Name: 涡固定，局部照射，组织移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习涡虫组织移植与局部照射技术，用于研究再生生物学中的干细胞行为。该方法通过铅屏蔽实现精准X射线照射，结合麻醉固定技术，为神经科学与干细胞研究提供可靠的活体分析手段。

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作者感谢小林千代子（Chiyoko Kobayashi）和赤田清一（Kiyokazu Agata）在涡虫移植技术方面提供的有益建议，同时也感谢Sánchez实验室过去和现在的成员在本技术开发过程中给予的宝贵讨论。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）培训项目基金（5T32 HD0791）对OCG的资助，以及NIH基金R37GM057260对ASA的支持。ASA是霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）的研究员。

注意：本方案建议使用可能具有危害性的材料（铅和氯酮）。请获取、阅读并遵循所有可能具有危害性材料的材料安全数据表（MSDS）。
1. 动物培养、筛选与准备
<ol>
 <li>动物培养和操作时使用涡虫水（1X Montjuïc 盐溶液9）和塑料移液管。</li>
 <li>在实验室常规培养条件下饲养时，可使用有性生殖型 Schmidtea mediterranea10。为获得所需大小的无性生殖型个体，应在正常培养条件9下于室温饲养 S. mediterranea，并在使用前一至两个月内以正常频率的两到三倍（每周 2–3 次）进行喂食。或者，以正常频率喂食的无性生殖型动物可在 10 摄氏度条件下长期饲养，以增加其平均体型。</li>
 <li>选择体长在 1 至 2 cm 之间、宽度超过 2 mm 的个体，并在使用前饥饿处理 3–7 天。</li>
 <li>如需对预定的宿主、供体或部分照射的动物进行任何药理学或放射学处理，应在本步骤中实施相应处理。</li>
 <li>若所进行的药理学处理要求在处理期间喂食动物，则应在使用前额外饥饿 3 至 7 天。</li>
</ol>
2. 溶液与材料的准备
<ol>
 <li>通过将0.1-0.2% w/v的氯醛酮（chloretone）溶解于涡虫养殖用水（planarian water）中，并将溶液置于冰上冷却，制备作为温和局部麻醉剂的氯醛酮溶液。</li>
 <li>若仅进行部分照射，请直接进入步骤2.7；若进行组织移植，则继续执行步骤2.3。</li>
 <li>使用本生灯将内径为0.75 mm（用于切割移植物组织）和外径为0.7 mm（用于在受体上打孔以植入移植物）的毛细管在距末端1-2 cm处弯成90°角。为节约材料，可将每根毛细管的两端均弯曲后从中折断，得到两个工具。注意不要灼烧毛细管最末端。</li>
 <li>将以下纸张裁剪至指定尺寸：
 <ul>
 <li>黑色滤纸（裁成约2.5 cm × 1.5 cm的矩形）</li>
 <li>Whatman #3滤纸（裁成约2 cm × 0.5 cm的矩形）</li>
 <li>Kimwipe（折叠后裁成约3 cm × 0.5 cm × 4层的小块）</li>
 <li>卷烟纸（去除胶条后裁成约3 cm × 2 cm的矩形）</li>
 </ul>
 </li>
 <li>配制改良霍尔特弗雷特溶液（3.5 g/L NaCl、0.2 g/L NaHCO3、0.05 g/L KCl、0.2 g/L MgSO4、0.1 g/L CaCl2，pH 7.0–7.5）以及酪蛋白饱和的霍尔特弗雷特溶液，并将两者冷却至4 °C。</li>
 <li>将一块折叠的Kimwipe固定在一块Parafilm膜上，置于解剖显微镜下方的帕尔帖冷却板或其他冷却装置上。用预冷的霍尔特弗雷特溶液润湿Kimwipe，并在其上放置两块黑色滤纸矩形片。</li>
 <li>用Whatman #2滤纸衬里培养皿，以霍尔特弗雷特溶液润湿滤纸，并将培养皿置于冰上冷却。对于部分照射实验，可使用较大尺寸的培养皿及相应大小的滤纸衬里。</li>
</ol>
3. 麻醉与固定
<ol>
 <li>将冰冷的氯代酮溶液倒入培养皿中，并用移液器将蠕虫转移至培养皿内。仅在进行移植时，每次麻醉一个宿主和一个供体。若需进行部分照射，可同时麻醉多个（n &gt; 10）动物。</li>
 <li>让蠕虫在氯代酮溶液中浸泡至完全静止（5–10 分钟）。</li>
