Name: 电脑断层导引的时域漫荧光体层摄影术在小动物的肿瘤生物标志物的本土化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 了解电脑断层导引的时域漫荧光体层摄影术在小动物肿瘤生物标志物成像中的应用。该方法结合荧光与X射线成像技术，可在胶质瘤小鼠模型中实现表皮生长因子受体表达的高灵敏度可视化，为临床前肿瘤研究提供有力工具。

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本工作获得了美国国家癌症研究所资助项目 R01 CA120368、R01 CA109558（KMT、RWH、FEG、BWP）、RO1 CA132750（MJ、BWP）和 K25 CA138578（FL），以及加拿大卫生研究院博士后奖学金（KMT）的支持。荧光断层成像系统的开发部分由加拿大魁北克省蒙特利尔市的Advanced Research Technologies公司资助。

1. 动物准备
<ol>
 <li>通过腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪（100 mg/kg : 10 mg/kg i.p.）对裸鼠（Charles River, Wilmington, MA）进行麻醉。</li>
 <li>将小鼠固定于立体定位仪中，在颅骨左侧头皮做一切口，并使用18号针头在距中线2 mm、前囟后方2 mm处钻出直径为1 mm的颅骨孔。</li>
 <li>将5×105个U251人源神经胶质母细胞瘤细胞（由美国新罕布什尔州汉诺威达特茅斯学院Mark Israel博士惠赠）悬浮于5 μL磷酸盐缓冲液中，注入左侧大脑半球，进针深度约为脑表面下2 mm。使用Hamilton微量注射器18和钝头27号针头植入细胞，针尖插入颅骨外表面以下3 mm，然后回撤1 mm，以形成供细胞植入的腔隙。</li>
 <li>缝合切口，并让小鼠术后恢复。</li>
 <li>等待约14天，使肿瘤充分生长，然后进行成像。</li>
</ol>
2. 荧光断层成像系统校准
<ol>
 <li>在小鼠成像当天，启动系统并让激光器和光探测器预热约20分钟，以避免系统灵敏度发生漂移。</li>
 <li>将一个100°×4°的工程线性扩散器（Thorlabs, Newton, NJ）置于成像支架正中央，使其垂直于激发激光：即一个皮秒脉冲、80 MHz多模635 nm激光二极管（PicoQuant Photonics North America Inc., Westfield, MA）。调节扩散器的角度，以最大化所有五个光收集通道检测到的信号量。有关成像几何结构的完整描述见其他文献11,14,15。</li>
 <li>在所有荧光检测用光电倍增管（PMT）前方放置OD 2中性密度滤光片（Thorlabs, Newton, NJ），在所有透射检测用PMT前方放置OD 1中性密度滤光片（Thorlabs, Newton, NJ）。采集100次激光的时间脉冲展宽曲线（TPSF），每次积分时间为1秒。</li>
 <li>使用激光参考信号对每个TPSF进行归一化，校正激光参考信号的时间漂移，并对每个探测器的所有迭代结果取平均。这些平均后的TPSF即为光学图像重建中所用的探测器特异性仪器响应函数（IRF）。</li>
</ol>
3. 成像方案
<ol>
 <li>使用氧气（1 L/min）中的 2% 异氟烷对小鼠进行麻醉。 </li>
 <li>注射1纳米摩尔IRDye 800CW-EGF和1纳米摩尔Alexa Fluor 647 100 μl 在成像前12小时，通过腹腔注射磷酸盐缓冲液，以靶向肿瘤中表皮生长因子受体的过表达。 </li>
 <li>将小鼠放置于成像床的玻璃纤维支撑上，调整小鼠位置，使其鼻部保持在输送异氟烷麻醉气体的鼻锥内。 </li>
 <li>确保小鼠在床面上的位置适当： 即，当床体固定到荧光断层成像系统时，小鼠应大致位于成像机架的中心位置。该定位可通过旋转激发激光器进行引导 180° 确保激光的焦点从激光器各个角度照射时，均大致位于小鼠的中心位置。 </li>
