涡虫固定、局部照射与组织移植

以下实验的总体目标是将一群健康的干细胞定位在寄生虫体内经干细胞消融处理的组织附近，以分析再生过程中干细胞及其子代在体内的行为。该目标通过麻醉并固定未经辐照或经叶片辐照的寄生虫以进行后续操作来实现。接下来，将固定的未经辐照的寄生虫部分用铅屏蔽，然后进行X射线辐照，从而产生一个未受损伤的寄生虫，其体内干细胞被消融的组织与仍富含干细胞的屏蔽区域相邻。

或者，可将来自未经辐照供体的组织移植物移植到先前经辐照的受体中，以产生仅含孤立干细胞群体的嵌合体。最终获得的结果显示，在干细胞被消融的组织旁，存在孤立的干细胞群体，可通过全组织RNA原位杂交检测干细胞标记基因来确认。

因此，本文所述方法旨在通过研究干细胞在移植模型和部分辐照模型中的行为，进一步理解涡虫的再生机制，从而检验干细胞所处的周围组织及其局部微环境是否影响这些新细胞（neoblasts）或干细胞的行为。在再生过程中，实验前一至两个月，根据随附的手稿喂养涡虫。为获得本演示所需的尺寸，选取长度为一至二厘米、宽度超过两毫米的涡虫。

然后在使用前饥饿处理三到七天。接下来，通过将0.1%至0.2%（质量/体积）的氯胺酮溶解于石蜡油中，配制氯胺酮溶液作为温和的局部麻醉剂。将溶液置于冰上冷却。使用本生灯进行组织移植操作时，将内径为0.75毫米的毛细管在距末端一至二厘米处弯成90度角，用于切割移植物组织。

然后取另一根外径为0.7毫米的毛细管，在距离末端1至2厘米处弯成90度角，用于在宿主体内打孔以植入移植物。接下来，按照随附文稿中所示尺寸，裁剪黑滤纸（Watman）、三号滤纸（Kim wipe）和卷烟纸。

随后，配制改良的 Holt Fers 溶液和 Caine 饱和的 Holt Fretter 溶液，并将两者均冷却至 4 摄氏度。然后将一张折叠的 Kim 擦拭纸固定在一块 Paraform 上。

将其置于解剖显微镜下的帕尔帖冷却板或其他冷却装置上。随后用预冷的Holt Fretter溶液浸湿Kim擦拭纸。然后在Kim擦拭纸上放置两块黑色滤纸矩形片。

现在将一张沃特曼二号滤纸放入培养皿中，用霍尔特-弗雷特溶液润湿滤纸，然后将培养皿置于冰上冷却，以进行部分照射。

将较大的纸衬放入较大的培养皿中，类似于组织移植操作。用 Holt-Fretter 溶液润湿滤纸，然后将培养皿置于冰上冷却。

在此步骤中，用冷却的克列酮溶液填充培养皿。用移液器将涡虫转移至培养皿中以进行移植。每次仅对一个受体和一个供体进行麻醉处理。

对于局部照射，可同时对多只动物进行麻醉。然后将海兔放入氯化钠溶液中浸泡5到10分钟，直至其完全静止不动。用移液管将海兔转移至盛有预冷的Holt Fretter溶液的培养皿中进行冲洗。

随后，将黑滤纸浸入预冷的 Holtfreter 溶液中，用移液器将胚胎转移至饱和滤纸上以固定其位置。然后用镊子将其腹面朝下摆放。现在，将之前准备好的预冷培养皿放入冰桶中，置于顶部放射源X射线辐照仪内。

通过移动黑色滤纸，将麻醉后的 plin 区域在培养皿中排列整齐。然后将其转移至顶部 X 射线辐照仪，并放置冰桶，使阴极管与 paria 之间的距离最小化，从而最大化有效剂量率。

然后在斑马鱼与阴极射线管之间放置铅屏蔽板，以进行X射线照射。若需完全消除未屏蔽区域的干细胞，应给予30戈瑞或更高的剂量。X射线照射后立即将斑马鱼转移至预冷的斑马鱼养殖用水中。

此后，让帕里安水升温至室温，使动物自行从黑色滤纸上脱落。局部照射程序至此完成。要在解剖显微镜下开始此操作，将已麻醉的宿主和供体幼虫区域分别放置在Kim擦拭纸上预先冷却过的帕尔贴或冷却板上的两片矩形黑色滤纸上。

使用内径为 0.75 毫米的毛细管从供体中切取移植物小柱。然后用一对镊子将其放置在宿主上一个不碍事的区域。接着使用外径为 0.7 毫米的毛细管从宿主中移除一个小柱。

随后将移植物置于孔中。将移植后的宿主转移到事先准备好的培养皿中的矩形黑色滤纸上。用卡因饱和的霍尔特弗雷特溶液润湿一张卷纸。

然后将其放置在移植的受体上方。接着，将四片包裹饱和霍尔特溶液的滤纸浸透，如果移植的受体随后需要，再将四团剪裁过的、包裹饱和霍尔特弗雷特溶液的Kim擦拭纸浸透。将这些擦拭纸铺在滤纸之上。

之后，盖上盖子。将培养皿置于冰上。然后将供体愈伤组织转移到愈伤组织恢复液中进行恢复和再生。

完成所有移植后，将移植好的小球藻置于10摄氏度的培养箱中过夜。次日早晨，将其转移至含有小球藻培养液的培养皿中。让小球藻自行从滤纸上脱落，或用镊子轻轻取下，并在此后每两到三天更换一次小球藻培养液。

在照射后第三天进行固定、经过完全屏蔽的对照组涡虫的原位杂交结果显示，其干细胞分布与野生型涡虫无法区分。另一方面，对于仅部分屏蔽、使前后区域暴露的涡虫，干细胞似乎在未屏蔽区域被消除。此处展示了成功移植涡虫的背侧和腹侧视图。

移植后第三天，移植物在背侧和腹侧表面均清晰可见，并在移植物与宿主交界处周围被特征性的无色素组织所包绕。然而，失败的移植在移植部位则无可见的移植物组织。整体原位杂交结果显示，仅在移植物位置内部或周围存在干细胞，这表明移植已成功。熟练掌握该技术后，即可实现稳定结果。

每次移植操作可在五分钟内完成。在假设辐照仪的照射区域足够大的情况下，其成功率接近 90% 至 100%，且部分照射可大幅扩大规模。