Name: 基因转移到老年人的鸡胚前OVO电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学习利用离体电穿孔技术向高龄鸡胚进行基因转移，研究发育后期基因功能与调控机制。该方法通过体外培养与电穿孔操作，实现高效基因递送与表达检测。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由德国研究基金会（DFG；LU1455/1-1）的资助项目支持。

1. Ex ovo 培养
<ol>
 <li>将新鲜受精卵横向放置于强制通风孵育箱（BSS160，Ehret，德国）中，在37.5 °C、60%湿度条件下进行孵育。储存于12 °C超过一周的鸡蛋不应使用。</li>
 <li>孵育2.5天后（约HH17期），取出鸡蛋，并用铅笔在顶部标记方向，以指示敲击开壳的位置。</li>
 <li>在敲击开壳前，向一个洁净的大培养皿（直径145 mm；Greiner Bio-One GmbH，德国）中加入约20 ml无菌蒸馏水。</li>
 <li>将另一个无菌小培养皿（直径94 mm；Greiner Bio-One GmbH）放入大培养皿中。</li>
 <li>将鸡蛋底部轻击锋利的金属边缘使其破裂，小心打开鸡蛋，并将每个鸡蛋的全部内容物转移至小培养皿中。</li>
 <li>用盖子盖住大培养皿，并将其放入另一台孵育箱（BINDER GmbH，Tuttlinge，德国）中，在37.5 °C、约60%湿度条件下继续培养。根据实验需要孵育相应天数后，即可用于胚胎电穿孔实验。</li>
</ol>
2. ex ovo 电转染的准备
<ol>
 <li>使用微电极拉制仪（PUL-100 Micropipette Puller；World Precision Instruments，德国柏林）和直径为1.0 mm的玻璃管（TW100F-4；World Precision Instruments）拉制玻璃毛细管，并将玻璃毛细管尖端折断至合适直径。</li>
 <li>根据靶向组织和胚胎大小，设置适当的电穿孔参数（例如，针对不同组织和胚胎大小采用不同的电压），并将电极连接至电穿孔仪（CUY21-Edit；Nepa Gene，日本千叶）。</li>
 <li>制备含有目标基因（例如，钙黏蛋白7（Cad7；pCAGGS-Cad7，浓度为2.0 μg/μl））和标记基因（例如，绿色荧光蛋白（GFP；pCAGGS-GFP，浓度为0.25 μg/μl））的pCAGGS载体质粒溶液。然后加入终浓度为0.1%的快绿染料（Sigma），使质粒溶液呈现绿色以便观察。</li>
 <li>使用口吸移液法将质粒溶液吸入玻璃毛细管中。</li>
</ol>
3. 通过基因转移将基因导入鸡视顶盖 体外孵化 电穿孔 
<ol>
 <li>之后 体外 培养，例如在孵育第6天（E6）时，鸡胚即用于 体外孵化 电穿孔</li>
 <li>用精细镊子小心撕开覆盖在视顶盖上的卵黄膜和羊膜，并在视顶盖表面滴加3滴无菌0.9%氯化钠溶液。</li>
 <li>使用玻璃毛细管通过口吸移液法将质粒溶液注入视顶盖腔内。</li>
 <li>将电极（钨针阴极和矩形板状阳极，CUY 661-3x7，Nepa Gene）置于视顶盖旁，立即使用电穿孔仪对视顶盖施加电脉冲（共六次脉冲，每次25 V，脉冲时长60 ms，间隔100 ms）。</li>
 <li>用培养皿盖盖好大型培养皿，并将其放回培养箱。在适当天数的培养后（例如电穿孔后2或3天），取材视顶并进行固定，以用于免疫染色图1以及生物检测。</li>
</ol>
4. 代表性结果
Cad7 和 GFP 外源蛋白的成功过表达 体外 电穿孔如图所示 图1 以Cad7质粒与GFP质粒在E6期共同电穿孔至视顶盖为例，电穿孔后两到三天收集胚胎并进行固定。在E8期，整体成像显示GFP蛋白在视顶盖中强烈表达（图1A-C）。此外，在E9期顶盖组织切片中，GFP蛋白（绿色） 图1D）以及Cad7蛋白（红色） 图1E）共表达（黄色表示 图1F），表明 体外 电穿孔是一种将基因导入较晚阶段鸡胚的高效方法 体内.
<img src="/files/ftp_upload/4078/4078fig1.jpg" alt="GFP and Cad7 fluorescence microscopy, merged images; neural tissue labeling, E6-E9 embryonic stages." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 当在胚胎发育第6天（E6）将编码GFP和Cad7的质粒共转染至鸡视顶盖时，转染后两到三天 体外 电穿孔后，GFP蛋白（绿色）在E8期的全胚标本图像（A-C）中强烈表达。在E9期中脑顶盖切片中，GFP蛋白（D中绿色）与Cad7蛋白（E中红色）共表达（F中黄色）。BF，明场图像。比例尺： 200 μm 在 A 中表示 A-C； 100 μm 在 D 中表示 D-F。

