Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

Mein Name ist Jiang, ich bin Postdoktorand an der Harvard-Universität und am Massachusetts Institute of Technology im Bereich Gesundheitswissenschaften und Technologie. Meine Expertise in diesem Labor liegt darin, neuartige myopridiktive Geräte zur Untersuchung des zellulären Verhaltens zu entwickeln. Ich kann ebenso völlig neuartige Gradientengeräte herstellen und diese zudem in mein myopridiktives Gerät integrieren.

Die TC-Vorrichtung kann die Zell-Zell-Interaktion und Zellinteraktion sowie den Kontakt zwischen Zellen und solaren Faktoren präzise steuern. Mit dem TC-System kann ich daher die Grundlagen der Zellbiologie erforschen und zudem Ansätze aus der Entwicklungsbiologie sowie der bio-biologischen Stammzell-Bioingenieurwissenschaft anwenden. Mein Name ist Amir Manchi, und ich bin Bachelorstudent im Labor von Professor Haan an der Harvard-MIT-Abteilung für Gesundheitswissenschaften und Technologie.

Und ich arbeite an mikrofluidischen Vorrichtungen und haben als Machbarkeitsnachweis versucht zu zeigen, dass mikrofluidische Vorrichtungen ein großes Potenzial als Geräte zur Zellkultur und für verschiedene Studien, wie Toxizitätsstudien, besitzen. Außerdem haben wir versucht, die Strömungscharakterisierung innerhalb dieser Vorrichtungen in Abhängigkeit von Durchflussraten, Geometrie und anderen verschiedenen Parametern zu untersuchen und zu optimieren. Im Moment beginnen wir im Mikrofertigungsraum, und was wir tun werden, ist, einige mikrofluidische Vorrichtungen herzustellen. Um die mikrofluidischen Vorrichtungen realisieren zu können, benötigen wir strukturierte Siliziumwafer und darauf aufgebrachte PDMS-Formen. Dieses PDMS-Polymer ist eigentlich eine Mischung aus zwei verschiedenen Komponenten.

Es handelt sich um eine Mischung aus Silikonelastomer-Grundmasse und Silikonelastomer-Härter. Diese beiden Komponenten werden im Verhältnis 10 zu 1 gemischt, also 10 Teile Grundmasse und 1 Teil Härter. Ich benötige hier etwa 20 Gramm meiner Grundmasse.

Ich benötige außerdem zwei Gramm des Härters, und der Härter ist deutlich weniger dicht. Er fließt viel schneller, weshalb ich etwas vorsichtiger sein muss. Der Wert liegt jetzt bei etwa 22, und ich möchte die Grundmasse und den Härter miteinander vermischen.

Dazu verwende ich eine Pipette. Ich werde versuchen, die Mischung so gut wie möglich gründlich zu homogenisieren. Anschließend gieße ich das PDMS-Polymer auf die Siliziumwafer, die bereits eine Struktur auf ihrer Oberfläche aufweisen. Der Siliziumwafer verleiht den PDMS-Formen ihre Struktur.

Sie können tatsächlich bemerken, dass ich hier zwei Siliziumwafer habe, und der Grund dafür ist, dass einer von ihnen für die obere Schicht unseres Mikroföllik-Geräts und der andere für die untere Schicht bestimmt ist. Wir benötigen zwei Schichten bei Mikroföllik-Geräten, da wir einen Kanal im Inneren anlegen möchten, und die gesamte Grundidee hinter mikrofluidischen Geräten besteht darin, einen Durchfluss innerhalb dieser Kanäle zu erzielen. Daher muss ich diese Mischung auf beide Siliziumwafer auftragen, da sich viele Blasen in dieser Mischung befinden.