 <li>定位完成后，小心地将成像床及小鼠转移至 microCT（eXplore Locus，GE Healthcare，London，ON）扫描仪中，并以 93- 的分辨率采集解剖学信息μm 小鼠整个头部的各向同性 </li>
 <li>可视化 CT 图像序列，并选择需使用荧光断层成像系统进行成像的切片。 </li>
 <li>小心地将成像床和小鼠移回荧光断层成像系统。从步骤3.6的CT图像序列中选择每个成像切片所需采集的小鼠数据的光源位置数量（32）、每次TPSF测量的积分时间（1 s）、每个光源位置的迭代次数（10），以及目标成像切片的位置和数量。括号中的数值为各成像参数的典型取值，可使每个成像切片的数据采集时间约为5分钟。 </li>
 <li>在荧光检测PMT前放置三陷波滤光片（Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT），以阻止激光进入荧光检测器，同时在透射检测PMT前放置OD 2中性密度滤光片，以避免这些检测器发生饱和。 </li>
 <li>运行数据采集软件，在每个定义的光源-探测器位置以及每个激发波长（635 nm 和 755 nm，分别用于激发 Alexa Fluor 647 和 IRDye 800CW-EGF 示踪剂）下采集荧光和透射率TPSFs。对于每组采集的TPSFs，使用参考PMT通道监测并记录激光强度。 </li>
</ol>
4. 图像重建
<ol>
 <li>根据CT图像确定小鼠的外表面以及成像床支撑杆的位置，并分别创建覆盖小鼠轮廓和成像杆区域的掩膜。</li>
 <li>利用小鼠掩膜，使用NIRFAST软件19生成动物的有限元网格。</li>
 <li>基于微CT与荧光空间配准坐标20，将荧光断层成像系统的光源和探测器位置定位在网格表面。</li>
 <li>剔除与成像床支撑杆位置相互重叠的光源或探测器所对应的光学数据点。</li>
 <li>以激光参考信号对每个源-探测器位置采集的数据进行归一化，校正激光参考信号的时间漂移，并根据采购时通过实验测定的滤光片灵敏度进行校正15。</li>
 <li>对每个源-探测器位置的数据计算Born比值（荧光信号除以透射信号），并乘以基于有限元动物网格在均匀光学参数条件下模拟的透射前向模型。该步骤用于减小光源或探测器与组织耦合相关误差21，实现数据与模型的校准22，并校正其他因素引起的模型与数据不匹配23,24。</li>
 <li>构建一个数据向量，其成分为两个波长下采集的Born比值数据的缩放差值。缩放因子的选择旨在最大化EGFR结合对比度。以每个检测通道的时间域点扩散函数（TPSF）作为输入，使用校准后的差分数据进行时间域图像重建，并生成对比增强靶向示踪剂的荧光分布图15。</li>
</ol>
5. 代表性结果
小鼠头部U251原位胶质瘤模型的荧光重建图像与共同配准的CT解剖图像叠加示例展示如下 图1b由荧光重建确定的胶质瘤质心图1b）位于通过对比增强磁共振成像确定的肿瘤质心1 mm范围内图1a）。CT 与 MRI 图像基于互信息变换进行配准。
<img src="/files/ftp_upload/4050/4050fig1.jpg" alt="脑部扫描对比，MRI 与 PET；箭头指向肿瘤，突出显示诊断成像的差异。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 小鼠头部的增强对比（钆剂）磁共振成像（a）。该小鼠通过原位接种人胶质瘤细胞系 U251 建立模型。肿瘤位于左脑半球（图像右侧），因吸收的对比剂多于正常脑组织，可在图像中清晰可见，并由白色箭头指示。图（b）显示了同一小鼠头部位置的相应计算机断层扫描图像，其中叠加了靶向表皮生长因子的荧光信号减去非靶向荧光重建的结果。荧光信号的单位为 mm⁻¹，其数值与结合态靶向荧光的吸收系数、量子效率及其浓度的乘积相关。

<ol><li>Rudin, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in drug discovery and development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 2, 123-131 (2003).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

