Name: 荧光介导的断层扫描对巨噬细胞相关小鼠肠道炎症的检测和定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 了解荧光介导断层扫描技术在小鼠结肠炎模型中检测肠道巨噬细胞浸润的应用。该方法可实现炎症性肠病分子标志物的无创纵向监测，为研究疾病机制和治疗效果提供重要工具。

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感谢 Sonja Dufentester 女士、Elke Weber 女士和 Klaudia Niepagenkämper 女士提供的出色技术协助。

所有动物实验均根据德国动物保护法（Tierschutzgesetz）获得北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局（LANUV）的批准。
1. 材料与实验设置
<ol>
	<li>动物护理。
	<ol>
		<li>使用体重为20-25 g、性别和年龄相匹配的任何对DSS敏感品系的小鼠（例如，C57BL/6）。</li>
		<li>每个实验组至少计划使用五只或更多小鼠，并根据当地动物护理指南进行饲养。</li>
		<li>提供标准啮齿类动物饲料和高压灭菌的饮用水，自由摄取（ad libitum）。</li>
		<li>在扫描前至少三天，移除标准饲料并替换为无苜蓿饲料，以减少管腔内自发荧光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>急性DSS诱导结肠炎的建立。
	<ol>
		<li>将2 g DSS（分子量约40,000 Da）溶解于100 mL高压灭菌饮水中，配制成2%（w/v）溶液。</li>
		<li>仅向小鼠提供该DSS溶液作为饮用水，每只小鼠每日预计消耗5 mL。对照组小鼠则给予不含DSS的相同饮用水10。 
		注意：实验期间每日监测小鼠状态直至实验结束。根据当地适用的动物福利指南，对体重减轻超过初始体重20%或出现濒死状态（即持续弓背姿势、活动减少、呼吸困难、毛发明显竖立）的小鼠实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光介导断层成像的准备。
	<ol>
		<li>按照制造商说明书，将目标抗体（例如，大鼠抗小鼠F4/80）标记荧光染料（例如，Cyanine7，λexcitation：750 nm，λemission：776 nm）。将纯化的抗体置于适当的透析膜（截留分子量 &#60; 50-100 kDa）中，用1 L 0.15 M氯化钠溶液透析至少2小时或过夜。
		<ol>
			<li>将抗体转移至1 L 0.1 M NaHCO3 溶液中，继续透析至少2小时。</li>
			<li>将所需量的荧光染料溶解于二甲基亚砜（DMSO）中（10.8 µL/mg抗体），然后加入抗体溶液。使用摩尔浓度20倍过量的荧光染料，以获得染料与蛋白比例为1:3的标记产物。</li>
			<li>在4 °C避光孵育1小时。通过透析（使用1 L 0.15 M氯化钠溶液）或PD-10脱盐柱去除未结合的染料，并将标记后的抗体重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中用于体内应用。</li>
			<li>通过分光光度法测定最终抗体浓度和标记比率。</li>
			<li>在250–330 nm波长范围内测定蛋白浓度时，需考虑染料的额外吸收。对于Cyanine7标记，应从280 nm处的最大吸收值中扣除750 nm处最大吸收值的11%，以校正蛋白在280 nm处的真实吸收。</li>
			<li>测定化合物稀释液（通常为1:10）在250–800 nm范围内的吸收值，并提取750 nm处Cyanine7的浓度。</li>
			<li>染料与蛋白比率计算公式如下：染料/抗体 = （750 nm处最大吸收值 / 200,000）/ [（280 nm处最大吸收值 - 0.11 × 750 nm处最大吸收值）/ 170,000]。</li>
			<li>将抗体溶液保存于4 °C，避光存放，防止注射前发生光漂白。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在注射前立即用无菌注射器吸取所需抗体溶液，并在使用前保持避光。</li>
		<li>根据示踪剂的药代动力学，确定探针注射与扫描程序的最佳时间点。</li>
		<li>使用1.5–2.5%氧气混合的吸入式异氟烷麻醉小鼠，或将其稳妥固定于专用束缚装置中，以便进行尾静脉注射标记抗体。</li>
		<li>对于全长抗体，应在扫描前至少24小时注射标记抗体，例如用于小鼠结肠炎模型中抗小鼠F4/80巨噬细胞的可视化。通过尾静脉静脉注射（i.v.）给予每只小鼠相当于2.0 nmol染料剂量的标记抗体。</li>
		<li>使用相同标记的非特异性抗体（例如，大鼠IgG或与一抗来源相对应的其他同型抗体）作为同型对照，剂量与特异性探针一致。 
