NOG小鼠中多发性骨髓瘤骨髓异种移植的多模态生物发光与正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像
2019年1月7日
在此，我们采用生物发光、X射线以及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像技术，研究抑制mTOR活性对异种移植模型中骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的影响。该方法可对靶向骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的治疗手段的抗骨髓瘤效应进行符合生理条件的、无创的和多模态的分析 体内.
该方法可用于解答有关骨髓微环境在骨髓瘤移植肿瘤存活中作用的关键问题。此实验方案的主要优势在于，可将其应用于纵向抗药物研究，并以非侵入性方式检测多种生物化学通路。实验当天，首先将8226 Luciferase转染细胞在冰上预冷的PBS中洗涤三次，每次以200 RCF离心五分钟，然后将细胞沉淀重悬于新鲜的冰上预冷PBS中，每只小鼠接种体积为200 µL，细胞浓度为5 × 10⁶ 个细胞/200 µL冰上预冷PBS。
随后确认麻醉后的4至6周龄NOG小鼠对脚趾夹捏无反应，并在动物眼睛上涂抹眼用软膏。将细胞加入配备26号针头的1毫升胰岛素注射器中。将全部细胞悬液注射至动物尾静脉，然后将小鼠放回笼中，监测直至完全恢复。
接种后10至20天，向每只移植动物腹腔内注射200微升无菌生理盐水中的体内级D-荧光素底物。注射后5至10分钟内，将麻醉后的动物仰卧位放置于小动物成像系统中。在相应的成像软件中测量所选感兴趣区域的平均辐射通量。
对于8226 Luciferase肿瘤的靶向治疗，在如上所述测量每只动物的基线生物发光信号后，将动物随机分配至不同的治疗组，并对每只小鼠进行一系列200微升腹腔注射Temsirolimus或生理盐水对照。每周测量两次Luciferase活性，并绘制生物发光随时间变化的曲线。为检测肿瘤代谢的变化，首先从小鼠的饲养笼中移除食物，禁食24小时，以避免过量的非特异性放射性标记物Fludeoxyglucose摄取。
第二天，将500至100微居里的18氟放射性标记的氟脱氧葡萄糖探针用无菌生理盐水稀释，每只小鼠注射体积为100微升，并使用剂量校准仪记录探针的时间和活度。探针准备就绪后，将第一只麻醉动物置于加热垫上，头部朝外，使用带有26号针头的屏蔽式1毫升胰岛素注射器，向尾静脉注射100微升探针。用剂量校准仪测量针头和注射器中的残留放射性，并记录活度和时间。
然后在小动物PET-CT成像系统中，测量与移植肿瘤相对应的选定感兴趣区域内的放射性标记氟脱氧葡萄糖活性。如图所示，可通过生物发光成像确认骨髓肿瘤移植是否成功。对多只动物进行连续成像，可用于观察骨髓移植的多发性骨髓瘤肿瘤的分布情况。
此外，光学成像与X射线分析可快速、无创地确定多发性骨髓瘤肿瘤在小鼠骨骼中的精确位置和分布情况。通过移植的肿瘤细胞产生的生物发光信号，可进行连续且无创的测量，以评估肿瘤生长的变化。此外，可监测接受mTOR抑制剂替西罗莫司治疗的小鼠的存活情况，并可通过正电子发射断层扫描与计算机断层扫描分析肿瘤对放射性标记氟脱氧葡萄糖的摄取，从而证实替西罗莫司对葡萄糖代谢的调控作用。
进行此操作时，重要的是将细胞注射到尾静脉内。我们发现，若未将细胞注入静脉，会导致在注射部位附近形成未植入骨髓的肿瘤细胞。完成此操作后，可采用其他方法（如免疫组织化学和显微CT）来研究肿瘤对骨结构的影响，以及骨髓微环境中非肿瘤细胞及其分子组分的相关问题。
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概述
本研究利用生物发光、X射线以及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像技术，研究mTOR抑制对异种移植模型中骨髓植入的骨髓瘤肿瘤的影响。该方法可实现对体内骨髓瘤肿瘤治疗效果的无创、多模态分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 免疫学
- 生物医学成像
背景
- 骨髓微环境在肿瘤存活中起着至关重要的作用。
- 骨髓瘤肿瘤可在动物模型中移植以供研究。
- 无创成像技术对于纵向研究至关重要。
- 了解mTOR的作用可能有助于开发更优的治疗策略。
研究目的
- 评估mTOR抑制对骨髓瘤肿瘤的影响。
- 探究骨髓微环境对肿瘤行为的影响。