荧光断层成像（FT）是一种基于可见光和近红外光在生物组织中传输的敏感、无电离辐射的分子成像方式。目前对FT的研究兴趣主要集中在其加速小动物实验模型中药物发现与开发的潜力1，其中一个重要研究方向是癌症生物标志物表达及其对分子治疗的响应26。目前，FT系统设计存在两种相互竞争的技术路线。最常见的设计采用冷却式电荷耦合器件（CCD）相机进行荧光检测4-9。该设计可提供高密度的测量数据，从而最大化组织采样，因为CCD相机的每个像素均可检测到穿过组织特定路径的光信号。然而，CCD相机的动态范围有限，且读出噪声限制了其最终灵敏度。第二种设计则通过采用基于光电倍增管或雪崩光电二极管等探测器的高灵敏度单光子计数技术，避免了CCD相机检测的潜在局限10-13。这些更高灵敏度检测方法的缺点在于每个探测器只能在单一点位收集光信号；因此，为了实现密集的组织采样，要么需使用大量探测器（成本极高），要么需用同一探测器采集多个投影（耗时较长）。尽管目前尚未就小动物FT所需的理想组织采样水平达成共识，且该水平可能因具体情况而异，但学界普遍认为，单光子计数仪器更适合用于探索FT在检测低浓度分子标志物方面的灵敏度极限。在本研究中，我们提供了一种利用单光子计数检测仪器在小鼠中定位肿瘤的荧光断层成像方法。
利用时间相关单光子计数荧光断层成像技术（FT）生成可靠数据集包含四个关键步骤。第一步是采用适当且简便的校准程序。在本方法中，通过采集激发光穿过线性漫射器后的基线信号来校正各检测通道的相对灵敏度，该漫射器可将等量的光引导至每个探测器15。此外，通过激光参考通道的操作，实验过程中检测到的光信号在强度和平均时间两个方面持续相对于激光参考进行校准，以补偿随时间可能发生波动的激光输出11,15。第二步是精确采集并共同配准解剖结构图像，以指导荧光重建。仅凭FT数据本身无法提供解剖信息；因此，为了建立光传输模型，从而根据样品表面检测到的荧光信号重建样品内部荧光源的位置，必须准确定义样品相对于FT系统的解剖结构。在本系统中，解剖信息由微型计算机断层扫描系统获取，并且其空间坐标已与FT系统的坐标实现空间配准15,20。第三步是确保在每个光源-探测器位置均采用最佳曝光（即每个激光投射对应的总光子检测时间）。这一步至关重要，原因有二：一是确保每个检测位置具有足够的信噪比，二是避免探测器饱和，后者可能损坏检测单元。为在每个探测器位置实现最佳曝光，系统采用了自动曝光控制技术，该技术本质上通过两次低信号曝光来三角定位最优曝光参数14。该方法的第四步是将采集的荧光数据归一化至透射激发光的强度。这种归一化处理通常称为Born比，为荧光断层成像带来诸多优势，最主要的是可显著减轻模型与数据之间的不匹配误差23,24。本系统设计为可同时检测荧光信号和透射激发光，方法是将每个检测通道的光路分别导入两个独立的光电倍增管。通过这种方式，我们避免了样品移动对Born比准确性的影响。
在拥有可靠数据集的情况下，时域数据的图像重建涉及求解具有如下表达式的有限元网格的逆问题：
d=Jx
其中 d 是一个向量，具有 n x m n 个源-探测器投影的元素 m TPSF 时间门控； J 是一个 n x m-由-l 灵敏度矩阵（或雅可比矩阵），用于 l 网格中的节点；以及 x 是每个节点中荧光光学特性的向量，具有大小 l. d 是实验过程中收集的校准数据 J 采用有限元法对荧光传输的时间域扩散近似进行求解，以实现模拟25时间维度 J 还与探测器特定的仪器响应函数进行卷积。 x 是所关注的荧光图谱的表征，通过采用Tikhonov正则化的Levenberg-Marquardt非负最小二乘法求解。15. 
本文所述方法采用高灵敏度光子计数荧光检测技术，可实现对小鼠体内荧光标记肿瘤的定位，有望突破荧光成像（FT）的技术极限。在先前的研究中，已证实该方法在大于小鼠的动物模型（如大鼠）中的应用潜力，以及在小鼠尺寸样本中相比现有系统设计所具备的更高灵敏度。17该方法的直接应用将是用于生物标志物表达的监测 体内 在小型动物肿瘤模型中以高通量方式评估药物疗效。该系统能够在多个波长下激发并检测荧光，从而实现对多种荧光标记物的同步检测。额外的荧光标记物可同时用于探究病理学的多个方面，或如本研究所示，用于采用更定量的成像方法，例如双报告基因检测法进行测量 体内 结合势能，一种受体密度的标志物26,27.

