肽为基础的识别功能图案和具有约束力的合作伙伴

本视频介绍了一组四个实验，用于鉴定功能性 HIV、一个 NPH 蛋白基序和开发基于肽的抑制剂。源自全长蛋白中发现的基序的特异性短肽，既保留了其生物学功能，又竞争性地抑制了全长蛋白的功能以识别凋亡基序。在 HIV 中，一种 NEF 混搡猫细胞暴露于 NEF 扫描肽，并进行隧道凋亡测定以鉴定诱导细胞凋亡的肽。

第二组肽，包含 NEF 分泌基序的变体。分泌修饰区或 SMR 与 NPH 一起转染到细胞中，由于 nph 分泌减少表明竞争性抑制，GFP 功能丧失。通过荧光测定法评估 GFP 以确定与 nef 的分泌修饰区或 SMR 相互作用的细胞因子。

使用 SMR 野生型 NPH 作为诱饵进行 Coun 沉淀。最后，为了测试这些相互作用是否影响分泌，将针对已鉴定的结合伴侣的抗体转染到细胞中。为了评估它们是否拮抗 NF 基序的分泌，获得的结果确定了 NEF 中的两个功能性凋亡基序和一个拮抗功能性 NEF 分泌基序的抑制剂肽以及分泌所需的细胞结合伴侣。

这组四项实验的总体目标是加速识别靶蛋白中的功能基序，然后使用该数据开发这些功能基序的肽碱基抑制剂。这套方案对我们小组非常有用，可以帮助我们回答与 HIV 发病机制相关的关键问题，例如了解 neph 驱动的分泌在发病机制中的作用，以及破译 neff纵外泌体运输途径的能力的潜在机制。今天演示这些程序的是 Ming Bo Huang 博士，他是我实验室的研究讲师。

从一组肽开始此过程，扫描本实验的目标区域。从 AIDS 试剂程序中获得 20 mer 肽，具有 10 个氨基酸重叠，跨越整个 HIV one NPH 蛋白。为了鉴定 NPH 凋亡基序，使用 NEF 扫描肽单独进行细胞凋亡测定，如下所示，每 35 毫米混蛋帽板、细胞培养物加入 1 毫升含有每毫升 10 纳克肽的培养基，并在 37 摄氏度下孵育培养物 24 小时。

孵育后，进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的 DUTP、生物素缺口和标记或隧道测定以评估细胞凋亡。为此，首先用 PBS 洗涤细胞，然后吸出 PBS 并在 PBS 中加入 4% 多聚甲醛，在室温下孵育 30 分钟以固定细胞，固定细胞后，用 PBS 洗涤并添加 Triton X 100，在室温下孵育 10 分钟以渗透它们。细胞固定并渗透后，加入隧道试剂，并在透透后在 37 摄氏度下孵育细胞 1 小时。

用 PBS 冲洗细胞两次。然后在计算机控制的显微镜系统上通过落射荧光确定染色细胞的百分比。如随附文件所述，使用 chariot 蛋白递送试剂盒用 NPH、GFP 质粒和 SMR 肽的不同变体切割 jca 细胞后，收获培养基以通过荧光显微镜测定转染效率。

捕获荧光和明场图像并确定细胞百分比。然后转染以评估对 NPH GFP 分泌的抑制，将 100 μL 无细胞条件培养基转移到 96 孔黑色微量滴定板的各个孔中。使用激发波长为 485 纳米、发射波长为 515 纳米的荧光计以相对荧光单位测量培养基中的 GFP 荧光。

读取完成后，将数据传输到 PC。将对照培养基中的 GFP 荧光水平设置为 100%，然后将其与与各种 SMR 肽共转染的细胞的培养基中的 GFP 荧光水平进行比较，以确定 NPH GFP 分泌的变化。用于分离基序结合伴侣的 co IP 是一个困难的步骤。

确保在孵育过程中适当搅拌磁珠，并在每个洗涤步骤中从磁珠中去除尽可能多的液体。通过在 4 摄氏度下以 1000 倍 G 离心 20 分钟，在 T 75 组织培养瓶沉淀细胞中，在 37 摄氏度下含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中培养混蛋帽细胞。将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并将其转移到 1.5 mL 微量离心管中。

以 1000 倍 G 旋转 1 分钟。然后将沉淀重悬于 1 mL Anti-Flag 裂解液中。通过轻柔移液、差别微量离心机进行缓冲。

悬浮液在 2000 倍 G 下保持 5 分钟，在 13， 000 倍 G 下悬浮 10 分钟。为了沉淀细胞碎片和 DNA，分别收集上清液，以下称为裂解物。测定蛋白质浓度后，将 1 毫克裂解物蛋白和 1 微克 SMR 野生型或 SMR 突变肽添加到 20 微升 Anti-Flag M 双亲和凝胶中。