Ich möchte diese Blasen entfernen, und dazu verwenden wir ein Vakuum, um die Blasen herauszuziehen. Wir sind wieder im Hauptlaborbereich, und wie ich bereits erwähnt habe, befinden sich in der PDMS-Mischung viele Blasen, die wir entfernen möchten. Ich werde die Mischungen auf die Siliziumwafer im Inneren der Vakuumkammer platzieren. Danach werde ich die Kammer verschließen und das Vakuum einschalten. Sobald dies abgeschlossen ist, werden wir die PDMS-Formen über Nacht in einen Ofen stellen, um sie fester werden zu lassen.

So, wir befinden uns nun im Labor und möchten diese mikrofollikulären Vorrichtungen zusammenbauen. Dazu nehmen wir die PDMS-Formen, die über Nacht im Inkubator waren und in denen sich die Muster gebildet haben, die zuvor auf den Siliziumwafern waren. Ich werde zwei verschiedene Muster verwenden. Auf der linken Seite sehen Sie den Mikrokanal, der die obere Schicht bilden wird, und auf der rechten Seite sehen Sie einige grüne Linienmuster, die die untere Schicht bilden werden.

Und dies wird die Rillen im Inneren des Mikrogeräts bilden. Ich beginne damit, diese Gele zu schneiden, um die obere Schicht lösen zu können, sodass sie sich leicht vom Siliziumwafer ablösen lässt. Danach werde ich sie mit der Musterseite nach oben in diese Petrischale überführen, sodass die Strukturen nach oben zeigen.

Und ich werde dasselbe auch für die Rillen ausprobieren, die die grünen Linienmuster waren. Diese werden also die unterste Schicht bilden. Sobald das Gel geschnitten ist, werde ich es in die Petrischale überführen und, um Staub auf den Mustern zu vermeiden, werde ich sie zukleben.

Der nächste Schritt besteht darin, die Enden der Kanäle auszustanzen, damit Zellen und Medium ein- und austreten können. Da ich hier eine große Oberfläche habe und die Muster selbst nicht erkennen kann, werde ich dies verwenden, um die Kanäle sichtbar zu machen, und anschließend beide Enden ausstanzten. Ich werde hier also eine große Lochung vornehmen, die ausreichend Platzreserve bieten muss, und auf der anderen Seite ein kleines Loch stanzen, um auf der gegenüberliegenden Seite Polyethylentubingen verwenden zu können.

Wir befinden uns nun im Mikrofertigungsraum, und der nächste Schritt besteht darin, die beiden unterschiedlichen Oberflächen, die wir haben, miteinander zu verbinden. Dazu verwenden Sie dieses Gerät, das als Plasma-Reiniger bezeichnet wird, und der Prozess wird als Plasma-Behandlung bezeichnet. In dieser Kammer entsteht ein Plasma-Milieu, und bei der Wechselwirkung zwischen Plasma und Oberfläche wird das Plasma die schwachen Oberflächenbindungen brechen und sie durch hochreaktive chemische Gruppen ersetzen.

Was jetzt passieren wird, ist Folgendes: Ich werde die Bänder entfernen, die hier zur Staubvermeidung eingelegt wurden, und diese Formen in die Kammer bringen. Ich werde die Tür vollständig schließen, zuerst die Stromversorgung einschalten, dann die Pumpe starten, und dann sind wir startklar. Wir werden es in fünf bis zehn Minuten fortsetzen.

Jetzt möchte ich es ausschalten, also schalte ich die Pumpe und anschließend die Stromversorgung aus, und dann öffne ich die Kammer. Tatsächlich herrscht hier ein Unterdruck, sodass Sie möglicherweise ein Geräusch hören. Das liegt am Unterdruck, weshalb ich meine Formen langsam herausnehme.

Da wir beide Musterflächen nach oben gerichtet haben, nehme ich die untere Schicht, lege sie in meine linke Hand und nehme die obere Schicht, drehe sie um und platziere sie auf meinen Rillen, dann schiebe ich die Schichten aufeinander. Die Haftfestigkeit und Dauerhaftigkeit sind der Vorteil der Verwendung dieser Plasmabehandlungsmaschine. Und was Sie hier gerade sehen, ist, dass Sie tatsächlich den Kanal in der oberen Schicht erkennen können und die gerillten Muster in der unteren Schicht sehen können, und sie ist bereit für den nächsten Schritt.