<ol><li>Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li>
<li>Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-20+expression+by+motor+neurons+is+regulated+by+Sonic+hedgehog+during+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development.</a> NeuroReport. 20, 365-370 (2009).</li>
<li>Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionalized+cadherin-7+expression+by+radial+glia+is+regulated+by+Shh+and+Pax7+during+chicken+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development.</a> Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).</li>
<li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+targeted+silencing+of+developmental+control+genes+during+chicken+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis.</a> Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).</li>
<li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).</li>
<li>Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+introducing+morpholinos+into+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo.</a> Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).</li>
<li>Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherins+guide+migrating+Purkinje+cells+to+specific+parasagittal+domains+during+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development.</a> Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).</li>
<li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).</li>
<li>Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+axons+to+specific+fiber+tracts+in+vivo+by+altering+cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression.</a> J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案提供了将基因转入较晚期鸡胚（例如在E6期转入视顶盖）的操作指南 体外孵化 电穿孔。该方法将电穿孔技术的应用扩展至较晚期的鸡胚，可被众多实验室便捷地用于基因功能研究。 体内 在后期阶段，通过该方法可成功对从E4到至少E7时期的胚胎进行电穿孔，并且电穿孔后的胚胎可存活至E15。11除了大脑外，该方法还可用于将基因转入鸡的肢体系统11. 
进行 ex ovo 电转染时应特别注意。例如，为了通过 ex ovo 培养获得较高的胚胎存活率，所使用的鸡蛋应保持新鲜，并在 12 °C 下储存不超过一周；小型培养皿应无菌，且破壳操作应在约 E2.5 期进行。ex ovo 电转染时，应根据胚胎的发育阶段及目标部位正确选择电极的大小和放置位置。当共转染两个质粒时，注射的质粒浓度应保持适当的比例（例如，标记基因 GFP 与目标基因的比例为 1:8），以确保 GFP 标记的细胞几乎同时共表达目标基因。

<table><tbody><tr><td>电穿孔仪</td><td>Nepa Gene, Japan</td><td>CUY21-Edit</td><td></td></tr><tr><td>电极</td><td>Nepa Gene, Japan</td><td>CUY661-3x7</td><td></td></tr><tr><td>孵蛋器</td><td>Ehret, Germany</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养箱</td><td>BINDER GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Keyence, Deutschland GmbH</td><td>BZ-8000</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微&amp;#8211;电极拉制仪</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>PUL-100</td><td></td></tr></tbody></table>

