荧光介导的断层扫描对巨噬细胞相关小鼠肠道炎症的检测和定量
2017年12月15日
目标特定的探针代表了一种用于分析分子机制的创新工具, 例如各种疾病的蛋白质表达 (例如,炎症、感染和肿瘤发生)。在这项研究中, 我们描述了一个定量的三维层析成像评估肠道巨噬细胞浸润的小鼠结肠炎模型使用 F4/80-specific 荧光介导的断层扫描。
这种靶标特异性体内成像方法的总体目标是可视化炎症性肠病中疾病活动的分子标志物。这种方法可以帮助回答炎症性肠病领域的关键问题，以及关于实验疗法或特定细胞事件对炎症影响的相关治疗研究。该技术的主要优点是可以纵向和非侵入性地监测疾病活动。
虽然这种方法可以提供对炎症性疾病的见解，但它也可以应用于研究其他疾病，例如癌症或免疫相关疾病。为了诱发结肠炎，在实验小鼠的饮水中加入 2 克葡聚糖硫酸钠或 DSS，溶解在 100 毫升高压灭菌的饮用水中，估计每只小鼠每天 5 毫升水。扫描前 24 小时，将感兴趣的抗体混合物装入避光的无菌注射器中，并将抗体静脉注射到实验动物的尾静脉中。
实验当天，使用电动剃须刀剃除实验动物腹部区域的皮毛，以尽量减少光的反射和吸收。使用具有确定厚度和吸收特性的组织模拟体模，用特定体积的目标抗体溶液填充体模，并在 FMT 设备上测量荧光。然后，在兽医荧光介导的断层扫描或小动物 FMT 设备上，单击 New Study 并在研究描述中包含相关的示踪剂，包括成像参数和剂量。
根据实验设计创建研究组，为每个组配备适当数量的动物。当系统针对示踪剂结构进行校准后，将第一只仰卧位麻醉的小鼠放入 42 摄氏度的可加热检查盒中。将暗盒插入成像系统，并从相应的研究组中选择合适的样品。
选择管理的示踪剂以确保正确计算示踪剂浓度的值，并获取适当波长的荧光反射图像以进行扫描。单击"获取图像"以勾勒出扫描区域，并确认扫描区域在荧光反射图像上显示为叠加层。调整扫描区域，直到它围绕感兴趣的区域，注意避免错误或剩余毛发区域。
根据图像目标，选择扫描区域分辨率以设置扫描区域内的图像数据点数量。然后单击 Scan （扫描） 以所选波长开始图像采集。扫描结束时，将动物从盒中取出，让动物在返回笼子之前通过监测完全恢复。
然后可以根据实验情况在不同的时间点重复 FMT。要分析采集的图像，请打开相应的成像分析软件并选择第一次扫描的原始数据。使用重建工具，创建荧光分布的 3D 图。
将所有扫描添加到相应的重建数据集后，打开第一个感兴趣的数据集。将显示对所选个体实验动物执行的所有扫描。选择适当的扫描，然后单击 Load。
示踪剂分布的 3D 重建将显示为最初获取的荧光反射图像的叠加。接下来，在重建的 3D 图上确定非特异性标签积累的焦点，并使用测量工具选择感兴趣的区域。然后，该软件将生成感兴趣区域的荧光强度，以及校准扫描的示踪剂的皮摩尔量测量值。
在本实验中，采用针对小鼠 F4/80 的荧光偶联抗体直接观察活化的巨噬细胞。与非结肠炎对照动物相比，通过荧光介导的断层扫描测量结肠炎小鼠结肠中荧光示踪剂的积累显着升高，表明结肠炎动物中单核细胞浸润和分化为活性巨噬细胞的增加。相反，在结肠炎或非结肠炎对照组中，非特异性荧光偶联 IgG 抗体的应用在腹部或肠道中均未产生可检测的荧光反应，证明了 F4/80 抗体的探针-靶标相互作用的特异性。
F4/80 定向示踪剂在外植结肠中积累的离体测量进一步验证了体内检测到的 F4/80 示踪信号积累的结肠起源。事实上，计算出的结合抗体量与组织学确定的浸润性巨噬细胞的数量密切相关，证实了使用特异性示踪剂的体内成像可以指示局部疾病活动。一旦掌握了，如果执行得当，可以在几分钟内执行和分析。
制备步骤，包括基于特异性抗体的示踪剂的生产，通常需要 2 到 3 天。在规划此类实验程序时，重要的是要包括针对抗体和动物疾病模型的适当且可靠的对照。按照此程序，可以执行其他方法，如结肠镜检查或流式细胞术来回答其他问题并验证和量化数据。
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概述
本研究提出了一种靶向特异性的体内成像方法，用于可视化炎症性肠病中疾病活动的分子标记物。利用定量的三维断层扫描评估，该研究集中于结肠炎小鼠模型中的肠道巨噬细胞浸润。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 炎症性肠病
背景
- 靶向特异性探针是分析分子机制的创新工具。
- 它们可用于研究各种疾病中的蛋白质表达。
- 该方法允许对疾病活动进行纵向和无创监测。
- 它可以应用于炎症性疾病、癌症和免疫相关疾病。
研究目的
- 可视化炎症性肠病中疾病活动的分子标记物。
- 解决与炎症相关的治疗研究中的关键问题。
- 评估实验性治疗对炎症的影响。
使用的方法
- 使用硫酸盐右旋糖酐（DSS）诱导结肠炎。
- 通过静脉注射抗体鸡尾酒给实验小鼠。
- 使用荧光介导断层扫描成像巨噬细胞浸润。
- 体内纵向监测疾病活动。
主要结果
- 成功可视化肠道巨噬细胞浸润。
- 展示了无创监测疾病活动的能力。
- 提供了对结肠炎中炎症动态的洞察。
- 确定了用于研究其他疾病的潜在应用。
结论
- 靶向特异性成像方法对研究炎症性肠病是有效的。
- 该方法可以增强对疾病机制和治疗效果的理解。
- 未来的研究可以将其应用扩展到其他炎症性和免疫相关疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
Non-invasive longitudinal imaging of macrophage infiltration enables early detection of inflammatory responses in preclinical models, reducing reliance on terminal endpoints and supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory therapeutics. Quantitative 3D fluorescence-mediated tomography provides predictive confidence in target engagement and disease-modifying effects, informing go/no-go decisions in IBD and immune-mediated disease programs. This approach enhances translational continuity by aligning in vivo imaging readouts with histopathological validation, improving portfolio triage and resource allocation in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing F4/80-positive macrophage accumulation as a functional readout of intestinal inflammation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through specific probe-target interactions, demonstrated by lack of signal with non-specific IgG controls.
