同时记录突触前与突触后电生理信号 非洲爪蟾 神经-肌肉共培养

本实验的总体目标是从非洲爪蟾胚胎中获得突触连接的脊髓神经元和肌细胞的原代培养物。首先通过向雄性和雌性爪蟾注射人绒毛膜促性腺激素以诱导其繁殖，并收集受精卵。第二步是去除22期胚胎的胶状膜、卵黄膜和细胞膜。

接下来，从胚胎中分离脊髓神经元和肌肉，并去除皮肤后弃去。最后一步是将分离的细胞接种到培养皿中，使其形成有功能的神经肌肉接头。最终可通过在培养的神经元和肌细胞上同步进行成对膜片钳记录，来验证功能性突触连接的形成。

该技术的优点在于能够获得易于获取的脊椎动物突触标本。它可用于通过突触后电生理记录来监测神经递质释放，同时测量突前离子动态。此外，该方法清晰简便，除解剖显微镜外无需特殊设备，因此培养物可在室温下的简单培养基中保存。

该制备方法可用于解答突触生理学领域的一些关键问题，包括突触前事件、生化过程和生物物理过程如何与神经递质释放相偶联。此外，该方法也适用于神经调制、突触形成以及突触可塑性的研究。开始此操作前，根据随附的实验方案配制所需的溶液。然后，通过将微型解剖针固定在玻璃巴斯德吸管末端，制备至少两把显微解剖工具。

使用 Sano 丙烯酸胶水，使针的尖端从移液管末端伸出约 0.5 厘米。在准备培养物前两天，通过观察雌性 XUS 明显的红褐色螯肢 aika 以及雄性前肢掌面的深色色素沉着，确定一对已具备繁殖能力的 XUS。接着用网捕捞每只青蛙，并用网将其腹部朝下固定在水槽中，使其能够逃脱。

通过网具将一毫升HCG注射到其中一个背部淋巴囊中，进行皮下注射，以确保动物不会踩踏新产下且已受精的卵。在水箱底部安装带有筛网的底板，筛网孔径为半英寸，距底部高度为一至两英寸。然后将配对的繁殖个体一起放入一个带盖的10加仑水箱中。

将青蛙静置 12 至 48 小时，直至观察到受精卵出现在筛网下方的缸底。随后将成蛙从缸中移走，但受精卵需继续静置至少再过 24 小时。该对青蛙可在六周后再次用于繁殖。

接下来，将胚胎从容器底部松动，并转移至四到五个含有10%盐水的60 × 15毫米培养皿中。根据New & Köthe的胚胎分期方案对胚胎进行筛选：外观光滑、呈浅棕色或浅白色斑纹（如左侧所示）的胚胎最为理想。而具有较大黑色或白色斑块的胚胎（如右侧所示）通常不健康，不可使用。

在超净工作台内，将约360毫米×15毫米的无菌培养皿用10%盐水填充至半满，并另取一个培养皿加入CMF，均做好标记。使用无菌玻璃巴斯德吸管，在超净台内的体视变倍解剖显微镜下，将5至10个处于22至24期的胚胎转移至含有10%盐水的培养皿中，用两对无菌镊子逐个去除每个胚胎的胶膜和外膜。将裸露的胚胎依次通过另外两个盛有10%盐水的培养皿进行清洗，最后移入含有CMF的培养皿中。

接下来，用一对镊子轻轻但牢固地夹住每个胚胎，使用显微解剖工具去除位于动物背侧最上方的神经管及与其相关的体节肌。通过进行三个切口来完成此操作：两个切口分别位于神经管位置的两端，第三个切口位于神经管腹侧稍下方。然后将分离出的神经管和体节肌转移到培养皿中干净的区域，远离卵黄颗粒和其他碎片。

在 CMF 中放置约 15 分钟后，用镊子将有色素的皮肤从解剖组织上提起并丢弃。再经过额外 30 至 60 分钟，细胞将相互分离，形成类似沙堆的形态。在此步骤中，解冻一支 10 毫升的培养基试管，随后加入 70 微升 ITS，浓度为 35 纳克/毫升，BDNF 标记，并用 L-15 培养基将 35 毫米无菌培养皿填充至约一半。

每个已解剖的胚胎使用一个培养皿。制作铺板移液管时，用手握住玻璃巴斯德移液管的两端，将尖端部分置于火焰上加热，然后将两端拉开至约10厘米。

随后折断末端，使尖端直径约为 0.2 毫米。然后使用铺板移液管从一个胚胎中吸取沙堆，注意尽量减少吸入的溶液量。

接下来，将细胞排出并接种到培养皿底部，呈多条线状排列。然后将接种了细胞的培养皿静置至少15分钟，以使细胞有足够时间贴附于培养皿表面。培养12至24小时后，接种的细胞将呈现出明显的形态学特征。

例如，肌肉细胞会变为纺锤形，脊髓神经元则会发育出较长的突起。通过同步的成对电生理记录，可以确认尿酸、曲张体与肌肉细胞之间形成的功能性突触连接。为此，需准备两个用于记录的膜片电极，一个用于记录突触前曲张体，另一个用于记录肌肉细胞。

然后用含有信息素的溶液填充突触前电极，用钾离子内液填充突触后电极。接着，将培养皿中的培养基更换为NFR。随后将其转移至配备相差光学系统的倒置显微镜下，用含两性霉素的电极封接突触前膨体，用另一电极封接突触后肌细胞，以确认突触的功能性；利用膜片钳放大器去极化膨体，并观察同步的突触前和突触后电流。

该图显示了细胞和培养物在接种后立即观察到的5倍放大视野，以及同一培养物在40倍下的图像。此处为培养中的神经肌肉接头，显示了神经元胞体、突触前末端、曲张体以及突触后肌细胞。图中所示为突触前和突触后电流。

当对突触前膨体施加从 -30 毫伏至 +40 毫伏、每步 10 毫伏的递增电压刺激时，两个细胞的钳制电位均保持在 -70 毫伏。掌握该技术后，整个操作可在约两小时内完成。 viable cell cultures 可在 24 小时内获得，并可维持数天。该制备方法已应用多年，有助于阐明神经肌肉传递的一些基本特性。

我们希望本视频能够帮助研究人员更加熟悉这一强大而简便的技术，从而推动科学发现的持续进展。