 <li>用移液器将蠕虫转移至盛有冰冷霍尔特弗雷特溶液的培养皿中，进行冲洗。</li>
 <li>用移液器将动物转移至浸有冰冷霍尔特弗雷特溶液的黑色滤纸上，用镊子将其腹面朝下固定。若动物仍能移动，可吸去多余的霍尔特弗雷特溶液，略微降低帕尔帖装置或冷板的温度，或延长氯代酮处理时间。</li>
</ol>
4. 局部照射
注意：请按照以下步骤准备用于局部照射的动物。如果进行移植操作，请转至第5节。
<ol>
 <li>将步骤 2.7 中预冷的培养皿放置于冰桶内的冰上，冰桶需可放入顶部放射源X射线辐照仪中。</li>
 <li>通过移动固定动物的黑色滤纸来调整麻醉后的动物在培养皿中的位置。直接使用镊子移动麻醉后的蠕虫可能会造成损伤。</li>
 <li>将排列好的动物转移至顶部放射源X射线辐照仪，并放置冰桶，使阴极管与动物之间的距离最小化，从而最大化有效剂量率。</li>
 <li>根据需要在动物与阴极管之间放置铅屏蔽板（图 1）。屏蔽板厚度应为 4.5 至 6 mm，以实现对 325 kV X 射线束 97% 至 99% 的衰减11。</li>
 <li>施加X射线剂量。若需完全消融未屏蔽区域的干细胞，应使用X射线辐照仪施加 30 Gy 或更高的剂量。作为参考，在 Precision X-Ray Inc. XRAD320 设备中，30 Gy 相当于在 320 千伏、10 毫安条件下照射 3.6 分钟，源-场距离为 30 厘米。</li>
 <li>完成照射后，立即通过黑色滤纸操作，将动物转移至预冷的涡虫培养用水中。让涡虫培养用水逐渐升至室温，并使动物自行脱离黑色滤纸。部分照射程序至此完成。</li>
</ol>
5. 组织移植
<ol>
 <li>使用移液管和镊子，在解剖显微镜下，将麻醉后的宿主和供体蠕虫分别放置在已冷却的帕尔贴或冷却板上的Kimwipe表面的黑色滤纸小块上。</li>
 <li>使用内径为0.75 mm的毛细管从供体中切取移植物块，并用镊子将其放置在宿主上不碍事的区域。若移植物卡在毛细管中，可用镊子将其取出。</li>
 <li>使用外径为0.7 mm的毛细管从宿主中取出一块组织，然后用镊子将移植物插入所留下的孔洞中。</li>
 <li>将带有黑色滤纸小块的移植后宿主转移至步骤2.7中准备好的培养皿中。</li>
 <li>用酪蛋白饱和的霍尔特弗雷特溶液润湿一张卷纸，并按图2A所示将其覆盖在移植后的宿主上方。</li>
 <li>将四片滤纸用酪蛋白饱和的霍尔特弗雷特溶液浸湿，并按图2B所示包裹移植后的宿主。</li>
 <li>将四团剪好的Kimwipe用酪蛋白饱和的霍尔特弗雷特溶液浸湿，并覆盖在步骤5.6中的滤纸上（图2B）。盖上盖子，将培养皿置于冰上。</li>
 <li>将供体蠕虫转移至涡虫培养用水中，使其恢复、愈合并再生。</li>
 <li>当所有移植操作完成后，将移植后的蠕虫置于10 °C培养箱中过夜。</li>
 <li>次日早晨，注意不要扰动移植物，揭开覆盖物，将蠕虫（连同其黑色滤纸）转移至盛有涡虫培养用水的培养皿中。</li>
 <li>可让蠕虫自行从滤纸上脱离，或用镊子轻轻将其取下。</li>
 <li>每2–3天更换一次涡虫培养用水。</li>
</ol>
6. 代表性结果
部分照射后，涡虫会立即表现出正常且未受影响的状态。根据所给予的剂量以及所用屏蔽装置的几何形状，被照射的组织可能会发生退化甚至解体7受保护的组织应保持完整。在组织退化并失去完整性后，将形成芽基，并再生缺失的结构（图3A）。如果在部分照射区域内进行截肢，受照射的组织将被挽救（即防止其退化或解体）（图3B）。在未受伤和截断的情况下，与未照射的截断涡虫相比，再生过程将会延迟图3C。如果给予30 Gy的X射线剂量，且部分照射的动物未受损伤，则可在部分照射后2至3天通过以下方式确认干细胞消融成功，其消融模式与所用铅屏蔽的形状相对应 原位 用于干细胞标志物的杂交 Smed-piwi-112 （又称 smedwi-1) (图 4).
移植后的第二天早晨，移植组织成功植入宿主组织的情况应已清晰可见，移植物已黏附于宿主的背侧和腹侧表面（图5A）。有时，移植物可能仅黏附于宿主的腹侧或背侧表面。若移植完全失败，则在宿主的背侧或腹侧表面均无法观察到移植物存在的任何迹象（图5B）。当将未经辐照的组织成功移植至经致死剂量辐照以清除干细胞的宿主后不久，通过原位杂交检测Smed-piwi-1可发现，干细胞主要存在于移植物内部（图5C）。此外，将未经辐照的组织成功移植至经致死剂量辐照的宿主，可实现宿主组织的修复，并使宿主长期存活13,1415。