		注意：体内注射对照化合物后的扫描结果可作为解释特异性探针成像数据的参考依据。</li>
		<li>使用电动剃刀剃除小鼠腹部区域的毛发，以最大限度减少光的反射和吸收。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 技术设备
<ol>
	<li>使用兽用荧光介导断层成像（FMT）设备进行小动物荧光成像 图4).</li>
	<li>为每个项目点击创建一项新研究 &#34;新研究&#34; 按钮，并在研究描述中包含相关示踪剂信息，以及成像参数和剂量，以供将来参考。</li>
	<li>在本研究中，根据相应研究设计建立研究分组（例如， 针对特异性示踪剂和非特异性同型对照）通过点击 &#34;新研究组&#34; 按钮。为每个研究组配备相应数量的动物。</li>
	<li>校准示踪构建体的系统。
	<ol>
		<li>对每批示踪剂进行校准，以校正标记效率的差异，并实现从光学成像数据中进行定量测量。</li>
		<li>遵循仪器制造商关于各个系统校准的指导说明；在选定后 &#34;添加新的示踪剂，&#34; 系统将引导完成各个步骤。提供所用抗体溶液的稀释倍数以及探针中示踪剂的计算绝对浓度。</li>
		<li>对于FMT，使用具有确定厚度和吸收特性的仿组织模型（类似活体组织），并用特定体积的抗体溶液填充。在FMT设备上进行测量。 
		注意：该系统将结合所提供探针的参考测量值与给定浓度，计算后续实验中示踪剂的绝对浓度 体内 测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用可加热的检查盒，温度设置为 42 °C。 
	注意：这可以防止小鼠在检查过程中出现低体温。</li>
</ol>
3. 动物麻醉
<ol>
	<li>使用1.5–2%体积浓度的异氟烷（[2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷]）与1.5 L/min的氧气，持续通气2/min 以麻醉小鼠。使用专为啮齿类动物麻醉设计的吸入式麻醉系统（异氟烷蒸发器），以便轻松控制麻醉深度，并最大限度减少对操作人员的暴露。</li>
	<li>将小鼠放入防漏的诱导室中，打开异氟烷蒸发器（100% (v/v)，5% 体积浓度氧气，3 L/min）。持续观察小鼠，直至其侧卧且失去意识。</li>
	<li>将其置于断层扫描用检查暗盒中，通过鼻罩持续吸入异氟烷，剂量为100% v/v，1.5 vol% 溶于氧气，流速1.5 L/min，以尽量减少检查过程中因动物移动产生的伪影。对于持续时间超过5分钟的操作，需在小鼠眼部涂抹眼膏，以防止角膜损伤。</li>
	<li>通过检查反射评估麻醉深度。将小鼠仰卧放置；若麻醉充分，小鼠不应翻转体位。轻捏小鼠脚趾间部位；若麻醉充分，其腿部不会回缩（达到外科手术耐受阶段）。</li>
</ol>
4. 荧光介导断层扫描
注意：根据所使用的替代荧光反射成像设备或FMT系统，对本研究中FMT系统的具体参数（见材料表）进行相应调整。
<ol>
	<li>将麻醉后的小鼠仰卧放置于检测盒中。</li>
	<li>执行扫描程序。
	<ol>
		<li>将检测盒插入成像系统并立即关闭，以确保持续麻醉。从先前创建的研究组中选择相应的样本。从下拉菜单中选择所使用的示踪剂，以确保示踪剂浓度值被正确计算。</li>
		<li>在适当波长下（Cyanine7 为 720 nm）获取荧光反射图像用于扫描规划，并通过点击 &#34;获取图像&#34; 按钮划定扫描区域。</li>
		<li>确认扫描区域作为叠加层显示在荧光反射图像上。将其调整至感兴趣区域（e.g., 结肠或腹部），避免包含空气或残留毛发的区域。根据成像目标，在右侧菜单中选择粗、中或精细扫描分辨率，以设定扫描区域内数据点的数量。 
		注意：请注意，精细扫描分辨率虽可提供更高的空间分辨率，但会显著延长扫描时间。</li>
		<li>通过点击 &#34;扫描&#34; 开始在选定波长下进行数据/图像采集。 
		注意：对整个腹部进行中等至精细扫描所需时间约为 5 分钟；在此期间，每个数据点将被激发激光单独照射，并记录所产生的荧光信号。</li>
		<li>扫描结束后将动物从成像盒中取出，并在将其放回笼子前确保其完全恢复。</li>
		<li>若实验需要，可在不同时间点重复进行 FMT 扫描（e.g., 第 0、5 和 9–10 天（实验结束时）），但需考虑抗体在体内的累积效应，这可能导致背景荧光信号增强。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 扫描后处理
<ol>
	<li>将小鼠置于单独的笼子中，笼下垫有纸巾，并放置于红光加热灯下，监测小鼠是否出现不适或痛苦迹象，直至完全恢复。待小鼠完全清醒后，将其放回原有笼具中。</li>
