Drosophila Adulto olfativa Choque Aprendizaje

El objetivo general de este procedimiento es medir la memoria asociativa utilizando el ensayo de choque olfativo de Drosophila adulta. Esto se logra recolectando primero moscas bajo anestesia con dióxido de carbono. El segundo paso es exponer las moscas simultáneamente a una descarga eléctrica y a un primer olor A en el equipo A. A continuación, las moscas se exponen al segundo olor B sin una descarga.

Finalmente, las moscas se llevan al punto de elección en el equipo A donde se exponen al olor A y B simultáneamente después de dos minutos de tiempo de distribución, las moscas que eligieron el olor A y las que eligieron el olor B se recogen por separado y se cuentan bajo dióxido de carbono. Esto permite calcular el índice de rendimiento para cada olor. El PI final se obtiene promediando el PI para dos experimentos separados, uno en el que el olor A está emparejado con choques y el segundo en el que el olor B está emparejado con choques.

Este método puede proporcionar información sobre el efecto del estado interno del animal y la memoria. Por ejemplo, al variar su edad, dieta y sueño, también se puede aplicar a otros sistemas. Por ejemplo, es análogo a los ensayos de condicionamiento del miedo mediados por roedores o fábricas, en los que los genes y los mecanismos de aprendizaje están altamente conservados entre insectos y mamíferos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que preparar las moscas para el ensayo y luego mover las moscas dentro y fuera de los compañeros de equipo es difícil de aprender y no es fácil apreciar cómo hacerlo a partir de un protocolo escrito. Para comenzar a cultivar moscas con una dieta de alimentos estándar bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas a 25 grados centígrados, uno o dos días antes del experimento, anestesia las moscas con dióxido de carbono y sepárelas en cuatro grupos de 25. Almacene las moscas durante la noche en viales de comida sin levadura a 25 grados centígrados y 70% de humedad en una habitación ambientalmente controlada bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas.

A continuación, prepare un equipo de metacrilato personalizado MA y revise regularmente el accesorio del tubo para asegurarse de que se asegure un sello hermético durante el experimento, coloque rejillas de cobre hechas a medida dentro de los tubos de entrenamiento. Limpie las rejillas con regularidad y reemplácelas si se oxidan. Use pinzas de cocodrilo para conectar rejillas de cobre a los cables que van a una caja de interruptores conectada a un estimulador eléctrico.

A continuación, aplique un voltímetro para asegurarse de que el aparato está suministrando la descarga requerida. A continuación, sujete el laberinto firmemente con abrazaderas G. Para evitar cualquier fuga de aire, conecte el laberinto T a un tubo que va a una bomba de aire, lo que permite que los olores se atraigan a través de las moscas y se eliminen del equipo.

Mantenga un flujo de aire suave a dos litros por minuto, luego diluya cuatro cicloetanol de metilo o MCH en una proporción de uno a 67 y tres octales u OCT en una proporción de uno a 100 en aceite mineral. A continuación, pipetee 30 microlitros del olor diluido en el recipiente de olor. Prepare una taza de olor hecha a medida y cubra un bloque de olor con un tubo de plástico con una tapa perforada.

Coloque la taza de olor hecha a medida en el bloque de olor. Este mecanismo permite que el aire se extraiga sobre el olor en la taza, exponiendo a las moscas a una columna de olor. Realice todos los experimentos de condicionamiento de choque olfativo para adultos bajo una luz roja tenue, lo que permite al investigador ver, pero evita que la mosca vea y asegura que las moscas se concentren en todas las facciones en lugar de en las entradas visuales.

A continuación, introduce las moscas en el tubo de entrenamiento conectado a los TMA y deja que se adapten al tubo y al flujo de aire durante 90 segundos. Presenta el primer olor MCH con una descarga de 60 voltios que consta de 12 1.25. Segundos pulsos con intervalos entre pulsos de 3,75 segundos durante una duración total de 60 segundos.

Siga el choque con un 32º período de descanso. Presente el segundo olor de OCT durante 60 segundos sin un choque. Siga el choque con un 32º período de descanso.

A continuación, gira a los compañeros de equipo de lado y golpea suavemente la parte inferior de una alfombrilla de ratón para mover las moscas de la cámara de entrenamiento a la cámara central. Después de mantener las moscas en la cámara central durante 90 segundos, coloque los tubos de elección en la parte inferior del aparato para formar el equipo A para medir el aprendizaje. Mueve las moscas al punto elegido por los compañeros de equipo y expóngalas simultáneamente a ambos olores durante 120 segundos.

Atrapa las moscas en los tubos elegidos deslizando la cámara central hacia arriba. A continuación, recoge las moscas del compartimento central y cada brazo de los compañeros de equipo en viales de comida separados. Etiquetar claramente cuáles son las moscas y su elección de olor en el vial, y luego contarlas para medir la memoria.

Recoge las moscas después del entrenamiento y transfiérelas de los compañeros de equipo a viales de comida sin levadura. Almacene las moscas en la oscuridad a 25 grados centígrados y 70% de humedad, como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, vuelve a introducir las moscas en el equipo aze.

Para la memoria a largo plazo. Usa un laberinto hecho a medida que permite entrenar varios lotes de moscas simultáneamente. Administrar cinco ciclos de entrenamiento.

Mantenga las moscas a 18 grados centígrados y 70% de humedad en la oscuridad hasta la prueba. Antes de la prueba. Mueve las moscas a 25 grados centígrados y deja que se aclimaten durante al menos una hora.

Evaluar la memoria a largo plazo. 24 horas después del entrenamiento. Después de los experimentos de comportamiento, limpie las tazas de olor con agua caliente y detergente inodoro.

Después del secado, aplique 10 microlitros de capa sigma a las tazas de olor. Luego caliente las tazas de olor en un horno de microondas para solidificar la capa sigma. Realice la agudeza olfativa introduciendo 100 moscas en el equipo después de 90 segundos, mueva las moscas al punto de elección y déjeles dos minutos para elegir entre olores puros y aire.

Luego recoge y cuenta las moscas. Para la reactividad a los golpes. Introduce las moscas en la cámara de choque.

Después de 90 segundos de descanso, administre una descarga eléctrica de CC de 60 voltios. Algunas de las moscas escaparán a un tubo similar sin recibir una descarga. Dale a las moscas dos minutos para elegir.

A continuación, recoge y cuenta las moscas que han escapado del tubo de choque para dilucidar los efectos del aprendizaje. Se realizaron una serie de experimentos con moscas adultas de tipo salvaje de Canton y se aprendió con moscas adultas mutantes DS. Las moscas Duns muestran una reducción en el aprendizaje en comparación con las moscas de tipo salvaje.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar llevar un registro exacto de qué moscas son cuáles y qué se les ha hecho. Tenga en cuenta que las moscas pueden estresarse fácilmente mientras se preparan, entrenan y prueban. Asegúrate de minimizar el estrés y ser constante.

No olvide que las ganancias de Joslin pueden mostrar variaciones diarias. Por lo tanto, tome la precaución de realizar sus procedimientos de control y experimentales aproximadamente a la misma hora del día y en las mismas condiciones. Si los controles dejan de aprender, intente analizar lo que se ha hecho de manera diferente en comparación con los días en que funciona el experimento.

Una vez que aísle la variable, intente ser más coherente con esa variable cuando realice el ensayo de memoria. En el futuro, buena suerte.