<img alt="X射线照射示意图；培养皿中的涡虫；用于研究的阴极管装置及铅屏蔽。" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 局部照射基本组件的总体布置。 在具有顶部放置的X射线源（阴极管）的X射线辐照仪中，将麻醉后的涡虫置于X射线源正下方的照射区域内。为最大化X射线剂量率，应尽量缩短涡虫与X射线源之间的距离。应在阴极管与麻醉后的涡虫之间放置铅屏蔽，尽可能靠近涡虫。铅屏蔽的设计、制造和放置应确保其遮蔽目标组织，同时完全暴露涡虫的其余部分。许多商业制造商可根据简单的设计图定制铅屏蔽；我们已成功使用Alpha Systems Corp.（Bluffdale, UT）的产品。铅的厚度应足够以实现所需的屏蔽效果。例如，若希望几乎完全屏蔽320 kV的X射线束，则铅厚度应为4.5至6 mm。涡虫和屏蔽物置于铺有经Holtfreter's溶液浸润滤纸的培养皿中，该培养皿放置于冰桶内。若X射线照射区域足够大且具备多个相同的铅屏蔽，可同时对多个样本进行局部照射（图中未示出）。
<img alt="用于植物研究的滤纸、Kimwipe 团、培养皿组成的组织移植装置示意图。" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 构建恢复室。 （A）组织移植后恢复室的分解示意图，显示了经酪蛋白饱和的 Holtfreter 溶液浸泡后各组件依次叠加的结构。（B）接近完成的恢复室，展示了 Whatman #3 滤纸矩形片的交错排列方式，其紧密包裹麻醉后的涡虫，防止其在愈合过程中移动。精心构建的恢复室可有效防止动物移动和干燥，促进快速愈合并提高组织移植的成功率。
<img alt="部分照射和去头对生长的影响；铅屏蔽设置；时间序列图。" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 简单的后部部分照射的代表性结果。 如 Dubois 所述7，(A) 当涡虫的后半部分用铅屏蔽后接受 X 射线照射时，可观察到前部组织回缩至被照射区域与屏蔽区域之间的边界，在此位置形成无色素的原基，动物开始再生。(B) 另一方面，若在 (A) 中相同的部分照射处理后对动物进行去头操作，则未观察到组织回缩现象，残留的被照射前部组织得以保留。这些经过部分照射并去头的动物能够再生出头部 (B)，但与未照射的去头对照组相比，再生过程显著延迟 (C)。
<img alt="Flatworm regeneration experiment, illustrating shielded vs irradiated regions, microscopy image." src="/files/ftp_upload/4015/4015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 部分照射后部分干细胞消融的代表性结果。 整体装片 原位 杂交（WISH）检测干细胞标志物 Smed-piwi-1 显示野生型涡虫的干细胞分布于全身，但光感受器前的组织（箭头）和咽部本身（星号）除外14.（A）用于 WISH 的 Smed-piwi-1 在照射后三天固定且完全屏蔽的对照组涡虫中，干细胞分布与野生型涡虫无法区分。(B) 另一方面，WISH检测显示 Smed-piwi-1 在仅部分屏蔽、前部和后部仍暴露的动物中，辐照后三天进行固定，结果显示非屏蔽区域的干细胞已被消除。比例尺为 500 微米。
<img alt="涡虫移植物移植研究示意图，显示使用 Smed-piwi-1 标记物时成功与失败的移植物。" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 组织移植成功与失败的示例。 （A）移植后第三天成功移植涡虫的背侧和腹侧活体图像。移植物（已标注）在背侧和腹侧表面均清晰可见，并在移植物-宿主交界处周围出现特征性的无色素组织。（B）相应地，失败的移植在移植部位（已标注）未见明显移植物组织，而仅显示因移植失败所形成的愈合性、无色素的侧向伤口。当移植物仅附着于背侧或腹侧表面时，从一侧观察可能类似于成功的移植（A），而从另一侧观察则可能类似于失败的移植（B）。（C）将野生型（wt）组织移植至经照射处理、其内源性干细胞已被清除的宿主体内，在移植后两天通过 WISH 检测 Smed-piwi-1 以显示移植的干细胞；移植是否成功可通过干细胞特异性地出现在移植物部位或其周围（箭头所示）而明确判断。比例尺为 500 微米。