	<li>实验结束时，通过输送 CO 对小鼠实施安乐死2 以100%（v/v）、100 vol%、3 L/min的剂量通入隔离器中。切勿用CO预充满腔室2, 突然暴露于高浓度CO2 可能会引起痛苦。在小鼠停止呼吸后，需通过二次安乐死方式（如快速颈椎脱位）确认其死亡。</li>
	<li>通过腹部剖腹手术取出结肠并进行 离体 按照步骤4.2.1–4.2.4所述，对取出的结肠进行扫描。使用梅岑鲍姆手术剪纵向切开每个结肠，并用生理盐水彻底冲洗，然后进行后续分析的准备工作。</li>
	<li>使用手术刀从远端结肠切取一段0.5 cm的组织片段，并立即放入1.5 mL冻存管中。置于液氮中速冻，随后于-70 °C保存备用。例如，髓过氧化物酶（MPO）检测</li>
	<li>使用木棒从远端向近端卷起其余纵向打开的结肠，使黏膜朝外（&#34;瑞士卷技术&#34;），用于组织学分析。将样本置于固定剂中（参见 材料表）并在 -80 °C 冻存14.</li>
</ol>
6. 数据重建与解读
<ol>
	<li>使用相应成像软件的重建工具，从原始成像数据生成荧光分布的三维图谱；扫描时若启用该功能，扫描数据将自动添加至重建工具中 &#34;添加到重建队列&#34; 被选中。
	<ol>
		<li>否则，从相应研究及研究组下方的下拉菜单中选择扫描图像，右键单击该扫描图像，然后选择 &#34;添加到重建中。&#34;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进一步分析，将数据集载入分析软件。从顶部工具栏的下拉菜单中选择相应研究，然后从右侧菜单中选择研究组别及个体动物；该动物的所有扫描数据将显示出来。选择正确的扫描图像并点击 &#34;加载&#34; 
	注意：示踪剂分布的三维重建结果将作为叠加图像显示在左侧，与最初获取的荧光反射图像重合。该模型可旋转和放大，以便于分析。</li>
	<li>识别非特异性标记物聚集的焦点（例如， 肝脏或尿 bladder）在重建的3D图谱上，并与目标组织区分开例如， 肠道</li>
	<li>从顶部工具栏中选择最适合目标区域的ROI形状。在分析软件中使用相应的测量工具标记目标组织为感兴趣区域（ROI）；软件将提供该ROI的荧光强度，以及根据扫描校准所得到的示踪剂（皮摩尔或摩尔）含量。</li>
	<li>选择在适当ROI中经ROI大小归一化的示踪剂总量，作为评估疾病活动性（与炎性浸润相关，组织学）的最合适指标。 
	注意：如果其他 ROI 特征适合代表特定模型，也可选择使用。</li>
</ol>
7. 离体 分析
<ol>
	<li>苏木精和伊红染色以及免疫荧光染色
	<ol>
		<li>将切片置于70%乙醇（EtOH）中2分钟以脱蜡；随后用蒸馏水冲洗。用苏木精溶液染色5分钟，再用温自来水冲洗10分钟。</li>
		<li>用蒸馏水冲洗，用伊红溶液复染2分钟，再用蒸馏水冲洗。</li>
		<li>置于70% EtOH、96% EtOH、99% EtOH和二甲苯（两次）中各2分钟，以脱水并透明切片。用树脂封片剂封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色
	<ol>
		<li>使用先前获得的组织切片（&#34;瑞士卷&#34;用于免疫荧光染色，并制备7 µm的冷冻切片。</li>
		<li>用5.0%大鼠血清封闭丙酮固定的冷冻结肠切片，10分钟；随后加入稀释（1/500，v/v）的生物素标记的大鼠抗小鼠F4/80一抗，4 °C孵育过夜。用Tris缓冲盐水（TBS）洗涤切片3次，再在含0.1%（w/v）牛血清白蛋白的PBS中加入链霉亲和素-FITC（1:100，v/v），4 °C孵育过夜。</li>
		<li>用 TBS 清洗切片，然后使用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:1000 v/v）染色以获得对比度。在共聚焦显微镜下分析荧光图像（参见 材料表；40倍放大；使用激发波长为515 - 560的N2.1滤光片组，计数每高倍视野中F4/80阳性细胞数。 
		注意：联合使用抗体时，建议采用相同克隆号和相同形式的抗体 体内 FMT 和 死后 组织学分析，如免疫组织化学或免疫荧光染色，具体方法取决于目标分子。用于检测F4/80阳性巨噬细胞 体内 和 离体，使用了不同的格式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结肠样本中MPO的测定
	<ol>
		<li>使用新鲜获取的、经 PBS 冲洗的结肠样本或解冻后的标本进行 MPO 检测。称量所有样本，并在 ELISA 试剂盒提供的裂解缓冲液中匀浆组织（参见 材料表每毫克组织加入20 µL裂解缓冲液。</li>
		<li>超声处理15秒（超声频率：20 kHz，功率：70 W），然后在4 °C、200 × g条件下离心10分钟。</li>
		<li>使用市售的ELISA试剂盒（参见 材料表）按照制造商说明书进行操作。实验重复两次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

