Name: 肽为基础的识别功能图案和具有约束力的合作伙伴 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: 学习利用肽扫描、凋亡检测和共免疫沉淀技术识别HIV-1 Nef蛋白中的功能基序，并开发竞争性肽抑制剂阻断其致病功能。该方法为研究病毒发病机制提供了新策略。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）/普通医学科学研究所（NIGMS）/少数族裔学院研究支持计划（MBRS）（资助号58268）、NIH/国家研究中心资源中心（NCRR）/研究中心提升计划（RCMI）（资助号G12-RR03034）、佐治亚研究联盟资助项目GRA.VAC08.W、NIH/过敏与传染病研究所（NIAID）/国家研究服务奖（NRSA）资助项目F31AI091484以及埃默里大学艾滋病研究中心（CFAR）资助项目P30 A1050409的支持。本研究在由NIH/NCRR研究设施改进资助项目（资助号C06 RR18386）支持建设的设施中进行。Jurkat细胞、20种HIV-1 Nef肽段以及兔抗HIV-1 Nef抗血清均来自NIH艾滋病研究与参考试剂计划（美国马里兰州洛克维尔）。

一、短肽在生物分析中的应用
一.1. 利用多肽绘制生物学功能基序
<ol>
 <li>使用 Nef 扫描肽处理细胞
 <ol>
 <li>获取一组覆盖目标区域的肽段。在我们的实验中，采用来自艾滋病试剂项目（AIDS Reagent Program）的 20 聚体肽段，每段肽包含 10 个氨基酸的重叠，覆盖整个 HIV-1 Nef 蛋白（205 个氨基酸）。肽段按以下方式单独进行检测：</li>
 <li>向细胞培养基中加入 10 ng/ml 的肽段。</li>
 <li>每孔板加入 10 ml 培养基至 Jurkat 细胞培养物中。</li>
 <li>在 37 °C 下孵育 24 小时。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 生物素缺口末端标记（TUNEL）凋亡检测
 <ol>
 <li>用 1× PBS 洗涤细胞，并在室温下用含 4% 多聚甲醛的 1× PBS（pH 7.4）固定 30 分钟。</li>
 <li>用 1× PBS 洗涤，然后在室温下用 0.1% Triton X-100 透化 10 分钟。</li>
 <li>用 1× PBS 将细胞漂洗两次。</li>
 <li>在计算机控制的荧光显微镜系统上计数染色细胞。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
一.2. 使用肽段进行竞争性抑制分析
<ol>
 <li>使用Chariot蛋白递送试剂盒共转染肽段
 <ol>
 <li>每份转染反应混合物中，将1 μg wtNef-GFP质粒DNA和100 ng来源于SMR结构域的野生型肽段或SMR基序中单个氨基酸被丙氨酸取代的突变肽段，用1× PBS稀释至终体积100 μl。</li>
 <li>将6 μl已按1:10稀释的Chariot试剂用无菌水稀释至终体积100 μl，并与稀释后的DNA-肽段混合液混合。</li>
 <li>室温孵育30分钟，以形成Chariot/DNA-肽段复合物。</li>
 <li>通过在600 × g离心5分钟，沉淀3 × 105个Jurkat细胞。</li>
 <li>用1× PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于Chariot/DNA-肽段复合物中。</li>
 <li>向悬液中加入400 μl无血清RPMI 1640培养基，将细胞接种于培养板中，在37 °C培养2小时。</li>
 <li>向每孔加入1 ml含10%胎牛血清（FBS）的新鲜RPMI 1640培养基，在37 °C继续培养48小时。</li>
 <li>收集细胞，并通过荧光显微镜检测转染效率。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Nef-GFP分泌的荧光酶标仪检测法用于评估肽段抑制作用
 <ol>
 <li>收集经处理细胞的无细胞条件培养基，取100 μl转移至96孔黑色微孔板的各个孔中。</li>
 <li>使用Tecan GENEios荧光酶标仪检测培养基中的GFP荧光强度，激发波长为485 nm，发射波长为515 nm，结果以相对荧光单位表示。</li>
 <li>将对照组（共转染Nef-GFP与随机序列肽段的细胞培养基）中的GFP荧光水平设定为100%。</li>