<table><tbody><tr><td>IRDye 800CW-EGF</td><td>LI-COR 生物科学</td><td>926-08446</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 琥珀酰亚胺酯</td><td>Life Technologies</td><td>A20106</td><td>与水反应以尽量减少非特异性结合</td></tr></tbody></table>

小动物中用于癌症生物标志物定位的计算机断层扫描引导时域漫射荧光断层成像

Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

小动物荧光分子成像（FMI）可成为临床前药物发现与开发研究中的强大工具1。然而，组织中的生色团（如血红蛋白、水、脂质、黑色素）对光的吸收通常会限制光信号在数毫米以上厚度组织中的传播2。与其他可见光波长相比，红光和近红外（近-IR）光在组织中的吸收显著降低，非弹性散射成为光与组织相互作用的主要机制。近年来，随着能够吸收并发射近红外范围（600–1000 nm）光的荧光探针的出现，推动了成像系统及光传播模型的发展，使得在小动物体内实现全身三维成像成为可能3。
尽管该领域已取得显著进展，但漫射荧光断层成像的病态性问题仍然是影响图像重建技术稳定性、对比度恢复能力及空间分辨率的主要障碍，目前尚未就小动物荧光分子成像（FMI）的最佳方法达成共识。大多数研究团队采用基于电荷耦合器件（CCD）的系统，这类系统可提供丰富的组织采样，但灵敏度次优4-9；而我们团队及少数其他团队10-13则致力于采用极高灵敏度探测器的系统，但目前这类系统仅能在牺牲较低成像通量的前提下实现密集的组织采样。本文展示了在荧光断层成像系统中应用单光子探测技术，以在小鼠模型中定位脑部癌性病灶的方法学。
采用单光子计数光电倍增管（PMT）和信息丰富的时域光检测的荧光断层成像（FT）系统，以非接触构型工作11这实现了激发光和发射光的同步采集，并包含自动荧光激发曝光控制功能14，激光定位，以及与小动物计算机断层扫描（microCT）系统的共配准15采用裸鼠模型进行成像。将人胶质瘤细胞系（U251）原位接种于小鼠左侧大脑半球，两周后进行成像。通过注射靶向表皮生长因子受体（一种在U251肿瘤细胞系及多种其他癌症中高表达的细胞膜蛋白）的荧光示踪剂IRDye 800CW-EGF（LI-COR Biosciences, Lincoln, NE），使肿瘤产生荧光信号。18另一种非靶向性荧光示踪剂Alexa Fluor 647（Life Technologies，Grand Island，NY）也被注射，以校正非受体介导的示踪剂摄取效应，从而提供一种量化示踪剂结合及受体可用性/密度的方法。27采用CT引导的时域算法重建两种荧光示踪剂的位置即，小鼠脑内肿瘤的位置），并通过对比增强磁共振成像验证了其定位肿瘤的能力。
尽管本视频中展示的是在胶质瘤小鼠模型中的荧光成像应用，但该方法可拓展至多种小型动物模型中的不同肿瘤模型，潜在适用动物体型可达大鼠大小17。

扩散荧光断层成像为临床前研究提供了一种相对低成本且潜在高通量的方法 体内 肿瘤成像。本文介绍了在小鼠胶质瘤模型中，利用荧光靶向肿瘤生物标志物表皮生长因子受体，结合计算机断层扫描引导的非接触式时间域系统，进行光学数据采集、校准及图像重建的方法学。

小型动物荧光分子成像（FMI）在临床前药物发现与开发研究中可发挥强大作用1。然而，光...