尽管近年来医学成像技术发展迅速，但我们仍然难以在炎症过程、肿瘤以及其他疾病发展的最早阶段对其进行检测。然而，这对于理解肿瘤的生长、侵袭或转移形成，以及炎症性疾病和退行性、心血管及免疫系统疾病中细胞过程的发展至关重要。传统成像技术依赖于物理或生理参数，而分子成像则能够实现对特定分子标志物在体内的可视化in vivo20。
在小动物成像中，可利用放射性核素驱动的方法（例如，单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET））、超声成像以及荧光介导成像来可视化特定的分子靶标结构。由于全长抗体作为最常用的示踪剂骨架具有较长的血液循环时间和缓慢的组织渗透性，导致示踪剂注射后成像时间延迟，因此需要持久的标记。典型的成像用放射性核素因而并不适用于抗体分布的体内成像。使用半衰期较长的同位素（如Cu64或In111）虽可实现基于抗体的示踪，但需要复杂的基础设施，涵盖同位素制备、标记过程前后辐射安全防护，以及探针注射后动物的屏蔽饲养。相比之下，更具成本效益且更安全的选择是荧光介导成像...

动物模型在科学研究中被广泛应用，许多非侵入性方法可用于监测疾病活动性和动物活力，例如体重变化的定量分析，或血液、尿液和粪便的检测。然而，这些仅是间接的替代性指标，且易受个体间差异的影响。通常需要通过组织标本的死后分析加以补充，而这阻碍了在多个时间点进行连续观察，以及对生理或病理过程进行在体直接观察。近年来发展出一系列先进的小型动物成像技术，包括断层成像、光学成像和内窥镜技术，这些技术能够直接可视化上述过程，并允许对同一只动物进行重复分析1,2,3。此外，能够在同一只动物身上反复监测多种疾病状态，可能减少实验所需动物数量，从动物伦理的角度来看，这一点具有重要意义。
目前存在多种不同的光学成像技术用于活体荧光成像。最初，共聚焦成像被用于研究表面及次表面的荧光现象4,5。然而近年来，已开发出可实现定量三维组织评估的断层成像系统6。这一进展得益于能够在近红外（NIR）光谱范围内发射光的荧光探针的发展，同时结合了低吸收特性、高灵敏度探测器以及单色光源7。传统断层成像技术（如计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）或超声（US））主要依赖物理参数并用于可视化形态结构，而光学成像则可利用内源性或外源性荧光探针，提供有关潜在分子过程的额外信息8。
分子生物学的进步有助于为越来越多的靶标开发出智能且具有靶向性的荧光分子探针。例如，可通过碳菁衍生物标记的抗体来可视化特定靶区域中受体介导的摄取与分布过程9。大量可获得的抗体经标记后可作为特异性示踪剂，用于体内原本难以到达的区域，从而在肿瘤发生以及神经退行性、心血管、免疫和炎症性疾病模型中，前所未有地揭示分子与细胞水平的生物学过程7。
本研究中，我们描述了在结肠炎小鼠模型中使用荧光介导断层成像技术的方法。葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎是一种标准的化学诱导型小鼠肠道炎症模型，其特征类似于炎症性肠病（IBD）10。该模型特别适用于评估先天免疫系统在肠道炎症发生过程中的作用11。由于单核细胞和巨噬细胞的募集、活化及浸润是IBD发病机制中的关键步骤，因此可视化这些细胞的募集过程及其浸润动力学，对于监测潜在治疗物质在临床前研究中的效果至关重要12。我们描述了DSS诱导结肠炎的方法，并展示了利用荧光分子断层成像技术对巨噬细胞浸润肠黏膜的过程进行断层成像表征，以特异性可视化单核细胞/巨噬细胞标志物F4/8013。此外，我们还介绍了辅助性和补充性操作步骤，包括抗体标记、实验装置设置，以及图像的分析与解读，并将其与疾病活动指数、流式细胞术、组织学分析和免疫组织化学等常规检测结果进行关联比较。我们还讨论了该技术的局限性及其与其他成像方式的比较。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无苜蓿饲料</td><td>Harlan Laboritories, Madison, USA</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen 眼膏</td><td>Bayer, Leverkusen, Germany</td><td>80469764</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖硫酸钠（DSS）</td><td>TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>E 4382</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Florene 100V/V</td><td>Abbott, Wiesbaden, Germany</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>苏木精&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tissue Tek 包埋剂&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Netherlands</td><td>4583</td><td>组织学分析固定剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠溶液</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠粉末</td><td>Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>标准饲料</td><td>Altromin, Lage, Germany</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 冷冻模具</td><td>Sakura, Leiden, Netherlands</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Hemoccult（愈创木脂纸检测）</td><td>Beckmann