Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

Mein Name ist Jiang. Ich bin Postdoktorand am Harvard- und MIT-Programm für Gesundheitswissenschaften und Technologie. Und mein Name ist Amir Manchi, und ich bin Bachelorstudent im Labor von Professor Ha SANE am Harvard-MIT-Programm für Gesundheitswissenschaften und Technologie.

Dieser Folien zeigt das schematische Verfahren zur Herstellung der Vorrichtung: Zunächst wird SUA-50 durch Spin-Beschichtung auf den Silikon-Dampf aufgebracht, danach wird eine Maske über den Silikon-Dampf gelegt, gefolgt von UUV-Belichtung und Entwicklung. Schließlich können wir diese Pads auf dem Silikon-Dampf platzieren. Danach gießen wir einfach das PDMS, führen das Aushärten und Backen durch, stanzen kleine Löcher aus und können anschließend die Vorrichtung durch Sauerstoff-Plasma-Bonding mit einer Glasplatte verbinden.

Okay, wir befinden uns nun im Mikrofertigungsraum innerhalb des Labors und werden zunächst einige PDMS-Schichten herstellen. Mit PDMS ist der eigentliche wissenschaftliche Begriff Polymethylsiloxan gemeint, ein organisches Polymer. Es ist das am weitesten verbreitete siliziumbasierte organische Polymer.

Tatsächlich handelt es sich um eine Mischung aus zwei verschiedenen Komponenten: einer Silikon-Elastomer-Grundmasse und einem Silikon-Elastomer-Härter. Das Mischverhältnis beträgt 10 Teile Grundmasse zu 1 Teil Härter. Wir benötigen etwa 10 Gramm der Grundmasse und dementsprechend etwa 1 Gramm des Elastomer-Härters, und ich werde versuchen, die Grundmasse und den Härter gründlich miteinander zu vermischen.

Ich werde Pipetten verwenden. Nun, da die Mischung bereit ist, werde ich sie tatsächlich auf den Siliziumwafer auftragen. Die Idee dabei ist, dass diese Siliziumwafer bestimmte Muster auf ihrer Oberfläche aufweisen.

Sie helfen tatsächlich dabei, diesem PDMS-Polymer das Muster zu verleihen, und wir nutzen diese Muster, um Kanäle, Rillen oder jedes andere benötigte Muster auf diesen Polymeren zu erzeugen. Der nächste Schritt besteht daher darin, die Mischung aufgrund der zahlreichen Blasen darin in ein Vakuum zu geben, um Blasen innerhalb unseres Polymers zu vermeiden. Ich werde die PDMS-Gele zusammen mit der Siliziumwaferplatte in die Vakuumkammer stellen.

Ich werde die Kammer schließen und dann das Vakuum einschalten. Nachdem die Blasen verschwunden sind, was etwa einige Minuten dauern mag, werden wir die Probe über Nacht in den Ofen stellen, der auf etwa 70 Grad Celsius eingestellt ist; dies bewirkt, dass die Probe aushärtet. Das Muster, auf das Sie achten sollen, sind diese drei verschiedenen Reservewar, um Gradienten zu erzeugen, sodass wir auf der einen Seite eine Konzentration von null und auf dieser Seite eine bestimmte Konzentration haben, und gleichmäßig in Richtung dieser Konzentration übergehen. Außerdem werden wir am anderen Ende eine kleine Öffnung stanzen, die in diesem Fall als Auslass fungiert.

Der nächste Schritt besteht darin, eines dieser Muster auszuschneiden und in eine Petrischale zu übertragen, wobei die Musterflächen nach oben zeigen sollen. Ich hoffe, Sie können nun die drei Einlässe und den einen Auslass erkennen, die ich Ihnen zuvor an diesen Mustern erläutert habe. Für unsere Einlässe verwenden wir kleine Stanzen, um Polyethylenschläuche verwenden zu können, und ich werde größere Stanzen für meinen Auslass verwenden, um einen Reservestau zu erhalten.

Wir beginnen also mit dem ersten Einlass. Ich werde einen Stanzvorgang durchführen, dasselbe mit dem zweiten und außerdem einen weiteren kleinen Stanzvorgang für den dritten. Der letzte Schritt besteht darin, am Auslass einen großen Stanzvorgang durchzuführen.

Nachdem wir fertig sind, haben wir eine A-P-D-M-S-Schicht, die die oberste Schicht darstellt, und ich werde eine weitere Glasschicht an der Unterseite verwenden. Diese Mikroschieber werden meine untere Schicht bei den Mikrofollikelvorrichtungen bilden. Nun befinden wir uns im Mikrofertigungslabor, und ich habe eine Glasschicht und eine PDMS-Schicht, die ich miteinander verbinden möchte.