- 建立一种用于长期抗肿瘤药物研究的方法。
使用的方法
- 移植性骨髓瘤细胞的生物发光成像。
- 用于解剖结构可视化的X射线成像。
- 用于代谢评估的正电子发射断层扫描/计算机断层扫描。
- 将转染荧光素酶的细胞注射到NOG小鼠体内。
主要结果
- 抑制 mTOR 活性对肿瘤生长显示出显著影响。
- 非侵入性成像为肿瘤动态提供了深入见解。
- 纵向研究揭示了骨髓微环境的作用。
- 该方法可用于评估多条生化通路。
结论
- mTOR 抑制可有效改变骨髓瘤的肿瘤行为。
- 非侵入性成像技术是癌症研究中的有力工具。
- 需要进一步研究以探索其治疗意义。
常见问题
行业重要性概述
这种多模态成像方法能够在生理相关的骨髓微环境中，对肿瘤生长和代谢进行长期、无创的评估，弥补了临床前骨髓瘤模型中的一个关键空白。通过结合生物发光与PET/CT检测，该方法支持对靶向肿瘤-基质相互作用的治疗候选物进行机制性风险评估。该方法通过将mTOR抑制作用与随时间推移可测量的肿瘤生物发光和葡萄糖代谢变化相联系，为目标验证提供了可预测的信心。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过测量肿瘤生物发光的变化，直接反映体内表达荧光素酶的骨髓瘤细胞的存活力，从而验证治疗假设。
- 操作价值：通过连续、无创的成像实现功能靶点验证，减少对终点组织学分析的依赖。
- 预测价值：通过将mTOR抑制作用与肿瘤信号持续降低相关联，表明靶点结合及通路调控，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备：通过建立移植肿瘤的基线生物发光和代谢通量，为后续化合物筛选准备经过验证的异种移植模型。
- 定量输出：从PET/CT生成纵向生物发光信号和标准摄取值（SUV）指标，支持剂量-反应和时间进程分析。
- 平台复用：支持在多个治疗周期中对多种生物化学通路进行可扩展评估，无需重复牺牲动物。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：模拟人类多发性骨髓瘤的骨髓微环境，其中肿瘤存活依赖于体外无法重现的基质相互作用。
- 转化连续性：通过生物发光成像（BLI）将早期靶点调控与后续代谢效应（通过FDG-PET）关联，支持基于生物标志物的决策判断。
- 风险调控的推进：实现对治疗效果的纵向监测，在具有临床相关性的微环境中验证作用机制，从而减少后期研发失败风险。
流程与工作流整合
该方法可融入从靶点验证到先导化合物优化的整个发现流程，可在与疾病相关的系统中提供药理学活性的正交验证。
- 发现生物学：通过量化通路抑制剂作用下肿瘤负荷和代谢活性的变化，阐明骨髓微环境中靶点的依赖性，支持假设验证。
- 筛选：提供即用型检测模型，具有可重复的移植效果和可检测的信号，可在多个时间点实现高保真度的化合物评估。
- 分析：提供双模态读数——生物发光用于检测肿瘤体积，FDG-PET用于检测代谢通量，使研究团队能够区分细胞抑制与细胞毒性的效应。
- 转化研究：将早期药效动力学变化与临床前疗效终点相连接，支持从作用机制到最终结果的连续性研究。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像平台，用于在肿瘤学产品线中评估依赖基质的靶点，最大化模型开发的投资回报率。
运营与企业影响
- 科学价值：通过将靶点抑制作用与肿瘤生长和葡萄糖代谢的同步变化相关联，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过可重复的成像方案标准化纵向数据采集，最大限度降低个体动物间的变异性。
- 战略价值：提供靶点介导的肿瘤调控的早期定量证据，从而优化决策流程，减少对无效候选药物的投资。
- 组合影响：能够在微环境准确的模型中，对表现出持续靶点结合的化合物进行基于风险调整的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备异种移植模型构建、生物发光成像以及小动物PET/CT操作与分析方面的专业知识。
- 依赖于可进行生物发光和PET/CT成像的设备系统，以及放射性标记FDG和D-荧光素处理的相关基础设施。
- 需要在体内药理学、成像和数据分析团队之间实现跨团队标准化，以确保感兴趣区域选择与定量的一致性。
- 在扩展至其他肿瘤模型时需考虑适应性问题，因为不同细胞系及微环境可能影响移植效率和信号稳定性。
- 实际限制因素包括覆盖组织对信号的衰减，以及为减少非特异性摄取而在FDG注射前需进行禁食处理，如实验方案中所述。
