Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

Willkommen im Labor von Dr.Newly John. Das John Lab ist spezialisiert auf die Entwicklung mikrofluidischer Plattformen für biologische Anwendungen. In diesem Video demonstrieren wir die Herstellung und Verwendung eines mikrofluidischen Geräts, das für die Kompartimentierung und Kultivierung von primären Neuronen entwickelt wurde.

Das Neuronengerät wurde erstmals im August 2005 in Nature Methods veröffentlicht. Seit seiner Einführung wird das Neuronengerät von Mitarbeitern auf der ganzen Welt in großem Umfang genutzt. Das Neuronengerät besteht aus einem Stück PDMS, das auf einen Siliziumwafer gegossen wurde, der ein SUA-Muster des Geräts enthält, das zuvor durch Photolithographie erstellt wurde.

Das Gerät verfügt über drei Hauptmerkmale, vier Reservoire mit einem Durchmesser von acht Millimetern, zwei Hauptkanäle mit einer Breite von jeweils 1,5 Millimetern, einer Länge von sieben Millimetern und einer Höhe von hundert Mikrometern sowie Mikrorillen, die 10 Mikrometer breit und drei Mikrometer hoch sind und die beiden Hauptkanäle verbinden. Die Länge der Mikrorillen kann von 150 Mikrometern bis 900 Mikrometern variieren, obwohl die Standardlänge 450 Mikrometer beträgt. Wenn wir das Gerät so beobachten, dass die Hauptkanäle und die Mikrorillen vertikal verlaufen, können wir sehen, dass die Reservoirs auf der linken Seite der Rillen über die Hauptkanäle verbunden sind, ebenso wie die Reservoirs auf der rechten Seite.

Diese Funktion ermöglicht den Durchfluss von Flüssigkeit durch den Hauptkanal, was ein wichtiges Merkmal ist, das das Laden von Zellen und den Medienwechsel ermöglicht. Das Neuronengerät hat drei große Vorteile gegenüber herkömmlichen Gewebekulturplattformen. Erstens ermöglicht es die Kompartimentierung von Zellkörpern oder Soma und den Axonen. Mit dem Neuronengerät ist es möglich, reine axonale Fraktionen zu erhalten.

Die Größe und Länge der Mikrorillen ermöglichen es, Axone durch den anderen Hauptkanal zu passieren und gleichzeitig ein Überkreuzen der Sägekörper zu verhindern. Zweitens ist es aufgrund des Designs des Geräts und der Ausnutzung des hydrostatischen Drucks möglich, entweder die Zellseite und/oder die Axonseite des Geräts getrennten Behandlungen zu unterziehen, indem einfach das Volumen und die Reservoire auf einer Seite des Geräts höher gehalten werden als auf der anderen. Und Nummer drei: Die reine axonale Fraktion des Geräts kann durch Vakuumsaugen geschnitten werden, was es dem Forscher ermöglicht, die axonale Regeneration zu untersuchen und zu beobachten.

Die Forscherin Hina Lee wird nun die Vorbereitung des mikrofluidischen Neuronengeräts demonstrieren. Ein Drei-Ang-Siliziumwafer mit einem durch Photolithographie hergestellten Muster aus SU acht wird verwendet, um die mikrofluidische Polydimethyl-Sloane-PDMS-Form zu gießen. Wir bezeichnen die Siliziumwafer mit SUA-Muster als Master-Shapes oder einfach Masters.

PDMS wird mit dem Härter in einem Gewichtsverhältnis von 10 zu eins gemischt. Das sind zum Beispiel 15 Gramm PDMS pro 1,5 Gramm Härter. Das PDMS wird dann gut vermischt und auf den Siliziumwafer gegossen.

