涡固定，局部照射，组织移植

以下实验的总体目标是将健康干细胞群定位在 parian 内干细胞消融组织附近，以便分析再生过程中体内的干细胞和后代行为。这是通过麻醉和固定未照射或叶状照射的 parian 以进行进一步作来实现的。接下来，固定的未照射的 parian 用铅部分屏蔽，然后进行 X 射线照射，这会产生一个未受伤的 parian，其中干细胞消融组织与仍然充满干细胞的屏蔽组织并列。

或者，可以将来自未辐照供体的组织移植物移植到先前辐照的宿主中，以产生具有分离干细胞群的 parian。Fally 存在于其他干细胞中。获得的消融宿主结果显示，通过干细胞标志基因的全安装 RNA 原位两次杂交，与干细胞消融组织相邻的分离干细胞群。

因此，这里描述的方法旨在通过研究干细胞在移植范式和部分照射范式中的行为来更好地了解再生涡虫，这使我们能够测试周围组织和这些干细胞所在的局部环境是否影响或影响这些新原始细胞或干细胞的行为。在再生过程中，在实验前 1 到 2 个月，根据随附的手稿喂食 plin。为了在本演示中获得所需的尺寸，选择了长度在 1 到 2 厘米之间且宽度超过 2 毫米的 plin。

然后他们在使用前 3 到 7 天挨饿。接下来，通过将每体积重量 0.1% 至 0.2% 的 cleone 溶解在 parian 水中，制备 Chloro tone 溶液，这是一种温和的局部麻醉剂。然后用本生灯将溶液冷却在冰上进行组织移植，将内径为 0.75 毫米的毛细管从末端弯曲 1 至 2 厘米至 90 度角，以切割移植组织。

然后将另一根外径为 0.7 毫米的毛细管从末端弯曲 1 到 2 厘米至 90 度角，以便在主体上形成一个孔以接收移植物。接下来，剪下黑色滤纸 watman。第三，滤纸 Kim wipe 和卷烟纸根据随附手稿中标明的尺寸。

之后，制备改性的 Holt Fers 溶液和 Caine 饱和的 Holt Fretter 溶液。将它们都冷却到 4 摄氏度。然后将折叠的 Kim 抹布贴在一块 Paraform 上。

将其放在解剖显微镜下的 Peltier 冷却板或其他冷却装置上。随后用冰镇的 Holt Fretter 溶液浸透 Kim 抹布。然后将两个黑色滤纸矩形放在 Kim 擦除上。

现在将一张 Watman 2 号滤纸放入培养皿中。用 Holt Fretter 溶液润湿滤纸。然后将培养皿放在冰上冷却以进行部分照射。

将较大的纸衬垫放入类似于组织移植的较大培养皿中。用 Holt Fretter 溶液润湿滤纸。然后将盘子放在冰上冷却。

在此过程中，用冷冻的 cleone 溶液填充培养皿。将 Planaria 移液到培养皿中进行移植。一次只能麻醉一名宿主和一名供体。

对于部分照射，可以同时麻醉许多动物。然后让 paria 在 cleone 溶液中浸泡 5 到 10 分钟，直到它们变得一动不动。将 paria 移液到装满冰镇 Holt Fretter 溶液的培养皿中，冲洗它们。

之后，通过将 plin 区域移液到浸有冷冻 Holt Fretter 溶液的黑色滤纸上来固定 plin 区域。然后用一对镊子将它们的腹侧朝下定向。现在将之前准备好的冷藏培养皿放入冰桶中，该冰桶将放入顶部光源 X 射线辐照器中。

通过移动黑色滤纸，在培养皿中排列麻醉的 plin 区域。然后将它们转移到顶部光源 X 射线辐照器上，将冰桶放置在冰桶中，以便从阴极管到冰桶的距离最小化。从而最大限度地提高有效剂量率。

然后将铅屏蔽层放置在 paria 和阴极管之间，以接受 X 射线剂量。如果需要从非屏蔽区域进行完全干细胞消融，则提供 30 戈瑞或更大的戈瑞。X 射线发射后，立即将 parian 转移到冰镇的 parian 水中。

之后，让 parian 水升温至室温，让动物从黑色滤纸中脱落。部分照射程序现已完成。要在解剖显微镜下开始此过程，请将麻醉的宿主和供体 plin 区域排列在 Kim 擦拭上单独的矩形黑色过滤器上，该过滤器已在 Peltier 或冷却器板上冷却。

使用 0.75 毫米内径的毛细管从供体上切出移植物塞。然后使用一对镊子将其放在主机的不碍事部分。然后使用 0.7 毫米外径的毛细管从主机上取下塞子。

随后将移植物定位在孔中。将矩形黑色滤纸上的移植宿主转移到先前制备的培养皿中。用 Caine 饱和的 Holt Fretter 溶液润湿一张卷纸。

然后将其放在移植的宿主上。接下来，浸泡四张包裹着饱和 Holter 溶液的滤纸，如果移植的宿主潜艇随后浸泡了四团切割物，Kim 擦拭包裹着饱和的 Holt Fretter 溶液。将它们放在滤纸上。

之后，盖上盖子。将培养皿放在冰上。然后将供体 parian 转移到 parian 水中进行回收和再生。

当所有移植完成后，将移植的 parian 放入 10 摄氏度的培养箱中过夜。第二天早上，将其转移到装满 parian 水的培养皿中。让 parian 从滤纸上脱落，或者用镊子轻轻将其取出，然后每两到三天更换一次 parian 水。

照射后 3 天固定的辐照但完全屏蔽的对照 parian 中进行孔安装原位杂交，显示干细胞分布与野生型 parian 的分布无法区分。另一方面，对于仅部分屏蔽的 parian，让前部和后部暴露的干细胞似乎从非屏蔽区域消融。这里显示了成功移植的 parian 的背视图和腹视图。

移植后 3 天，移植物在背侧和腹侧表面都清晰可见，并且在移植物宿主界面被特征性的无色组织包围。然而，不成功的移植在移植部位没有可见的移植物组织。全原位杂交显示干细胞仅在移植物位置或周围存在，这表明一旦掌握，移植就成功了。

每次移植可以在短短 5 分钟内完成。成功率接近 90% 至 100%，部分照射可以大大扩大。假设您的辐照器的磁场大小足够大。