Coulter, Germany</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记大鼠抗小鼠 F4/80 抗体</td><td>Serotec, Oxford, UK</td><td>MCA497B</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记大鼠抗小鼠 GR-1 抗体&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg Germany</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-Alexa546</td><td>Molecular Probes, Darmstadt, Germany</td><td>S-11225</td><td>激发/发射最大值：&amp;nbsp; 556/573 nm</td></tr><tr><td>TC 抗 CD11b 大鼠抗小鼠抗体</td><td>Calteg, Burlingame, USA</td><td>R2b06</td><td></td></tr><tr><td>纯化抗小鼠 F4/80 抗体</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>123102</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记抗 Ly6C 大鼠抗小鼠抗体</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Germany</td><td>553104</td><td></td></tr><tr><td>FACS 缓冲液</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Germany</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Cy7 NHS 酯</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;Europe, Freiburg, Germany</td><td>PA17104</td><td></td></tr><tr><td>MPO ELISA 试剂盒</td><td>Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany</td><td>K 6631B</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5 标记抗小鼠 F4/80 抗体</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>123127</td><td>即用型标记抗体（替代方案）</td></tr><tr><td>抗小鼠 F4/80 抗原 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience, Waltham, USA</td><td>45-4801-80</td><td>即用型标记抗体（替代方案）</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐溶液（TBS）</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>SRE0032</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur 流式细胞仪系统</td><td>BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FMT 2000 活体成像系统</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>True Quant 3.1 成像分析软件</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>包含于 FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMLB 荧光显微镜</td><td>Leica,&amp;nbsp; 35578 Wetzlar, Germany&amp;nbsp;</td><td>DMLB</td><td></td></tr><tr><td>Bandelin Sonopuls HD 2070</td><td>Bandelin, 12207 Berlin, Germany</td><td>HD 2070</td><td>超声匀浆器</td></tr><tr><td>一次性手术刀 10 号</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>Z692395-10EA</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum 剪刀 14 cm</td><td>Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany</td><td>22398330</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 鲁尔锁注射器</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>Z248010</td><td></td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>Z192368&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgium</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

