ring in Cyanobacterium Prochlorococcus

Die chipbasierte optische Superauflösungsmikroskopie ist ein neuartiger Ansatz in der Fluoreszenzmikroskopie und bietet Vorteile in Bezug auf Wirtschaftlichkeit und Durchsatz. Hier werden die Protokolle für die Chipvorbereitung und -bildgebung gezeigt für die TIRF-Mikroskopie und die lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie.

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Dieser Artikel bietet ein einfaches und klares Protokoll zur ortsspezifischen Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mittels genetischer Code-Expansion (GCE) und zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie...

Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion

Dieses Protokoll beschreibt die Single-Antibody-Markierung (SAL), um die nanoskalige räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu klären. Durch die Nutzung kumulativer Antikörper-Epitope-Interaktionen auf Einzelmolekülebene kartiert Membran-SAL (mSAL) lokale Epitope-Verteilungen und erfasst gleichzeitig das Antikörperbindungsverhalten in der nativen zellulären Umgebung.

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

Dieses Protokoll bietet einen effizienten Arbeitsablauf für die mikroskopische Mikroskopieabbildung isolierter Arabidopsis-Kerne durch optimierte Isolierung, Fixierung und Markierung, um eine zuverlässige nanoskalige Visualisierung von Chromatin und RNA-Polymerase II zu erreichen. Dieser Ansatz kann leicht an andere chromatinassoziierte Proteine oder Histonmodifikationen für hochauflösende Bildgebung angepasst werden.

Ein stromlinienförmiges Protokoll für Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie in Arabidopsis-Kernen

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Die Befestigung von Virionen an einer Oberfläche ist eine Voraussetzung für eine einzelne Virionen-Bildgebung durch Super-Resolution Fluoreszenz-Bildgebung oder Atomkraftmikroskopie (AFM). Hier zeigen wir ein Probenvorbereitungsverfahren zur kontrollierten Haftung von Virionen auf Glasoberflächen, die für den Einsatz in AFM und Super-Auflösungfluoreszenz-Bildgebung geeignet sind.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Lernen Sie die Präparation fluoreszenter Testproben für STORM-Mikroskopie mit Auflösungen von 30–50 nm. Diese Methode ermöglicht hochwertige Rohdatenerfassung und Bildrekonstruktion für zellbiologische Forschung.

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

Weitere Videos entdecken