- Predictive Value: Correlates in vivo tracer accumulation with ex vivo antibody binding and histologic macrophage counts, strengthening target confidence for immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D fluorescence maps and picomolar tracer measurements, enabling reproducible compound screening in colitis models.
- Scalability: Facilitates longitudinal monitoring across time points, reducing animal use and increasing statistical power in therapeutic efficacy studies.
- Platform Reuse: Compatible with downstream validation via colonoscopy or flow cytometry, supporting integrated workflows for target validation and biomarker alignment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intestinal inflammation through DSS-induced colitis, a widely used system for studying IBD pathogenesis and therapeutic response.
- Translational Continuity: Links non-invasive imaging to histologic endpoints, enabling risk-adjusted advancement decisions based on concordant in vivo and ex vivo data.
- Mechanistic De-risking: Tracks monocyte infiltration and macrophage differentiation dynamics, providing insight into cellular mechanisms of action for experimental therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescence-mediated tomography fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immune-modulating compounds in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying macrophage infiltration as a pharmacodynamic readout of pathway modulation in colitis models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, tracer concentration) that enable comparison across treatment groups and time points.
- Analytics: Provides reconstructable 3D datasets and region-of-interest measurements that facilitate statistical analysis of treatment effects on immune cell localization.
- Translational Research: Connects in vivo imaging to ex vivo validation, strengthening biomarker alignment and preclinical continuity for IBD-targeted candidates.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability applicable across immune cell tracking, stem cell studies, and oncology models beyond intestinal inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through specific, quantifiable imaging of macrophage activity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via calibrated tracer quantification and longitudinal intra-individual tracking.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on non-invasive disease activity monitoring, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through concordant imaging and histologic data, refining advancement criteria in immunomodulator pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging, tracer preparation, and small animal handling for intravenous injection and anesthesia protocols.
- Dependent on access to a small animal fluorescence-mediated tomography system with appropriate wavelength selection and reconstruction software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, tracer dosing, and region-of-interest analysis for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations across model systems, including fur removal and abdominal imaging optimization to minimize signal interference.
- Includes practical limitations such as the 2–3 day tracer preparation timeline and the need for appropriate isotype and disease controls to ensure specificity.
