电脑断层导引的时域漫荧光体层摄影术在小动物的肿瘤生物标志物的本土化

以下实验的总体目标是在原位神经胶质瘤小鼠模型中生成表皮生长因子受体表达的荧光图像。这是通过用表达人 U2 51 神经胶质瘤细胞的绿色荧光蛋白接种 A IIC 小鼠的左脑半球来实现的。肿瘤生长两周后，向小鼠注射两种荧光示踪剂的混合物。

然后在小动物 X 射线系统上对小鼠进行成像，以收集准确图像重建所需的解剖数据。这些数据用于解剖学定位光源和检测光学断层扫描系统的位置，并使用定制软件来收集荧光数据并构建最终图像。最终，该方法可以使用荧光和 X 射线成像基于表皮生长因子的过表达构建肿瘤图像，其准确性可以与对比增强磁共振成像进行比较。

与电荷对、基于器件的小动物荧光断层扫描等现有方法相比，该技术的主要优点是，使用光电倍增管的单光子计数检测为光检测提供了更高的灵敏度和动态范围。这种方法最终可用于监测、通过测量分子疗法靶点的表达来衡量分子疗法的成功，而皮下肿瘤则很容易使用表面成像的非断层扫描方法进行成像。该系统旨在对厚达几厘米的组织进行成像，使其特别适用于成像、造影剂、药物输送和脑肿瘤渗漏。

虽然这种方法可以提供对癌症生物标志物表达的见解，但它也可以应用于其他疾病研究，如感染、肥胖或衰老因素，如阿尔茨海默氏症。通常，由于光在生物组织中传播的漫射性质以及使用 X 射线断层扫描进行漫射光重建的困难，刚接触这种方法的人会遇到困难。这种方法的视觉演示至关重要。

由于数据收集和图像重建步骤可能难以学习，因此确保从荧光系统收集的数据经过良好校准非常重要。近快速软件包旨在读取光学数据并使用 X 射线断层扫描图像创建有限元网格，该网格用作荧光重建的空间模板。首先，将麻醉的无胸腺裸鼠放在无菌手术单上并确认麻醉深度，然后对切口区域的皮肤进行清洁和消毒。

使用 Betadine 使用手术刀将无菌手术单放在切口部位，在中线稍左侧和眼内线后 0.5 厘米处做一个小切口。通过清除任何结缔组织来清洁颅骨表面，以便识别标志。颅骨暴露后，使用带有无菌 1 毫米钻头的高速钻头在中心线左侧 2 毫米和 bgma 后方 2 毫米处打一个孔。

用钝头 27 号针头将要植入的细胞装入 Hamilton Micros 注射器。接下来，将鼠标放在立体定位框架上。然后用脚趾捏确认一个深的手术和美容平面，并更换动物身上的手术单。

接下来，将加载的注射器固定到立体定位框架上。将注射器放在颅骨上的孔上，然后将针尖插入颅骨表面以下 3 毫米处。接下来，将针头抽出 1 毫米以形成一个口袋。

下一步是在 5 分钟内将细胞缓慢注射到左大脑半球。注射完成后，拔出针头并用 Betadine 擦拭孔。为防止细胞在注射部位外生长，请从立体定位框架中取出鼠标，并用预热的骨蜡填充暴露的孔。

最后，用无菌 5 oh 尼龙缝合线闭合切口部位。将鼠标放回加热的笼子中并监测直至恢复后恢复，向小鼠注射 130 微升 0.1 毫克/公斤丁丙诺啡 IP，并在成像前让肿瘤生长 14 天。在小鼠成像当天，启动系统，让激光器和光检测器预热约 20 分钟。

为避免漂移和系统灵敏度，请在成像机架的直接中心放置一个 100 度 x 4 度的工程线扩散器，以将激发激光以相等的强度分散在系统的检测通道之间。手动调整扩散器的角度，以最大限度地提高所有五个光收集通道检测到的信号量。接下来是光密度。

所有荧光检测光电倍增管前面的两个中性密度滤光片，称为 PMT 和光密度。一个中性密度滤光片位于所有透射率检测之前。PMT 依次收集激光器的 100 个时间脉冲扩展函数或 T psfs，每个函数每个激光器有一秒的积分时间，通过激光参考校正激光参考中的时间漂移对每个 TPSF 进行归一化，并分别对每个检测器和每个激光器的所有迭代进行平均。