<ol><li>Morgan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Entw.+Mech.+Org%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 Forthcoming.</li>
<li>Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Randolph, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regeneration+of+the+tail+in+lumbriculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The regeneration of the tail in lumbriculus.</a> J. Morphol. 7, 317-344 Forthcoming.</li>
<li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li>
<li>Santos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transplantation+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Studies on transplantation in planaria.</a> Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).</li>
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<li>Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+%C3%A1+l+%27%C3%A8tude+de+la+migration+des+cellules+de+r%C3%A8g%C3%A8n%C3%A8ration+chez+les+Planaires+dulcicoles%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Biol.+Fr.+Belg%22%5BJournal%5D)">Contribution á l 'ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles.</a> Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).</li>
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<li>Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+specifically+labels+the+regenerative+stem+cells+of+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians.</a> Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).</li>
<li>Miller, W., Kennedy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+attenuation+in+lead%2C+aluminum%2C+and+concrete+in+the+range+275+to+525+kilovolts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts.</a> Radiology. 65, 920-925 (1955).</li>
<li>Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li>
<li>Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+planarian+X-ray-sensitive+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).</li>
<li>Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMEDWI-2+is+a+PIWI-like+protein+that+regulates+planarian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells.</a> Science. 310, 1327-1330 (2005).</li>
<li>Stéphan-Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+de+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ration+chez+la+planaire+Dendrocoleum+lacteum%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+de+la+Soci%C3%A9t%C3%A9+Zooologique+de+France%22%5BJournal%5D)">Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum.</a> Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).</li>
<li>Gurley, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+secreted+Wnt+pathway+components+reveals+unexpected+complexity+of+the+planarian+amputation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response.</a> Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).</li>
<li>Salvetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cell+plasticity%3A+neoblast+repopulation+in+non-lethally+irradiated+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians.</a> Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

固定化的重要性
固定是成功完成这些过程中的任何一步最为关键的环节。如果在部分照射前涡虫固定不当，它们可能会移动到铅屏蔽下方，导致结果不一致且相互干扰。此外，如果在移植后动物固定不充分，宿主涡虫很可能会移离移植物组织，导致移植物无法正常愈合到宿主体上。适当的固定可通过调节氯醛糖（chloretone）处理的浓度或时长，以及涡虫所处滤纸的温度和湿度来实现。0.2%浓度的氯醛糖处理最长可达半小时似乎并无毒性，但如此时长的处理可能诱发咽部外翻。在此期间，涡虫保持静止，便于进行部分照射。我们的经验表明，湿度相较于氯醛糖处理是更为关键的因素——滤纸过湿则动物容易移动；过干则动物会脱水。在任何情况下，滤纸应完全浸透，但不应达到在容器内或表面形成积水的程度。可轻轻摇晃培养皿以去除多余液体。用于浸透滤纸的液体用量无疑需根据具体环境湿度进行调整。
移植速度
速度对于提高局部照射和移植的效率至关重要。局部照射后的动物固定时间越长，发生损伤或组织完整性受损的风险就越高，这可能会影响特定检测结果的准确性。移植...

<table><tbody><tr><td>通用移液管</td><td>Samco</td><td>691</td><td></td></tr><tr><td>毛细管（内径 0.75 mm）</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>毛细管（外径 0.7 mm）</td><td>FHC</td><td>30-50-08</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸 34155</td><td>VWR</td><td>500029-891</td><td></td></tr><tr><td>黑色滤纸</td><td>Schleicher Schuell</td><td>10310809</td><td></td></tr><tr><td>Whatman #2 滤纸 