手术消融分析在研究涡虫再生眼

该协议示出如何一致切除涡眼（光杯），而不干扰周围的组织。使用胰岛素针和注射器，任一个或两个的眼睛可以被烧蚀以促进调查调节眼再生，再生视觉的演变，和光诱导行为的神经基础的机制。

该程序的总体目标是演示如何在不干扰大脑或周围组织的情况下可靠地移除涡虫视杯，以便各级教育的研究人员和学生都可以实施该技术。这种方法可以帮助回答再生领域的关键问题，例如确定调节体内内源性眼干细胞维持和分化的机制。这种技术的主要优点是它允许研究人员只去除眼组织，而对其他组织的干扰最小。

一般来说，在刚接触这种方法的人能够可靠地去除正确数量的组织之前，需要进行练习，从而消融整个眼睛，同时避免消融周围组织。首先，选择至少一周未喂食且长度至少为 5 到 7 毫米的蠕虫。将 15 到 30 条蠕虫转移到装满蠕虫水的 100 毫米培养皿中，其中有三分之二装满蠕虫水，并立即更换盖子。

观察蠕虫是否有缺失或未着色的组织，例如白色的头部或白色尾巴，以确保它们未受损且最近没有再生。首先，用 70% 乙醇溶液擦拭工作区和解剖显微镜底座，并使其完全干燥。将装有选定蠕虫的培养皿放在显微镜的左侧。

然后，在显微镜的右侧，放置一对 5 号镊子、一个 31 号 5/16 英寸的胰岛素针头和一个 1 毫升注射器、一个干净的移液管和一个用于收集消融蠕虫的标记 12 孔板。放置一盒不起毛的组织湿巾、一个装满新鲜蠕虫水的塑料洗瓶和额外的移液管，以便在手术过程中方便取用。将 Peltier 板放置在解剖显微镜底座的中心，并将输出设置为直流电源，使 Peltier 板表面足够冷却以固定蠕虫。

或者，可以使用装满冰的培养皿代替 Peltier 板。为了准备手术表面，首先剪下一块 5 厘米 x 10 厘米的塑料石蜡膜，然后将其放在帕尔贴板的中心。接下来，将无绒纸巾折叠成约 2 厘米的正方形，然后将其放在胶片上。

然后，将折叠的湿巾固定到位，用蠕虫水润湿，然后用移液管将湿巾卷平。最后，剪下一张 1.5 到 2 厘米见方的白色滤纸，放在抹布上。要开始手术，请使用移液管将一个蠕虫背侧朝上放在滤纸上。

打开灯并将其光束对准蠕虫。调整解剖显微镜的焦距和放大倍率，使蠕虫的眼睛清晰可见。旋转石蜡膜以调整蠕虫的位置，使其头部指向研究人员并向右倾斜 30 至 40 度。

如果蠕虫位于腹侧朝上，并且咽口可见，请使用镊子的钝侧轻轻地将蠕虫的位置更改为背侧朝上，同时可以看到眼睛。重新调整显微镜设置，使眼睛清晰聚焦。还要确保眼睛和周围的头部组织都在视野中。

右手用拇指和食指夹住一个干净的注射器。用左手拇指支撑注射器的底部，支撑在 Peltier 板上。通过显微镜观察以确保针头的斜面可见。

将左手食指放在手术表面上，使其与左手拇指成 40 度角，以确保手术过程中表面保持稳定。将针头与眼睛成 90 度角，针头的斜面朝上。用针尖轻轻穿透覆盖在眼罩上的薄组织层，可见为白色、无色素区域。

从右向左舀取，非常轻柔地去除位于视杯内的任何黑色色素组织以及所有白色组织。如果进行双眼消融术，请立即消融第二只眼。完成手术后，用少量蠕虫水回装移液器，然后将水释放到蠕虫上以将其从滤纸上提起。

立即将蠕虫吸入移液管中。将蠕虫移动到贴有标签的 12 孔板中，其中三分之二装满新鲜蠕虫水。转移所有蠕虫后，用新鲜的蠕虫水替换井中的水来清洗它们。

将蠕虫避光在 20 摄氏度的培养箱中孵育，并监测再生过程。要处死活蠕虫，请从板中取出蠕虫水，并用 70% 乙醇代替。将蠕虫孵育 3 到 5 分钟，观察蠕虫是否裂解并变成灰色。

这里展示的是接受双眼消融术和单眼消融术的扁虫的照片，拍摄于手术前、手术后 4 天和手术后 2 周。这些图像展示了随时间推移的再生过程。消融蠕虫的眼睛再生也通过抑制蛋白和新开发的光感受器神经元的免疫组织化学染色得到证实。

还在基于野生型对光的畏光反应的功能测定中研究了双眼消融后扁虫视觉系统的恢复。消融后 24 小时，无眼蠕虫不避光并穿过光点。手术后 7 天恐惧症恢复，表明再生的视觉系统功能正常。

一旦掌握，一条蠕虫的双眼消融手术大约需要三分钟。消融时，重要的是要切除眼睛的所有有色和未着色组织，同时确保不要损坏眼睛之间的组织或稍后将组织撕裂到眼睛中。按照这个程序，可以执行其他方法，如免疫组织化学和 RNA 干扰，以检查特定基因的作用及其再生过程。

此外，可以进行行为测定以测试再生后的眼功能。看完这个视频后，您应该对如何在不干扰周围组织的情况下切除涡虫眼有一个很好的了解。不要忘记使用针头工作可能很危险，应采取预防措施，例如戴手套和保持针头指向远离您的地方。