这种亲和凝胶以下简称树脂，使混合物在 co IP 缓冲液中达到 1 毫升的最终体积。还要制备阴性对照，其中裂解物在不存在任一肽的情况下与树脂混合。将混合物在 4 摄氏度下孵育过夜，并端到端旋转。

第二天，以 5， 000 至 8， 000 倍 G 的微量离心沉淀树脂，持续 30 秒。离心后，等待 1 到 2 分钟后再处理样品，让树脂在试管中沉淀。用窄端移液器吸头或 Hamilton 注射器去除上清液，注意不要转移任何树脂。

通过复苏洗涤树脂四次，将其悬浮在 500 微升洗涤缓冲液中，然后进行微量离心。洗脱结合的细胞蛋白。在 50 μL 洗涤缓冲液中向试管中加入 15 μg 过量的 3 x Flag 肽，并在室温下在摇床上孵育 30 分钟，然后以 5， 000 至 8， 000 倍 G 孵育离心 30 秒。

让试管静置 2 分钟后，收集并保存含有逃脱蛋白的上清液。通过丙酮沉淀浓缩 EIT 后，将样品在 laly 样品缓冲液中煮沸。然后通过 SDS 页面在 40 至 20% triss 上分离蛋白质，HCL 标准预制凝胶用 kumasi 亮蓝 R 二 50 染色凝胶。

如随附文件所述，要使用 chariot 蛋白递送试剂盒用 NGFP 和 Antifa 微管蛋白或抗死亡抗体转染 JCA 细胞，以评估抗体抑制 cot 转染 JCA 细胞，从收获的细胞中收集无细胞条件培养基。将 100 μL 转移到 96 孔黑色微量滴定板的各个孔中。然后使用激发波长为 485 纳米、发射波长为 515 纳米的荧光计（以相对荧光单位）测量培养基中的 GFP 荧光。

读取板后，将数据传输到 PC 并将抗脂肪微管蛋白对照中的 GFP 荧光水平设置为 100%将其与用抗死亡抗体转染的细胞床的培养基中的 GFP 荧光水平进行比较，以确定 NEF GFP 分泌的变化以绘制 HIV 的凋亡基序 一种 NPH 蛋白肽扫描分析，如本视频所述进行。Y 轴显示隧道标记的细胞的百分比，x 轴表示治疗条件，如图所示，确定了 HIV 的一个 NEF 的两个独立区域，它们诱导细胞凋亡。这些表现为暴露于 neph 肽的细胞的隧道标记增加。

凋亡的峰用基序 1 和基序 2 表示，以评估 SMR 野生型肽培养基对 neph 分泌的竞争性抑制，该培养基来自用 NPH GFP 克隆横切的混蛋 CAT T 细胞 cot 和各种 SMR 肽测定外泌体 NPH 分泌，如含有一个或多个野生型 NPH SMR 序列基序的培养基肽中的 GFP 荧光所示抑制外泌体 NEF 的分泌而该区域内任何氨基酸的丙氨酸替代大大降低了肽的有效性。这表明 SM R 野生型肽抑制 exo omal nph，这是 neff 凋亡基序的 11 个氨基酸加扰版本。先前描述并从 Sigma Genesis 获得的一种 SM 用作阴性对照，对外泌体 NEP 分泌没有影响。

这张 kumasi 染色的 SDS 页面凝胶图像显示了 60、65、75 和 250 道尔顿大小的 SMR 野生型肽对四种蛋白质的免疫共沉淀。阴性对照 SMR 突变肽未捕获这些蛋白质，并且这些蛋白质不会与亲和树脂非特异性相互作用。在没有 SMR 野生型肽的情况下，这些结果表明 coun 沉淀蛋白与 SMR 野生型肽的 SMR 基序特异性相互作用。

读板器测定显示，用 neph 表达质粒转染抗死抗体的 cot 完全消除了 exo omal NPH 分泌。无关抗体对体外分泌没有影响。这些结果表明，外 OM 肾炎分泌需要完整的 NM 天赋相互作用。

总之，在观看了本视频后，您应该已经很好地理解了如何使用描述技术来识别靶蛋白中的功能基序，并使用这些数据来开发这些功能基序的肽碱基抑制剂。在尝试 co IP 程序时，请务必记住在执行孵育洗涤时要特别注意，确保在孵育过程中适当搅拌珠子，并在每个洗涤步骤中从珠子中去除尽可能多的液体。此外，在细胞和裂解物树脂洗涤过程中，树脂洗涤始终允许树脂在离心后沉淀。

使用窄端移液器吸头并进行四次洗涤，以将背景充分降低到可接受的水平。