Der Siliziumwafer befindet sich in einer 10 Zentimeter großen Petrischale aus Polystyrol. Es werden etwa 12 Gramm bis 15 Gramm PDMS benötigt, um die MAs mit einer Dicke von etwa vier Millimetern abzudecken. Der Master mit dem PDMS wird dann mit dem Deckel von der Petrischale in ein Vakuum-Desikkat gelegt und mit Vakuum besprüht.

Dies geschieht, um Luftblasen aus dem PDMS zu entfernen, die beim Rühren des Härters entstanden sind. Es dauert ca. 15 Minuten, bis die Luftblasen entfernt sind. Der Master mit PDMS wird nach 15 Minuten in der Vakuum-Trockenheit aus der Trockenheit genommen.

Es gibt noch einige verbleibende Blasen auf dem PDMS-Master. Eine Luftpistole mit einem 0,45-Mikron-Filter wird verwendet, um verbleibende Blasen zu entfernen. Der Master wird dann eine Stunde lang auf eine 80 Grad heiße Platte gelegt, um auszuhärten.

Wenn keine Vakuumtrocknung zur Verfügung steht, kann der Master mehrere Stunden bei Raumtemperatur belassen werden. Die Luftblasen lösen sich schließlich von selbst auf. Wenn keine Heizplatte verfügbar ist, härtet das PDMS nach 24 Stunden bei Raumtemperatur aus.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass der Master während des Aushärtungsprozesses waagerecht ist. Sobald das PDMS auf dem Master ausgehärtet ist, wird es mit einer chirurgischen Klinge in eine saubere Haube gebracht. Um den Umfang der Geräte wird ein Kreis geschnitten

Es ist wichtig, dass man beim Einführen der Klinge in das PDMS Kontakt mit dem Siliziumwafer aufnimmt, aber nicht zu viel Druck auf den Wafer ausübt, da sonst der Master mit einem Kreisschnitt rund um die Geräte reißt. Es gibt vier Geräte pro Drei-Zoll-Silizium-Master. Das PDMS wird vorsichtig vom Master abgehoben.

Dies kann durch leichtes Drehen der chirurgischen Klinge gestartet werden, während sie in den vorherigen Schnitt eingeführt wird. Mit den PDMS-Geräten auf der Form ist es wirklich dünn. Die Face-up-Reservoire werden mit einem acht Millimeter großen Gewebebiopsienstanzer in das Gerät gestanzt.

Der im Locher verbleibende Schmutz wird mit einer Stange herausgedrückt. Die Geräte werden dann geviertelt und überschüssiges PDMS entfernt, so dass das Gerät sauber auf eine Corning-Abdeckung passt. Glas Nummer eins, Größe 24 Millimeter x 40 Millimeter, Stickstoffluft wird verwendet, um überschüssige Ablagerungen wegzublasen.

Hartnäckige Ablagerungen können auch mit 3M Scotch Brand 4 7 1 Vinylband entfernt werden. Die sauberen Geräte sind nun bereit für das Plasmabonden. Ein Herrick-Plasma-Reiniger wird verwendet, um die Neuronen-Geräte kurz mit den Deckgläsern zu verkleben.

Die Geräte und die Deckgläser werden auf ein Tablett gelegt, und das Tablett wird dann in den Plasmareiniger und eine Vakuumpumpe gelegt, die zum Evakuieren von Luft aus der Kammer verwendet wird. Es ist wichtig zu beachten, dass die PDMS-Geräte mit der Vorderseite nach oben gelegt werden. Das heißt, mit der Konstruktion nach oben, so dass sie dem Plasmagas ausgesetzt sind.

Nachdem der Vakuumdruck 300 erreicht hat, wird die Millitorr-Leistung auf die elektrische Spule geschaltet und auf hoch gestellt. Die Tür ist mit einem Spalt versehen, um ein wenig Luft in die Kammer zu lassen, die zur Erzeugung des Plasmas beiträgt. Die Geräte und das Deckglas werden zwei Minuten lang plasmabehandelt.