以下实验的总体目标是在原位胶质瘤小鼠模型中生成表皮生长因子受体表达的荧光图像。该目标通过将表达绿色荧光蛋白的人源U251胶质瘤细胞接种至A IIC小鼠的左侧大脑半球来实现。在肿瘤生长两周后，向小鼠注射两种荧光示踪剂的混合物。随后将小鼠置于小动物X射线系统中成像，以采集准确图像重建所需的解剖学数据。这些数据用于在解剖学上定位光学断层成像系统的光源并确定探测器的位置，同时使用定制软件采集荧光数据并构建最终图像。最终，该方法可结合荧光成像与X射线成像，基于肿瘤对表皮生长因子的过表达来构建肿瘤图像，其准确性可与对比增强磁共振成像进行比较。与现有的电荷耦合器件式小动物荧光断层成像等方法相比，该技术的主要优势在于，采用光电倍增管进行单光子计数检测，可显著提高光检测的灵敏度和动态范围。该方法最终可用于通过检测分子靶标的表达情况，监测并评估分子治疗的效果。虽然皮下肿瘤可通过非断层成像的表面成像方法轻松实现成像，但本系统能够对数厘米厚的组织进行穿透成像，因此特别适用于脑肿瘤中成像对比、示踪剂递送及渗漏情况的观察。尽管该方法可为癌症生物标志物的表达提供见解，但也适用于其他疾病研究，如感染、肥胖或阿尔茨海默病等衰老相关因素。通常，初学者会因光在生物组织中传播的散射特性以及在漫射光重建中使用X射线断层扫描的困难而遇到挑战。因此，对该方法的可视化演示至关重要。由于数据采集和图像重建步骤较难掌握，确保从荧光系统收集的数据经过良好校准非常重要。近红外快速软件包旨在读取光学数据，并利用X射线断层扫描图像生成有限元网格，该网格作为荧光重建的空间模板。开始时，将一只麻醉的裸鼠置于无菌手术单上，在继续操作前确认麻醉深度，并清洁和消毒切口区域的皮肤。使用聚维酮碘对切口部位进行消毒，然后铺上无菌手术巾。使用手术刀在中线略偏左侧、眶间线后方0.5厘米处做一个小切口。清除颅骨表面的结缔组织，以暴露颅骨表面，便于识别解剖标志。颅骨暴露后，使用无菌的1毫米钻头在高速钻机上操作，在中线左侧2毫米、bgma后方2毫米处钻出一个孔。使用带有平头27号针头的Hamilton Micros注射器吸取待移植的细胞。然后将小鼠固定于立体定位仪上。接着通过脚趾夹捏试验确认小鼠已达到充分的外科麻醉深度，并为动物重新铺好手术巾。接下来，将装好样品的注射器固定在立体定位仪上。将注射器置于颅骨孔洞上方，将针尖插入颅骨表面以下3毫米处。随后，将针头回撤1毫米，以形成一个空腔。下一步是在五分钟内缓慢地将细胞注入左侧大脑半球。注射完成后，拔出针头，并用碘伏擦拭穿刺孔。为防止细胞在注射部位以外生长，将小鼠从立体定位架上取出，并用预热的骨蜡填充暴露的孔洞。最后，用无菌5-0尼龙缝线缝合切口部位。将小鼠放回加热的笼子中，并监测至其完全恢复；恢复后，通过腹腔注射给予小鼠130微升浓度为0.1毫克/千克的丁丙诺啡，并在成像前让肿瘤生长14天。在小鼠成像当天，启动系统，使激光器和光探测器预热约20分钟。为避免漂移和系统灵敏度变化，在成像机架正中心放置一个100度乘以4度的工程线性扩散器，以使激发激光在系统的各个检测通道中均匀分散。手动调节扩散器的角度，以最大化所有五个光收集通道检测到的信号量。接下来放置光学密度。在所有用于荧光检测的光电倍增管（PMT）前方放置两个中性密度滤光片，以及用于透射光检测的光电倍增管前方放置一个中性密度滤光片。每个激光器依次工作，PMT 对激光信号采集 100 个时间脉冲展宽函数（TPSF），每次积分时间为 1 秒。对每个 TPSF，依据激光参考信号进行归一化处理，以校正激光参考信号的时间漂移，并对每个探测器和每个激光器分别进行多次迭代后的结果取平均。这些平均TPS是光学图像重建中所用的探测器特异性仪器响应函数，需在成像操作前12小时确定。