1002-055</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-810B</td><td></td></tr><tr><td>Whatman #3 滤纸 1003-185</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-820E</td><td></td></tr><tr><td>卷烟纸</td><td>Zig-Zag, original</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>82050-544</td><td></td></tr><tr><td>杜蒙特不锈钢镊子 #5</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Chloretone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112054</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3400</td><td></td></tr><tr><td>铅屏蔽罩</td><td>Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>XRAD-320 生物辐照仪</td><td>Precision X-Ray, North Branford, CT</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

涡虫固定、局部照射与组织移植

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

涡虫是一种淡水扁形虫，已被证明是研究后生动物再生和干细胞生物学的有力模型1,2。涡虫能够再生任何缺失或受损的组织，这依赖于一类称为新胚细胞（neoblasts）的成体干细胞3。尽管已有确凿证据表明这些干细胞具有多能性，并且单个细胞即能重建整个生物体4，但干细胞群体内部的异质性及其细胞行为的动态变化在很大程度上仍未阐明。由于干细胞数量众多且广泛分布于整个涡虫体轴，因此迫切需要先进的方法来在活体（in vivo）条件下对干细胞亚群进行分子和功能层面的操作与研究。
组织移植和局部照射是分离涡虫干细胞亚群以进行进一步研究的两种方法。每种技术都有其独特的优势。组织移植能够将本质上具有遗传差异的干细胞或经药物处理过的干细胞引入到未经处理的宿主中。相比之下，局部照射能够在宿主体内实现干细胞的隔离，使其与无干细胞组织相邻，同时避免造成伤口或破坏组织完整性。利用这两种方法，可以研究调控干细胞功能（如增殖、分化和迁移）的细胞自主性与非自主性因素。
组织移植5,6和部分照射7在历史上曾被用于阐明许多至今仍在研究中的涡虫再生相关问题。然而，由于以往方法繁琐且结果不稳定，这些技术一直未能得到广泛应用。本文所介绍的方案在显著减少所需时间和工作量方面迈出了重要一步，能够高效、可重复地产生大量移植或部分照射的动物，成功率接近100%。我们涵盖了大型涡虫的培养、固定、部分照射前准备、组织移植以及动物恢复的优化。此外，本文所述工作首次将部分照射方法成功应用于目前研究最广泛的涡虫物种Schmidtea mediterranea。同时，涡虫中高效的组织移植技术为功能验证未经处理或经处理的干细胞亚群在重群体化检测中的作用打开了大门，而重群体化检测长期以来一直是哺乳动物成体干细胞潜能检测的金标准方法8。这些技术的广泛采用无疑将促进人们对成体干细胞在组织稳态与再生过程中细胞行为的深入理解。

本文描述了一种在涡虫之间移植大小明确且一致的组织的有效方法。此外，还介绍了如何将移植过程中使用的固定技术与铅屏蔽结合，用于活体动物的局部照射。

涡虫是一种淡水扁形虫，已被证明是研究后生动物再生和干细胞生物学的有力模型系统1,2。涡虫……

以下实验的总体目标是将一群健康的干细胞定位在寄生虫体内经干细胞消融处理的组织附近，以在体内分析再生过程中干细胞及其子代细胞的行为。该目标通过麻醉并固定未经辐照或经叶片辐照的寄生虫以进行后续操作来实现。接着，将固定的未经辐照的寄生虫部分用铅屏蔽，然后进行X射线辐照，从而产生一个未受损伤的寄生虫，其体内干细胞被消融的组织与仍富含干细胞的屏蔽区域相邻。或者，可将来自未经辐照供体的组织移植物移植到先前经辐照的受体中，以产生具有孤立干细胞群体的嵌合体。此时，在原本干细胞已被清除的受体中，通过整体RNA原位杂交检测干细胞标志基因，可获得显示孤立干细胞群体邻近于干细胞清除组织的结果。