通过基因转导将基因导入较老龄鸡胚 体外孵化 电穿孔

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

鸡胚为研究胚胎发育过程中的基因功能与调控提供了极佳的模型系统。 在卵内 电穿孔是一种用于过表达外源基因或下调内源基因的强有力方法 体内 在鸡胚胎中1. 不同的结构，例如编码基因的DNA质粒2-4，小干扰RNA（siRNA）质粒5，小合成RNA寡核苷酸6和吗啉代反义寡核苷酸7 可通过电穿孔技术轻松转染鸡胚。然而，该技术的应用存在 在卵内 电穿孔技术仅限于孵化早期阶段的胚胎（根据Hamburger和Hamilton分期，早于HH20期）8 并且其在较晚期胚胎（发育阶段晚于HH22期，约发育3.5天后）中的应用存在一些局限性。例如，晚期胚胎的卵黄膜通常与壳膜粘连，打开蛋壳窗口会导致血管破裂，从而引起胚胎死亡；较晚期的胚胎表面覆盖有卵黄膜和尿囊血管，难以接近和操作胚胎；此外，晚期胚胎活动剧烈，通过蛋壳上相对较小的窗口难以控制其方位。
在本实验方案中，我们展示了一种用于在较晚阶段（晚于HH22期）将基因导入鸡胚的ex ovo电穿孔方法。对于ex ovo电穿孔，胚胎在培养皿中进行培养9，卵黄囊和尿囊血管充分展开。在此条件下，较晚期的鸡胚易于接触和操作，因此该方法克服了传统in ovo电穿孔在较晚期鸡胚应用中的局限性。利用该方法，质粒可被高效转染至较晚期鸡胚的不同部位10-12。

一种针对孵化后期（晚于汉伯格和汉密尔顿分期（HH）22期）鸡胚的基因转移方法被描述。该方法克服了传统方法的若干缺点。 在卵内 电穿孔技术应用于较晚期的鸡胚，是研究较晚期发育阶段基因功能与调控的有用技术。

鸡胚为研究胚胎发育过程中基因功能与调控提供了优良的模型系统。在卵电穿孔法……

本实验的总体目标是在体内对较晚期的鸡胚进行基因转移，以研究基因在较晚发育阶段的功能与调控机制。该过程首先在孵化约2.5天时打开鸡蛋，将整个胚胎转移至培养皿系统中；第二步是将编码目的基因的质粒注射到胚胎的适当部位。注射质粒后，将电极置于胚胎两侧并进行体内电穿孔，最后一步是收集电穿孔后的胚胎用于分析。最终通过免疫组织化学方法检测外源基因在胚胎中的表达情况。今天我们将向您展示如何利用鸡胚BULs进行体内电穿孔操作。该技术的主要优势在于，X法相较于电穿孔法能够克服在较晚期鸡胚中进行基因转移时电穿孔所存在的问题。成功的鸡胚X胚外培养需要使用新鲜的受精卵。切勿使用在12摄氏度下保存超过一周的鸡蛋。将孵化2.5天后的鸡蛋以长轴侧放于强制通风式孵卵器中，在37.5摄氏度、60%湿度条件下继续孵化。当胚胎发育至约汉堡-汉密尔顿第17期时，将鸡蛋从孵卵器中取出。用铅笔在每个鸡蛋的顶部标记，以指示每个鸡蛋的敲击方向。将约20毫升无菌蒸馏水倒入一个洁净的大培养皿中，培养皿直径为145毫米。将一个直径为94毫米的小型无菌培养皿放入大培养皿中。接下来，将每个鸡蛋的底部轻轻撞击锋利的金属边缘使其破裂。小心打开鸡蛋，将全部内容物转移至小培养皿中。为确保胚胎质量良好，鸡蛋的全部内容物应在培养皿系统中保持正常的圆形结构，且绒毛膜不得受到任何损伤。将每个卵的内容物转移至小培养皿后，用盖子盖住大培养皿。将培养皿系统放入另一培养箱中，在37.5摄氏度、约60%湿度条件下继续培养，以备后续卵外电穿孔实验。使用微电极拉制仪从直径为1.0毫米的玻璃管中拉制玻璃毛细管。将玻璃毛细管的尖端折断至合适的直径。接着，根据不同的组织类型和胚胎大小，设置电穿孔的适当参数，例如不同的电压。根据目标组织和胚胎大小，将适当的电极连接到电穿孔仪上。制备含有编码目的基因和标记基因质粒的质粒溶液。在本实验中，目的基因为钙黏蛋白7（cadherin seven）或CAD7，标记基因为绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）或GFP。加入快绿至终浓度0.1%，以使质粒溶液呈现绿色。最后，使用口吸管将质粒溶液吸入玻璃毛细管中。采用体外培养孵育6天的鸡胚进行体外电穿孔实验。开始该操作时，用精细镊子小心撕开视顶盖上方的绒毛膜和羊膜，并在顶盖表面滴加三滴无菌0.9%氯化钠溶液。使用口吸移液管将玻璃毛细管中的质粒溶液注入视顶盖腔内。将带有钨针阴极和矩形板阳极的电极置于视顶盖两侧。立即使用电穿孔仪对视顶盖施加电脉冲。将大培养皿盖上皿盖，放回培养箱中。在胚胎发育第6天（E6）向鸡脑顶盖电穿孔导入编码GFP和CAD7的质粒后两到三天，收集顶盖组织并固定，进行免疫染色。结果如本图E8所示。GFP蛋白在肿瘤中强烈表达，如此处的整体装片图像所示。图A为明场图像。图B为GFP图像，图C为合并图像。此外，在E9期视顶盖切片中，图D显