向测试小鼠注射荧光示踪剂混合物。荧光断层成像系统的精确校准以及限制动物运动是该操作中最困难的两个方面。成像重建过程具有高度的病态性，即使数据采集过程中存在微小误差，也可能导致重建图像出现显著偏差。为确保采集数据的准确性，我们尽可能固定小鼠，并在扫描前后重复校准，以提高获得准确校准结果的可能性。准备就绪后，将麻醉后的动物放置于成像床的玻璃纤维支撑物上。将动物头部置于鼻罩内以进行持续气体麻醉后，固定其门齿于咬合杆上，并用胶带固定动物。小鼠应大致位于成像设备的中心位置。可通过将激发激光围绕小鼠旋转180度来辅助定位，确保从激光各个角度观察时，激光焦点始终照射在小鼠大致中央的位置。正确放置后，小心地将成像床及小鼠转移至微型 CT 扫描仪，以 93 微米各向同性分辨率采集小鼠整个头部的解剖学信息。可视化 CT 图像序列，并选择需用荧光断层成像系统进行成像的切片。随后小心地将成像床和小鼠重新转移回荧光断层成像系统。选择每个成像切片的光源位置数量、每次TPSF测量的积分时间、每个光源位置的迭代次数，以及从先前创建的CT图像堆栈中确定所需成像切片的位置和数量。接下来，在荧光检测PMT前放置滤光片，以阻隔所有激发光，并在透射检测PMT前放置中性密度滤光片。为避免这些探测器饱和，运行数据采集软件，在两个激发波长下，于每个定义的光源-探测器位置采集荧光和透射tPSF数据。对于每组采集的 T psfs，使用参考 PMT 通道监测并记录激光强度。确定小鼠的外表面以及成像床的位置。根据 CT 图像中的支撑杆创建掩膜，覆盖小鼠和成像杆的范围。另外，使用小鼠掩模，通过近快速软件生成动物的有限元网格。根据微型CT和荧光空间配准坐标，将荧光断层成像系统的光源和探测器位置定位在网格表面。剔除与成像床位置相互作用的光源或探测器位置相关的光学数据点。支撑杆通过激光参考值对每个源-探测器位置采集的数据进行归一化，校正激光参考值的时间漂移，并校正由购买时实验测试确定的滤光片灵敏度。计算每个源-探测器位置数据的玻恩比值，并将其乘以基于有限元动物网格在均匀光学特性下的透射率正向模型模拟结果。此步骤旨在减小与光源或探测器与组织耦合相关的误差，将数据校准至模型，并调整模型与数据之间的其他不匹配因素，从而构建一个由两个波长下采集的玻恩比值数据经缩放后的差值组成的数据向量。选择缩放因子以最大化 EGFR 结合对比度，利用每个检测通道的 TPSF 作为输入，基于校准后的差异数据进行时域图像重建，并生成所观察到的对比度增强靶向示踪剂的荧光分布图。以下是一个荧光重建图像的示例，该图像与一只携带 U251 原位胶质瘤的小鼠的共配准 CT 解剖图像重叠显示。通过荧光重建确定的胶质瘤质心与通过对比增强磁共振成像确定的肿瘤质心位置相差在 1 毫米以内。该设备的数据采集软件为定制开发，但大多数图像处理技术可使用 nearfasts.org 网站提供的近快速软件完成。因此，在执行此操作时，必须确保在图像重建之前，系统和数据均已准确校准。该校准需要考虑探测器之间的灵敏度和时间差异。在完成针对生物标志物的示踪剂图像重建后，需进行上述校准步骤。对非靶向示踪剂进行类似的成像可校正非受体介导的摄取，从而在方法建立后实现对示踪剂结合量以及体内受体密度的定量分析。该技术的出现启发了其他研究人员设计出X射线成像引导的荧光断层成像系统，并为大型动物的全身成像铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何开展漫反射荧光断层成像实验，该实验结合了X射线解剖成像与光学成像系统，用于癌症生物标志物的成像研究。

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