用于检测与定量小鼠肠道巨噬细胞相关炎症的荧光介导断层成像技术

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

疾病的小鼠模型在科学研究中不可或缺。然而，许多诊断工具（如内窥镜或断层成像）在动物模型中并未常规使用。传统的实验检测通常依赖于 死后 和 离体 分析，从而避免了无法对个体进行重复随访检查的问题，并减少了研究所需的实验动物数量。荧光介导断层成像技术可实现对荧光探针的无创、可重复、定量、三维评估。该技术具有高灵敏度，并可利用分子标记物，从而实现对特定分子靶点的特异性检测与表征。特别是靶向探针，已成为研究炎症、自身免疫性疾病、感染、血管疾病、细胞迁移、肿瘤发生过程中基因激活与蛋白表达的创新工具， 等等本文中，我们为这一复杂的成像技术提供了逐步操作指南 体内 炎症的检测与表征即， 在一种常用的肠道炎症小鼠模型中，F4/80阳性巨噬细胞浸润。该技术也可应用于其他研究领域，例如免疫细胞或干细胞示踪。

结肠炎的评估：
DSS诱导的结肠炎是一种化学诱导的小鼠肠道炎症模型，类似于人类炎症性肠病（IBD），可在易感小鼠中引起体重减轻、直肠出血、浅表溃疡和黏膜损伤15研究先天免疫系统在肠道炎症发生发展中的作用时，该方法尤为有用10,11为了强烈诱导结肠炎性炎症，小鼠在整个实验过程中持续给予DSS。体重下降和粪便隐血作为炎症的临床指标。如图所示 图1A小鼠在结肠炎诱导后第4天开始出现体重下降，而仅接受水的对照组动物体重无明显变化。此外，结肠炎动物粪便中隐血排出量增加（图1B)，根据以下隐血评分系统进行评估：0分（无出血）、1分（隐血试验阳性）、2...