因此，本文所述方法旨在通过研究干细胞在移植范式和部分照射范式中的行为，更深入地理解涡虫的再生过程。这些范式使我们能够检验干细胞所处的周围组织和局部微环境是否会影响这些新细胞（neoblasts）或干细胞的行为。在再生过程中，实验前一至两个月，应根据随附的手稿喂养涡虫。为获得本演示中所需大小，选择体长一至二厘米、宽度超过两毫米的涡虫。然后在使用前饥饿处理 3 至 7 天。接下来，通过将 0.1% 至 0.2%（质量/体积）的氯胺酮（cleone）溶解于生理盐水中，配制氯胺酮溶液作为温和的局部麻醉剂。将溶液置于冰上冷却。使用本生灯进行组织移植操作时，将内径为 0.75 毫米的毛细管在距末端 1 至 2 厘米处弯成 90 度角，用于切割移植物组织。然后取另一根外径为0.7毫米的毛细管，在距末端1至2厘米处弯成90度角，用于在宿主体内打孔以植入移植物。接着，根据随附文稿中指示的尺寸，裁剪黑色滤纸（Watman）、三号滤纸（Kim wipe）以及卷烟纸。随后，配制改良的 Holt Fers 溶液和 Caine 饱和 Holt Fretter 溶液，并将两者冷却至 4 摄氏度。然后将一张折叠的 Kim 擦拭纸固定在一片 Paraform 上。将其置于解剖显微镜下的帕尔贴冷却板或其他冷却装置上。随后用冰冷的Holt Fretter溶液浸湿Kim擦拭纸。然后在Kim擦拭纸上放置两块黑色滤纸矩形片。现在将一张沃特曼2号滤纸放入培养皿中。用Holt Fretter溶液润湿滤纸。然后将培养皿置于冰上冷却，以进行部分照射。将较大的纸衬放入较大的培养皿中，类似于组织移植操作。用Holt Fretter溶液润湿滤纸，然后将培养皿置于冰上冷却。在此步骤中，用冰冷的cleone溶液填充培养皿。用移液器将涡虫转移至培养皿中以进行移植。每次仅对一个受体和一个供体进行麻醉。对于局部照射，可同时对多只动物进行麻醉。然后将水螅放入刺胞溶液中浸泡5到10分钟，直至其完全静止不动。用移液器将水螅转移至盛有预冷的Holt Fretter溶液的培养皿中清洗。随后，将黑滤纸浸入预冷的 Holtfreter 溶液中，用移液器将胚胎转移至饱和滤纸上以固定其位置。然后用镊子将其腹面朝下摆放。现在，将先前准备好的预冷培养皿放入冰桶中，置于顶部放射源 X 射线照射仪内。通过移动黑色滤纸，将麻醉后的 plin 区域在培养皿中排列整齐。然后将其转移至顶部 X 射线辐照仪，并放置冰桶，使阴极管与 paria 之间的距离最小化，从而最大化有效剂量率。然后在斑马鱼与阴极管之间放置铅屏蔽板，以进行X射线照射。若需完全消除未屏蔽区域的干细胞，应给予30戈瑞或更高的剂量。X射线照射后立即将斑马鱼转移至预冷的斑马鱼养殖用水中。此后，让帕里安水升温至室温，使动物自行从黑色滤纸上脱落。部分照射程序至此完成。接下来在解剖显微镜下开始该操作：将已麻醉的宿主和供体幼虫分别放置在Kim擦拭纸上预先冷却过的帕尔帖或冷却板上的两片独立的矩形黑色滤纸上。使用内径为0.75毫米的毛细管从供体切取移植物小柱。然后用一对镊子将其放置在宿主上不碍事的区域。再使用外径为0.7毫米的毛细管从宿主去除一个小柱。随后将移植物置于孔中。将移植后的宿主转移到事先准备好的培养皿中的矩形黑色滤纸上。用卡因饱和的霍尔特弗雷特溶液润湿一张卷纸。然后将其放置在移植的受体上方。接着，用四片浸透饱和霍尔特溶液的滤纸包裹，并在移植受体后续步骤中，另用四团剪裁过的Kim擦拭纸包裹饱和的Holt Fretter溶液并浸透。将这些擦拭纸铺在滤纸之上。之后，盖上盖子。将培养皿置于冰上。然后将供体愈伤组织转移到愈伤组织恢复液中进行恢复和再生。完成所有移植操作后，将移植后的菖蒲置于10摄氏度的培养箱中过夜。次日早晨，将其转移至含有菖蒲培养液的培养皿中。让菖蒲自行从滤纸上脱落，或用镊子小心将其取下，并在此之后每两到三天更换一次菖蒲培养液。在照射后第三天固定的、经过全屏蔽处理的对照组涡虫中进行原位杂交，其干细胞分布与野生型涡虫无法区分。另一方面，对于仅部分屏蔽、使前后区域暴露的涡虫，非屏蔽区域的干细胞似乎已被消融。此处显示的是成功移植涡虫的背侧和腹侧视图。移植后三天，在背侧和腹侧表面均可清晰观察到移植物，移植物与宿主交界处周围可见特征性的无色素组织。然而，移植失败的样本在移植部位则无法观察到明显的移植物组织。整体原位杂交结果显示，仅在成功移植的样本中，移植物位置及其周围检测到干细胞的存在，这表明移植已成功。每例移植手术仅需五分钟即可完成。随着成功率接近90%至100%，且可实现局部照射，移植规模可大幅扩大，前提是您的照射设备照射区域足够大。

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