同时前和突触后电生理记录爪蟾
2013年3月11日
本视频演示了用来种植原代培养的胚胎的程序爪蟾神经和肌肉细胞和该制剂的同时前和突触后的膜片钳记录的用处。
该程序的总体目标是从非洲爪蟾胚胎中获得突触耦合脊髓神经元和肌肉细胞的原代培养物。这是通过首先通过将人绒毛膜中的阿托品注射到雄性和雌性青蛙中并收集受精卵来诱导非洲爪蟾繁殖来实现的。第二步是从第 22 阶段胚胎中去除果冻涂层、脂肪和膜。
接下来，从胚胎中分离出脊髓神经元和肌肉，并去除并丢弃皮肤。最后一步是将分离的细胞接种到培养皿中，并允许形成功能性神经肌肉接头。最终，可以通过来自培养中神经元和肌肉细胞的同步配对膜片钳记录来证明功能性突触连接。
这种技术的美妙之处在于它产生了一种易于获得的脊椎动物突触制剂。它可用于通过突触后电生理记录监测神经递质释放，同时测量突触前离子的发生。此外，这些方法清晰明了，除了解剖显微镜外，不需要任何特殊设备，然后可以将培养物在室温下储存在简单的培养基中。
这种准备可用于回答突触生理学领域的关键问题，包括突触前、生化和生物物理事件如何与神经递质释放耦合。此外，它还可用于研究神经调控突触发生和突触可塑性 要开始此过程，请根据随附的手稿准备所需的解决方案。然后通过将 minuchin 针粘到玻璃糊状移液器的末端来制造至少两个显微解剖工具。
使用 Sano 丙烯酸胶，让针的尖头伸出移液器末端约 0.5 厘米。在准备培养物前两天，通过观察雌性上突出的红色爪 aika 和雄性前爪平面上的深色色素沉着来识别一对准备繁殖的 XUS。接下来，将每只青蛙网网起来，用网将其腹侧朝下放在水槽中，以便它可以逃脱。
通过网和皮下注射 1 毫升 HCG 到其中一个背侧淋巴结袋中，以确保动物不会踩踏新产下的受精卵。在水箱底部安装 1 到 2 英寸的网孔尺寸为半英寸的屏蔽地板。然后将繁殖对一起放入一个有盖的 10 加仑水箱中。
让青蛙不受干扰 12 到 48 小时，直到在屏幕下方的地板上观察到受精卵。然后将动物从水箱中取出，但让鸡蛋至少 24 小时不受干扰。这对青蛙可以在六周后重新繁殖。
接下来，从水箱底部松开胚胎，将它们转移到四到五个含有 10% 盐水的 60 x 15 毫米培养皿中。根据新 coupe 的方案按阶段对胚胎进行分类，Faber 胚胎外观光滑，浅色、棕色和白色造型，如左图所示是理想的。另一方面，像右边的那些一样有大块黑色或白色斑块的胚胎通常是不健康且无法使用的。
在层流罩内，标记并填充大约 360 x 15 毫米无菌培养皿的一半，用 10% 盐水和一个 CMF 填充。使用无菌玻璃糊状移液器将 5 到 10 个胚胎转移到一个含有 10% 盐水的培养皿中，其中 8 个立体变焦解剖显微镜在引擎盖内，使用两对无菌镊子从每个胚胎中取出果冻涂层和透明膜。通过一次一个地将裸胚胎通过剩余的两个 10% 盐水培养皿，最后进入含有 CMF 的培养皿中来清洗裸胚胎。
接下来，用一对镊子轻轻但牢固地握住每个胚胎，并使用显微解剖工具去除位于动物最背侧的神经管和相关的肌节。通过制作三个切片来做到这一点，一个在神经管位置的两端，第三个就在它的腹侧。然后将每个解剖的神经管肌节移动到培养皿的干净部分，远离蛋黄颗粒和其他碎屑。
在 CMF 中约 15 分钟后，使用镊子将色素沉着的皮肤从解剖组织中提起并丢弃皮肤。再过 30 到 60 分钟后，细胞会随着彼此解离而形成沙堆。在此过程中，解冻一管 10 毫升的培养基，然后以 70 微升 ITS 解冻，每毫升 35 纳克，BDNF 标签，并用 L 15 培养基填充 35 毫米无菌培养皿的大约一半。
为您解剖的每个胚胎使用一个培养皿。要制备电镀移液器，请握住玻璃糊状移液器的两端，并将锥形部分放在火焰上。然后将两端拉开约 10 厘米。
随后折断末端，屈服于约 0.2 毫米的尖端。之后，使用电镀移液管吸出一个胚胎中堆积的沙子。小心尽量减少提取的溶液量。
接下来，将细胞排出到培养皿的底部，并将它们铺成几行。然后将铺板的细胞培养皿保持至少 15 分钟不受干扰，让细胞有时间附着在培养皿上。培养 12 至 24 小时后，铺板的细胞将形成独特的形态特征。
例如，肌肉细胞变成纺锤形，脊髓神经元发展长过程。尿酸盐、静脉曲张和肌肉细胞之间的功能性突触接触可以通过同时配对的电生理记录来确认。为此，请准备两个用于记录的贴片电极，一个用于突触前静脉曲张，一个用于肌肉细胞。
然后用含有 info terin 的溶液填充突触前电极，用钾内溶液填充突触后电极。之后，用 NFR 替换培养皿中的培养基。然后将其转移到装有面部对比光学元件的倒置显微镜中，用含有两性霉素的电极修补突触前静脉曲张，用另一个电极修补突触后肌肉细胞，以确认突触的功能，用膜片钳放大器去极化静脉曲张，并同时观察突触前和突触后电流。
该图显示了铺板后立即细胞和培养物的 5 倍倍放大图，这是在 40 倍放大下的相同培养物。这是培养中的神经肌肉接头，它显示了神经元体细胞、突触前、静脉曲张和突触后肌肉细胞。这里显示的是突触前电流和突触后电流。
响应从负 30 毫伏到正 40 毫伏的突触前静脉曲张的 10 毫伏增量电压步长的应用，两个细胞的保持电位均为负 70 毫伏一旦掌握，这项技术可以在大约两个小时内完成。然后可以在 24 小时内获得活细胞培养物，并且可以维持数天。这种制剂已经使用了很多年，有助于解释神经肌肉传递的一些基本特性。
我们希望该视频能够帮助调查人员更加熟悉这种强大而简单的技术，从而继续进行发现。
概述
此视频展示了用于生长非洲爪蟾胚胎神经和肌肉细胞的原代培养程序。这种准备对于同时进行突触前和突触后膜片钳记录非常有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 电生理学
背景
- 非洲爪蟾胚胎是研究突触生理的宝贵模型。
- 原代培养允许对神经肌肉接点进行检查。
- 同时记录提供了关于神经递质释放机制的见解。
- 该技术易于实施，只需最少的专门设备。
研究目的
- 获得突触连接的脊髓神经元和肌肉细胞的原代培养。
- 研究神经元和肌肉细胞之间的功能连接。
- 调查突触生理学中的关键问题。
使用的方法
- 诱导非洲爪蟾蛙繁殖并收集受精卵。
- 从胚胎中分离脊髓神经元和肌肉细胞。
- 将分离的细胞接种到培养皿中。
- 从神经元和肌肉细胞同时进行成对的膜片钳记录。
主要结果
- 可以在培养中建立功能性突触连接。
- 在培养的细胞中会发展出不同的形态特征。
- 电生理学记录确认了突触活动。
- 该准备对于研究神经递质释放是有效的。
结论
- 这种方法提供了一种简单的方法来研究突触生理学。
- 它允许探索神经调节和突触可塑性。
- 该技术对于回答神经科学中的基本问题非常有价值。
常见问题
Executive Industry Relevance
This Xenopus nerve-muscle co-culture system provides a vertebrate model for studying synaptic transmission mechanisms, enabling mechanistic de-risking in early-stage target validation for neuromodulator discovery. Simultaneous pre- and post-synaptic electrophysiological recordings deliver quantitative, causally linked data on ion channel function and neurotransmitter release, supporting predictive confidence in lead compound effects on synaptic physiology. The preparation’s accessibility, room-temperature compatibility, and rapid synapse formation facilitate scalable assay development for phenotypic screening of compounds affecting neuronal excitability or synaptic plasticity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by coupling presynaptic ionic current measurements with postsynaptic neurotransmitter release readouts.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of ion channel modulation effects on synaptic output in a vertebrate context.