靶向特异性探针是分析多种疾病（例如，炎症、感染和肿瘤发生）中分子机制（如蛋白质表达）的一种创新工具。本研究描述了一种利用F4/80特异性荧光介导断层成像技术，对结肠炎小鼠模型中肠道巨噬细胞浸润进行定量三维断层评估的方法。

疾病的小鼠模型对科学研究至关重要。然而，许多诊断工具，如内窥镜或断层成像，在……

该靶向性活体成像方法的总体目标是可视化炎症性肠病中疾病活动的分子标志物。该方法有助于回答炎症性肠病领域及相关的治疗研究中的关键问题，例如实验性治疗手段或特定细胞事件对炎症的影响。该技术的主要优势在于能够对疾病活动进行纵向且无创的监测。尽管该方法可用于研究炎症性疾病，也可应用于其他疾病的研究，例如癌症或免疫相关疾病。为诱导结肠炎，将2克葡聚糖硫酸钠（DSS）溶解于100毫升经高压灭菌的饮水中，按每只小鼠每天约5毫升饮水量估算，供给实验小鼠自由饮用。在扫描前24小时，将感兴趣的抗体混合物装入避光的无菌注射器中，通过尾静脉将抗体静脉注射至实验动物体内。在实验当天，使用电动剃须刀剃除实验动物腹部区域的毛发，以尽量减少光的反射和吸收。使用具有特定厚度和吸收特性的组织模拟体模，向其中加入特定体积的目标抗体溶液，并在FMT设备上测量其荧光信号。随后，在用于小动物的兽医荧光介导断层成像（FMT）设备上点击“新建研究”（New Study），并在研究描述中包含相关示踪剂信息，包括成像参数和给药剂量。根据实验设计建立研究分组，并为每个分组配备相应数量的动物。当系统已完成对示踪剂构建体的校准后，将第一只麻醉小鼠以仰卧位放入可加热至42摄氏度的检查盒中。将检查盒插入成像系统，并从相应的研究分组中选择适当的样本。选择所使用的示踪剂，以确保示踪剂浓度值被准确计算，并在适当的波长下采集荧光反射图像。点击“采集图像”以划定扫描区域，并确认扫描区域作为叠加图像显示在荧光反射图像上。调整扫描区域，使其包围目标区域，注意避免误差或残留毛发的区域。根据成像目标，选择扫描场分辨率以设定扫描场内的图像数据点数量。然后点击扫描，开始在选定波长下进行图像采集。扫描结束后，将动物从载物盒中取出，在返回笼中前对其进行监测，使其完全恢复。FMT 可根据实验需要在不同时间点重复进行。为分析所获得的图像，打开相应的图像分析软件，并选择第一次扫描的原始数据。使用重建工具，生成荧光分布的三维图谱。当所有扫描均已添加到相应的重建数据集中后，打开第一个感兴趣的数据集。所选实验动物的所有扫描结果将显示出来。选择相应的扫描并点击加载。示踪剂分布的三维重建结果将作为初始获取的荧光反射图像的叠加图显示。接下来，在重建的三维图上识别非特异性标记物聚集的焦点，并使用测量工具选择感兴趣区域。软件将生成该感兴趣区域的荧光强度，以及根据扫描校准的示踪剂的皮摩尔（picomolar）数量测量值。在本实验中，采用针对小鼠 F4/80 的荧光标记抗体直接可视化活化的巨噬细胞。通过荧光介导断层成像技术检测到，结肠炎小鼠结肠中荧光示踪剂的积聚显著高于非结肠炎对照组动物，表明结肠炎动物中单核细胞浸润增加并分化为活化巨噬细胞。相反，在结肠炎组和非结肠炎对照组中，使用非特异性荧光标记 IgG 抗体均未在腹部或肠道引发可检测到的荧光信号，证明了 F4/80 抗体探针与靶标的相互作用具有特异性。离体结肠中 F4/80 靶向示踪剂蓄积的体外测量结果进一步验证了活体检测到的 F4/80 示踪信号来源于结肠。事实上，计算所得的结合抗体含量与组织学确定的浸润巨噬细胞数量高度相关，证实了使用特异性示踪剂进行活体成像可反映局部疾病活动情况。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数分钟内完成并完成分析。制备步骤（包括特异性抗体示踪剂的制备）通常需要两到三天。在规划此类实验流程时，必须为抗体和动物疾病模型设置适当且可靠的对照。在完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法（如结肠镜检查或流式细胞术）来回答更多问题，并对数据进行验证和定量分析。

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医学

荧光介导的断层扫描对巨噬细胞相关小鼠肠道炎症的检测和定量

扩散荧光断层成像为临床前研究提供了一种相对低成本且潜在高通量的方法 体内...