gene-transfer-into-older-chicken-embryos-by-ex-ovo-electroporation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基因转移到老年人的鸡胚<em&gt;前OVO</em&gt;电穿孔

鸡胚体内电穿孔是一种能够对禽类胚胎进行遗传操作的技术。该技术的常见应用包括基因及假定增强子元件的功能分析。本视频展示了在HH...

鸡胚HH10期在卵电穿孔实验

本视频的总体目标是展示如何在汉普格尔和哈密尔顿22-23期（约胚胎发育第4天，E4）对鸡胚视网膜进行靶向视网膜注射以及in...

在卵内 鸡胚视网膜电穿孔技术

为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo...

in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

鸡胚视网膜细胞培养是研究光感受器生物学的重要工具。我们开发了一种基于高效基因转导技术的方法 ex ovo...

用于原代细胞培养研究的鸡视网膜高效基因转导：一种 体外培养 电穿孔法

听觉器官介导听觉功能。本文介绍了一种改良的 在卵内 用于研究发育中鸡听觉器官内听觉前体细胞增殖与分化的优化微电穿孔方法...

通过 in ovo 微电穿孔法将基因导入鸡听觉器官

鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门负责快速神经编码，这是正常听觉功能的基本过程。这些神经元起源于胚胎后脑的不同前体细胞。本文介绍了利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因的方法，以研究基因在听觉发育过程中的功能。...

在卵内 鸡听觉脑干中的电穿孔技术

我们报道了一种信使RNA（mRNA）电穿孔方法，该方法可在鹌鹑胚胎模型系统中快速高效地表达多种蛋白质。该方法可用于对细胞进行荧光标记，并在电穿孔后短时间内通过延时显微镜记录其在体内的运动过程。...

利用mRNA电穿孔技术在禽类胚胎中快速高效表达多种蛋白质

本文提供了一种通过核转染子孢子或第二代裂殖子实现鸡艾美球虫（Eimeria）寄生虫稳定转染的方法。表达外源抗原基因的基因修饰艾美球虫可作为疫苗递送载体。...

核转染与鸡体内扩增 艾美耳球虫 寄生虫

本文的总体目标是描述如何对鸡胚进行in...

在卵内 鸡胚血管内注射

鸡是一种经济、易得且广泛可用的模式生物，适用于多种研究。本文详细描述了一系列实验方案，旨在揭示禽类内耳发育与再生的分子机制。...

In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

学习利用离体电穿孔技术向高龄鸡胚进行基因转移，研究发育后期基因功能与调控机制。该方法通过体外培养与电穿孔操作，实现高效基因递送与表达检测。

通过基因转导将基因导入较老龄鸡胚体外孵化电穿孔

探索更多视频

通过基因转导将基因导入较老龄鸡胚 体外孵化 电穿孔

探索更多视频

通过基因转导将基因导入较老龄鸡胚体外孵化电穿孔