- Predictive Value: Provides mechanistic insight into how molecular targets influence synaptic function, aiding portfolio triage of neuromodulator candidates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates stable, functional synapses within 12–24 hours, enabling timely compound screening windows.
- Quantitative Output: Delivers simultaneous pre- and postsynaptic current measurements as correlated electrophysiological endpoints for dose-response analysis.
- Scalability & Reuse: Uses simple culture media and room-temperature maintenance, supporting multi-well adaptation and cross-project reagent sharing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models vertebrate neuromuscular junction biology, applicable to studies of neuromuscular disorders and synaptic dysfunction.
- Translational Continuity: Bridges molecular target engagement (e.g., ion channel modulators) to functional synaptic outcomes, informing preclinical efficacy predictions.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of off-target effects on synaptic transmission, reducing late-stage attrition risk in CNS drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanistic readouts that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking presynaptic biophysical events (ion fluxes) to postsynaptic responses (neurotransmitter release).
- Screening: Delivers reproducible, dual-parametric electrophysiological outputs suitable for automated patch clamp integration in medium-throughput screening.
- Analytics: Generates synchronized pre- and postsynaptic current traces enabling correlation analysis, IC50/EC50 determination, and kinetic profiling of compound effects.
- Translational Research: Connects ion channel modulation to synaptic strength changes, offering a biomarker-aligned functional readout for preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vertebrate synaptic platform for iterative screening across multiple target classes (e.g., ion channels, GPCRs, SNARE regulators).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in synaptic pharmacology by providing direct, simultaneous pre- and postsynaptic measurements.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through defined culture protocols and room-temperature stability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering causally linked electrophysiological data, increasing confidence in target engagement translations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated effects on synaptic vesicle release and presynaptic excitability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell dissociation, patch clamp electrophysiology, and vertebrate tissue handling.
- Dependent on electrophysiology rigs with dual-channel recording capacity and micromanipulators for paired neuron-muscle targeting.
- Necessitates standardization of embryo staging, dissection timing, and culture conditions across users for data comparability.
- Adaptation to disease-relevant models may require genetic or pharmacological perturbation of Xenopus embryos to mimic human pathophysiology.
- Limited to acute synaptic studies (several days post-plating) due to overgrowth constraints, necessitating timely experimental execution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Pre-experimental Preparation
3:24
Microdissection of Xenopus embryos
4:51
Preparation of Nerve-muscle Co-cultures
5:52
Patch Clamping Nerve-muscle Synapses
7:02
Results: Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures
7:36
Conclusion