小动物中用于癌症生物标志物定位的计算机断层扫描引导时域漫射荧光断层成像

本视频展示了一种利用荧光介导断层扫描（FMT）在结肠炎小鼠模型中评估肠道巨噬细胞浸润的技术。通过葡聚糖硫酸钠（DSS）在小鼠体内诱导结肠炎后，向动物注射可识别结肠内浸润巨噬细胞表面F4/80糖蛋白标志物的抗体。随后将小鼠置于FMT设备中成像，荧光信号与反射信号被重建为三维图像，以确定荧光的空间分布及强度。...

利用荧光介导断层成像评估小鼠肠道炎症

我们描述了一种用于区分炎症阶段的非侵入性成像方法。全身递送的鲁米诺可显示依赖于中性粒细胞中髓过氧化物酶（MPO）活性的急性炎症区域。相比之下，注入的双甲酰胺（lucigenin）则可实现对依赖于巨噬细胞中NADPH氧化酶（Phox）活性的慢性炎症的可视化成像。...

体内成像方法区分急性与慢性炎症

小型动物成像技术可实现活体内的连续诊断检查和治疗干预。in...

小鼠内窥镜检查技术 在体 内 癌症发生的多模态成像及肠道伤口愈合与炎症评估

通过使用转基因报告小鼠和可注射的荧光标记物，长期活体旋转盘共聚焦显微镜技术能够直接观察ApcMin/+...

使用旋转盘共聚焦显微镜对 ApcMin/+ 小肠肿瘤中髓系细胞动态的实时成像

使用荧光染料进行 体内 成像效果可能因调理作用、快速清除、检测灵敏度低以及对宿主的细胞毒性效应而受到显著限制。通过薄膜水化与挤出法将荧光染料封装于脂质体中，可实现荧光淬灭与保护，从而提高成像性能 体内 具有高检测灵敏度的成像...

一种近红外荧光染料的脂质体包封型荧光淬灭技术作为工具 体内 光学成像

我们介绍一种结合荧光介导断层成像（FMT）与微型计算机断层扫描（µCT）的融合成像方案。在完成图像融合与重建后，进行交互式器官分割，以提取荧光分布的定量测量数据。...

混合 µCT-FMT 成像与图像分析

本文介绍了一种光片显微镜方法，用于在无菌性暴发性心肌炎小鼠模型中可视化心脏 CD45+ 白细胞浸润，该模型通过向 CD11c.DTR...

通过光片显微镜对暴发性心肌炎小鼠模型中白细胞浸润的定量可视化

利用活体显微技术，本文所介绍的方法能够实现对活体动物肠道上皮细胞脱落过程的实时可视化观察。因此，通过对麻醉小鼠的肠道黏膜进行局部染色（吖啶黄和罗丹明B-葡聚糖），可借助共聚焦显微镜以单细胞分辨率进行成像。...

基于活体显微镜的肠道通透性与上皮细胞脱落功能评估方法

本研究介绍了一种利用完整肠组织和多光子显微镜进行三维成像的方法，用于定量分析分泌的黏液，从而实现对氯化氨甲酰胆碱等刺激物作用下黏液动态变化的精确体积分析和可视化。...

利用全组织成像对肠道黏液进行三维定量分析

本文介绍了一种利用永久性肺窗对小鼠肺部经减毒且获得生物安全二级（BSL-2）许可的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

衰减营养缺陷型的活体成像 结核分枝杆菌 小鼠肺脏在早期血管内感染期间的变化

了解荧光介导断层扫描技术在小鼠结肠炎模型中检测肠道巨噬细胞浸润的应用。该方法可实现炎症性肠病分子标志物的无创纵向监测，为研究疾病机制和治疗效果提供重要工具。

用于检测与定量小鼠肠道巨噬细胞相关炎症的荧光介导断层成像技术

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