Beachte die violette Farbe in der Kammer. Das ist das eigentliche Plasma. Die elektrische Spule erzeugt Plasma, ein teilweise ionisiertes Gas, das aus Elektronen, Ionen und neutralen Atos oder Molekülen besteht.

Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf der Oberfläche des Glases und des Geräts, die, wenn sie zusammengelegt werden, eine dauerhafte Verbindung eingehen. Das Plasma verwandelt auch die hydrophile Oberfläche der Oberfläche, was die Zugabe von Flüssigkeiten erleichtert. Der Plasmareiniger sterilisiert die Geräte auch.

Nach einer zweiminütigen Plasmabehandlung wird die Leistung im Vakuum abgeschaltet und Luft in die Kammer geleitet. Die plasmabehandelten Dienstleistungen des Glases und des mikrofluidischen Geräts werden in Kontakt miteinander in einer Reinbank montiert. Anschließend werden die Geräte in eine sterile 60-Millimeter-Schale gelegt.

Die plasmabehandelten Oberflächen des Glases und des Geräts bilden eine enge irreversible Verbindung. Innerhalb von 10 Minuten nach der Plasmaverklebung wird das Gerät dem Glas Polyol-Lysin zugesetzt. Nach 10 Minuten nimmt die Hydrophilie des Geräts ab.

Dies erschwert es der PLL, in das Gerät einzudringen. Es ist wichtig, nach der Zugabe von PLL nach Luftblasen im Gerät zu suchen. Eine einfache Methode, um vorhandene Luftblasen zu entfernen, ist die Verwendung einer P 200-Pipette, die mit 100 Mikrolitern Flüssigkeit gefüllt ist.

Platzieren Sie in diesem Fall die Spitze direkt an der Öffnung des Hauptkanals und drücken Sie dann den P 200 kräftig durch. Dies muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, aber schließlich wird die Kraft der Pipette die Blasen heraustreiben. Die Geräte, die PLL enthalten, dürfen über Nacht inkubieren und ein Standard-Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad mit 5 % CO2.

Nach 24 Stunden Inkubation mit PLL werden die Geräte zweimal schnell mit deionisiertem Wasser aus dem Autoklaven gespült. Während dieses Prozesses wird die Flüssigkeit nie vollständig aus den Hauptkanälen entfernt, sondern nur aus den Behältern. Wenn Sie Flüssigkeit aus den Hauptkanälen entfernen, entstehen Blasen.

Nach zwei schnellen Spülgängen werden die Geräte wieder mit deionisiertem Wasser aus dem Autoklaven befüllt und für mindestens drei Stunden oder über Nacht wieder in den Inkubator gestellt. Am nächsten Tag, nachdem die Geräte über Nacht oder mindestens drei Stunden mit Wasser inkubiert wurden, werden sie wieder in die Biosicherheitswerkbank gebracht und zweimal mit entionisiertem Wasser gespült. Dann werden den Geräten neurale Basalmedien zugesetzt, die die notwendigen Ergänzungen, B 27 und Glutamat für die Kultivierung primärer Rattenneuronen enthalten.

Die Geräte werden dann für die zukünftige Verwendung wieder in den Inkubator gelegt. Die Geräte sind nun bereit, Neuronen zu platzieren. In diesem Video haben wir die Technik der weichen Lithographie demonstriert, die wir zur Herstellung unserer Neuronengeräte verwenden.

Diese Geräte können zur Kultivierung von Neuronen und anderen Zelltypen von Interesse verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Geräte ist die Fähigkeit, die Kultivierung der Neuronenzellkörper auf der einen Seite des Geräts von einer reinen axonalen Fraktion auf der anderen Seite des Geräts zu trennen und zu unterteilen. Im nächsten Video zeigen wir Ihnen, wie wir E 18 fetale Rack-Kortikalneuronen vorbereiten und wie wir die Zellen in das Gerät laden.

So, das war's vom John Lab. Danke fürs Zuschauen.