基因转移到老年人的鸡胚前OVO电穿孔

本实验的总体目标是通过在体条件下对较晚期的鸡胚进行基因转移，以研究基因在较晚发育阶段的功能与调控机制。该过程首先在孵化约2.5天时打开鸡蛋，将整个胚胎转移至培养皿系统中；第二步是将编码目的基因的质粒注射到胚胎的适当部位。

注射质粒后，将电极置于胚胎两侧并进行X卵电穿孔，最后一步是收集电穿孔后的胚胎用于分析。最终通过免疫组织化学检测外源基因在胚胎中的表达情况。今天我们将向您展示如何利用鸡胚BULs进行X卵电穿孔。

该技术的主要优势在于，X法相较于电穿孔能够克服在较老鸡胚中进行基因转移时电穿孔所存在的问题。成功的鸡胚X体外培养需要使用新鲜的受精卵。切勿使用在12摄氏度下储存超过一周的卵。

将孵化2.5天后的鸡蛋以长轴侧放于强制通风式孵卵器中，在37.5摄氏度、60%湿度条件下继续孵化。当胚胎发育至约汉堡-汉密尔顿第17期时，将鸡蛋从孵卵器中取出。

用铅笔在每个鸡蛋的顶部标记，以指示每个鸡蛋的敲击方向。将约20毫升无菌蒸馏水倒入一个洁净的大培养皿中，培养皿直径为145毫米。将一个直径为94毫米的小型无菌培养皿放入大培养皿中。

接下来，将每个鸡蛋的底部轻击锋利的金属边缘使其破裂。小心打开鸡蛋，将全部内容物转移至小培养皿中。为确保胚胎质量良好，鸡蛋的全部内容物应在培养皿系统中保持正常的圆形结构，且绒毛膜不得受到任何损伤。

将每个鸡蛋的内容物转移至小培养皿后，用盖子盖上大培养皿。将培养皿系统放入另一培养箱中，在37.5摄氏度、约60%湿度条件下继续培养，以备后续进行体外电穿孔。使用微电极拉制仪从直径为1.0毫米的玻璃管中拉制玻璃毛细管。

将玻璃毛细管的尖端折断至合适的直径。接下来，根据不同的组织类型和胚胎大小，设置适当的电穿孔参数，例如不同的电压。根据目标组织和胚胎大小，将合适的电极连接到电穿孔仪上。

制备含有编码目的基因和标记基因质粒的质粒溶液。在本实验中，目的基因为钙黏蛋白7（cadherin seven）或CAD7，标记基因为绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）或GFP。加入快绿至终浓度0.1%，使质粒溶液呈现绿色。

最后，使用口吸管将质粒溶液吸入玻璃毛细管中。用于体外电穿孔实验的鸡胚来自体外培养并已孵育六天的胚胎。开始该操作时，用精细镊子小心撕开视顶盖上方的绒毛膜和羊膜，并在顶盖表面滴加三滴无菌0.9%氯化钠溶液。

使用口吸移液管，将玻璃毛细管中的质粒溶液注入视顶盖腔内。将钨针阴极和矩形板阳极电极置于视顶盖旁。立即使用电穿孔仪对视顶盖施加电脉冲。

将大培养皿盖上盖子，并放回培养箱中。在胚胎发育第6天（E6）对鸡中脑被盖区电转染编码GFP和CAD7的质粒后两到三天，收集中脑被盖组织并固定，用于免疫染色。结果如本图E8所示。GFP蛋白在肿瘤中强烈表达，如以下整体装片图像所示。

图A为明场图像。图B为GFP图像，图C为合并图像。此外，在E9期中脑切片中，图D以绿色显示GFP蛋白，图E以红色显示CAD7蛋白，二者共同表达，表现为图F中的黄色信号。若操作得当，X ovo电穿孔的效率可达60%至100%。这些结果表明，X ovo电穿孔是一种在体内将基因成功导入较晚期鸡胚的有效方法。

观看本视频后，您应能充分了解如何将基因转入较晚期的鸡胚，并预祝您的实验顺利成功。