这些平均 TPS 是在成像程序前 12 小时用于光学图像重建的探测器特定仪器响应函数。向测试小鼠注射荧光示踪剂混合物。准确校准荧光断层扫描系统和限制动物运动是该程序最困难的方面。

影像重建非常糟糕，以至于即使数据收集中的微小错误也可能导致重建影像中出现重大错误。为确保收集到准确的数据，我们尽可能固定鼠标，并在扫描前后重复校准，以提高获得准确校准的机会准备就绪。将麻醉的动物放在成像床的玻璃纤维支架上。

将头部放入鼻腔进行连续气体麻醉后，将牙齿固定在咬合杆上并用胶带固定动物。鼠标应放置在成像机架的大致中心。可以通过将激发激光器绕鼠标旋转 180 度来引导此定位，确保激光的焦点从激光的角度在所有角度上大致照亮鼠标中心的一个点。

正确定位后，小心地将成像床和鼠标转移到微型 CT 扫描仪上，并以 93 微米各向同性的分辨率收集小鼠整个头部的解剖信息。可视化 CT 图像堆栈并选择要使用荧光断层扫描系统成像的切片。小心地将成像床和鼠标转移回荧光断层扫描系统。

选择每个成像切片的源位置数、每个 TPSF 测量的积分时间、每个源位置的迭代次数，以及之前创建的 CT 图像堆栈中所需成像切片的位置和数量。接下来，在荧光检测 PMT 前面放置滤光片，以阻挡透射率检测 PMT 前面的中性密度滤光片的所有激发光和光密度。为避免这些检测器饱和，请在两个激发波长下在每个定义的源检测器位置运行数据采集软件，收集荧光和透射率 t psfs。

对于收集的每组 T psfs，使用参考 PMT 通道监测和记录激光强度。确定鼠标的外表面和成像床的位置。从 CT 图像中支撑杆并创建覆盖鼠标和成像杆范围的掩码。

另外，使用鼠标遮罩，使用 near fast 软件生成动物的有限元网格。根据显微 CT 和荧光空间配准坐标，将荧光断层扫描系统的源和检测器位置定位在网格表面。删除与成像床位置相互作用的源或探测器位置相关的光学数据点。

支撑杆通过激光参考对在每个光源检测器位置收集的数据进行归一化处理，校正激光参考中的时间漂移和滤光片灵敏度，这些灵敏度是通过购买时的实验测试确定的。取每个源探测器位置的数据的 born 比率，然后乘以基于有限元动物网格的透射率正演模型模拟，以获得均匀的光学特性。这样做是为了减少与源或检测器组织耦合相关的误差，将数据校准到模型，并针对模型数据不匹配的其他方面调整数据，构建一个由在两个波长收集的出生比数据的缩放差异组成的数据向量。

选择缩放因子以最大化 EGFR 结合对比度，使用每个检测通道的 TPSF 作为输入，使用校准的差异数据进行时域图像重建，并创建所见的对比增强靶向示踪剂的荧光图。这是一个荧光重建示例，该图像与来自 U2 51 原位神经胶质瘤肿瘤小鼠的共同注册 CT 解剖图像重叠。通过荧光重建确定的神经胶质瘤质心在肿瘤质心的 1 毫米以内，通过对比增强磁共振成像确定。

用于数据采集的软件是为该设备定制的，但大多数图像处理技术都可以使用 near fasts 软件 available@nearfasts.org 来完成。因此，在尝试此过程时，重要的是要确保在图像重建之前准确校准系统和数据。这种校准要求在生物标志物靶向示踪剂的图像重建之后考虑检测器之间的灵敏度和时间差异。

非靶向示踪剂的类似成像提供了一种校正非受体介导的摄取的方法。这允许在显影后量化示踪剂结合的量以及体内受体密度。这项技术激发了其他研究人员设计 X 射线成像引导荧光断层扫描系统，并为大型动物的全身成像铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何进行漫射荧光断层扫描实验有一个很好的了解，该实验结合了 X 射线解剖成像和光学成像系统，用于癌症生物标志物成像。