Was wir nun verwenden werden, ist eine Maschine, die als Plasma-Reiniger bezeichnet wird. Im Inneren der Kammer sorgt das Plasma dafür, dass die schwachen Oberflächenbindungen abgebaut und durch hochreaktive chemische Gruppen ersetzt werden. Außerdem wird die Oberfläche tatsächlich hydrophil. Im Moment werde ich die PDMS-Form nehmen, die die obere Schicht darstellt und einige Kanäle enthält, und das Klebeband entfernen, das ich zuvor angebracht habe, um zu verhindern, dass Staub an unserer Form haftet.

Ich werde es in die Kammer legen. Als Nächstes habe ich eine Glasschicht, und zwar einen Objektträger, der unsere unterste Schicht innerhalb des Geräts darstellt. Auch diesen werde ich nun in die Kammer legen.

Und ich schließe die Kammer vollständig, sobald sie geschlossen ist, zuerst die Stromzufuhr und dann die Pumpe. Danach müssen wir in etwa fünf Minuten zu diesem Gerät zurückkehren. Was ich tun werde, ist, das Gerät auszuschalten. Dazu schalte ich zuerst die Pumpe und dann die Stromzufuhr aus und öffne anschließend die Kammer.

Dieser Ton entsteht tatsächlich durch den negativen Druck, der während des Vorgangs innerhalb der Kammer aufgebracht wurde. Ich werde nun die verschiedenen Schichten herausnehmen und sie miteinander verbinden. Da das Glas die unterste Schicht ist, halte ich es mit der linken Hand fest und bringe die PDMS-Schicht darauf an, sodass sie auf der Glas-Schicht aufliegt.

Doch da die Muster derzeit eigentlich nach oben zeigen, werde ich die PDMS-Schicht gewissermaßen invertieren. Ich werde sie nach dem Andrücken auf das Glas legen. Sie haften sehr leicht an, und ein Teil des Vorteils dieses Plasma-Behandlungsverfahrens liegt in der Haftfestigkeit und Dauerhaftigkeit.

So sieht das am Ende aus. Noch einmal: Das hier sind unsere Einlässe und das ist mein Auslass, und wir sind bereit, mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Das Fasern wird innerhalb des Geräts gekocht und anschließend für eine Stunde in den Inkubator gestellt. Danach entnehmen wir nach einer Stunde eine SIM-Probe aus dem Inkubator, geben Fischkulturfutter hinzu und stellen die Lösung her.

Um die EGF-Lösung herzustellen, geben wir einfach zwei Milliliter Kulturmedium in Azure und fügen 15 Nanogramm pro EGF sowie 10 Mikromolar 50 D hinzu, um diese Lösung zu verwenden, um den EGF-Gradienten über den Kanal sichtbar zu machen. Danach entnehmen wir zwei Milliliter Medium, virtuelles Medium, und geben hier zwei weitere Milliliter Medium hinzu. Diese beiden Bereiche enthalten lediglich normale Kulturen, normale, normale Kulturinfusion im Gerät.

Ich entferne also die Blase, verbinde erneut, auch hier kommt wieder eine mobile M-Blase nach unten. Dann verwende ich einfach 15 Nanogramm EGF und 10 Mikromolar Fi-Dextra sowie zwei Milliliter Medium aus der Probe, fülle sie in die Spritze und achte darauf, dass keine Blase entsteht. Danach führe ich einfach einen Lösungswechsel durch und schalte wieder zurück.

Die Lösung wird in die Gasspritze überführt, und mehrmals wird SH gedrückt, um die Luftblasen zu entfernen. Zunächst gelangt die gesamte Wechselspritzen-Lösung hierher, danach wird der Schieber betätigt, und die Lösung fließt durch den Dreiwegehahn sowie durch den Schlauch, bis sie am Ende des Schlauches austritt. Nachdem die Mischung austreten kann, wird einfach der Schlauch in das My Predict-Gerät eingeführt, wobei alle drei Lösungen identisch sind. Man kann vorsichtig die Verbindung zum Eingang des Infusionskanals herstellen.

Es liegen also schließlich zwei normale Kultivierungsmedien vor. Eins ist Kultivierungsmedium mit EGF, um das Gradientenprofil von EGF zu bestätigen. Dieses hier ist die Zelle im Netz, Zelle im Netz.

Dies wird der Zellaustritt sein, sodass der Gradient über den drei Hauptkanal erzeugt wird und anschließend der Gradient im Zellbereich entsteht. Normalerweise möchte ich zunächst nur die Zellansiedlung vornehmen, indem wir die Zellsuspension am Austritt ansetzen, und dann können wir vorsichtig ansaugen, wodurch die Zellen durch den Zellbereich fließen, sich automatisch absetzen und auf der Beschichtung anheften, woraufhin sichergestellt werden muss, dass sich die Zellen vollständig ausgebreitet haben. Nachdem sichergestellt ist, dass sich die Zellen vollständig ausgebreitet haben, können wir einfach mit der Infusion beginnen und anschließend die Zellmigration mithilfe des Gradient erzeugenden Geräts untersuchen.