Und dann bringen Sie hier den Kultursaal, das Kulturmedium und öffnen dann die Schale. Anschließend können Sie einfach das Fibronectin beladen, 60 Mikroliter Fibroin entnehmen und in das Gerät einfüllen. Um einen Fluss innerhalb des Geräts zu erzeugen und eine geringe Beschichtung durch Vibration im Kanal zu induzieren, können Sie vorsichtig am Auslass saugen.

Danach können wir das Gerät einfach in den Inkubator stellen, und es erfolgt eine einstündige Abkühlung bei Vibration im Inneren des Inkubators. Wir nehmen die Probe aus dem Inkubator heraus und verwenden dann fünf Rost, drei, drei Faserrost. Wir führen einfach die Fusion und diesen Schatten durch, geben das Medium hinzu und zählen die Zellen außerdem mithilfe des Zellzählgeräts.

Wir verwenden normalerweise die Millionen Zellen, die sich innerhalb des Geräts befinden. Nach der Dissoziation können Sie einfach ein- oder zweimal sanft Spüllösung durchleiten, dann die Zellsuspension entnehmen und anschließend die Zellen in den Kanal einfüllen, um eine bessere Beladung der Zellen innerhalb des Kanals zu erreichen. Sie können dies einfach vorsichtig mit der Absaugung durchführen.

Das Summenmedium und die Oberflächensuspension werden normalerweise automatisch durch die Auslasszelle abgesaugt, wodurch bekanntlich der selektive, globale Kanal besiedelt wird. Danach können wir die Probe einfach eine Stunde lang in den Inkubator stellen, bis sich die Zelle vollständig innerhalb des Kanals ausgebreitet hat. Anschließend können wir Annexin V und Propidiumiodid sowie Wasserstoffperoxid zuführen.

Und dann untersuchen Sie Ihren Zeit-Hypothese-Assay. Wir können einfach die Probe in ein Gewebekultur-Nährmedium geben und anschließend die Lösung aus zwei Milliliter DMEM-Medium sowie 20 Mikroliter Annexin V, 40 Mikroliter Propidiumiodid und 100 Milliliter Wasserstoffperoxid herstellen. Danach nehmen Sie das DMEM-Medium mit Annexin V, Propidiumiodid und Wasserstoffperoxid und geben es danach in die Spritze.

Geben Sie das zwei Milliliter Medium und fünf Mikroliter Propidiumiodid, Hydroperoxid hinzu. Wir können die Lösung einfach in die Zentrifugenröhrchen geben, dann die Blase entfernen und anschließend die C-Bear-Verbindung herstellen. Diese ist gasdicht, Hamilton, mit Wärmemill-Zentrifugenröhrchen.

Dieser hier ist drei Bären. Dieser hier ist Einweg-Deckenverkleidungen. Dieser hier ist eine 27-Gauge-Nadel.

Dieses hier ist PE-20-Polyethylenrohr. Nachdem die Lösung in eine Spritze gefüllt wurde, kann man einfach vollständig zusammendrücken, vollständig zusammendrücken, vollständig zusammendrücken, dann etwas tippen, die Spritze antippen, die Blase entfernen und anschließend die Lösung zurückziehen. Noch einmal: vollständig zusammendrücken, die Blase entfernen und dann vorsichtig erneut aufziehen.

Nehmen Sie also die Lösung für eine Mahlzeit und dann können wir das Ventil wechseln. Drücken Sie die Lösung durch das Dreiwegeventil und vollständig durch die Schlauchleitung. Schließlich tritt die Lösung an der Spitze unserer Schlauchleitung aus, und dann können wir einfach die Schlauchleitung mit dem Mikrogerät verbinden und mit der Infusion von einem Mikroliter pro Minute beginnen.