 <li>比较共转染不同SMR肽段的细胞培养基中GFP荧光水平的变化，以评估Nef-GFP分泌的改变情况。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
I.3. 使用肽段作为诱饵分离基序结合伴侣
<ol>
 <li>使用 SMR 肽进行共免疫沉淀
 <ol>
 <li>在 37 °C 条件下，将 Jurkat 细胞培养于含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基中，置于 T-75 组织培养瓶内，通过在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 20 分钟收集细胞沉淀。将培养板置于荧光显微镜下观察，拍摄图像，计数总细胞数和标记细胞数，计算标记细胞的百分比以确定转染效率。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于 1 ml 1× PBS 中，并转移至 1.5 ml Eppendorf 管。以 1,000 × g 微量离心 1 分钟。通过轻柔吹打，将沉淀重悬于 1 ml α-FLAG 裂解缓冲液中。裂解缓冲液配方：将 50 mM Tris•HCl（pH 7.4）、150 mM 氯化钠（NaCl）、1 mM EDTA 和 1% Triton X-100 混合，并在使用前加入 1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 10 μl/ml 适用于哺乳动物细胞和组织提取物的蛋白酶抑制剂混合物（PIC；Sigma）。现配现用。</li>
 <li>将悬液分别以 2,000 × g 离心 5 分钟、13,000 × g 离心 10 分钟，依次去除细胞碎片和 DNA 沉淀。收集上清液（以下简称“裂解液”）。</li>
 <li>向 20 μl 抗-FLAG M2 亲和凝胶（以下简称“树脂”；Sigma）中加入 1 mg 裂解液蛋白以及 1 μg 的 SMRwt 或 SMRmut 肽。注意：此处使用的 SMRwt 和 SMRmut 肽均含有嵌入的 FLAG 标签序列。用 Co-IP 缓冲液（即不含 PMSF 和 PIC 的 α-FLAG 裂解缓冲液）将总体积调至 1 ml。4 °C 下翻转孵育过夜。作为阴性对照，将裂解液与树脂孵育但不添加任何肽。</li>
 <li>以 5,000–8,000 × g 微量离心 30 秒使树脂沉淀。处理样品前静置 2 分钟，随后小心吸除上清液。使用窄口移液枪头或 Hamilton 注射器移除上清液，注意避免转移树脂。窄口枪头可通过镊子夹紧塑料枪头开口使其部分闭合制得。用 500 μl 洗涤缓冲液（50 mM Tris•HCl pH 7.4，150 mM NaCl）洗涤树脂四次。加入含 15 μg 3× FLAG 肽（Sigma）的 50 μl 洗涤缓冲液洗脱结合的细胞蛋白，室温下在摇床中孵育 30 分钟。</li>
 <li>通过丙酮沉淀浓缩洗脱液，随后在 Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad）中煮沸。在 4–20% Tris-HCl Criterion 预制胶（Bio-Rad）上进行 SDS-PAGE 分离蛋白。使用考马斯亮蓝 R-250（Bio-Rad）染色凝胶。注意：在质谱鉴定实验（图 4A）中，每种条件（与 SMRwt、SMRmut 或无肽进行 Co-IP）均设置四次重复，所有四次重复的洗脱液在丙酮沉淀前合并，每种条件共投入 4 mg 总蛋白。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>使用 Nef-GFP 蛋白进行共免疫沉淀
 <ol>
 <li>在 1 ml 含 0.02% Tween 20 的 1× PBS（PBS-T）中，将 50 μl Dynabeads Protein G 磁珠（Invitrogen）与 2 μg 小鼠单克隆抗-GFP 抗体混合。在 4 °C 下于 1.5 ml Eppendorf 管中翻转孵育 1 小时。</li>
 <li>将试管置于 1.5 ml MagnaSphere 技术磁力分离架（Promega Corp., Madison, WI）上，使磁珠吸附，分离磁珠与缓冲液，并弃去上清液。使用轻柔吹打方式，用 1 ml PBS-T 洗涤包被抗-GFP 的磁珠。</li>
 <li>使用 1 ml 1× RIPA+ 缓冲液轻柔吹打并冰上孵育 15 分钟，裂解转染了 Nef-GFP 的 Jurkat 细胞。RIPA+ 缓冲液配方：将 10× RIPA 裂解缓冲液（pH 7.4；Millipore, Bedford, MA）用无菌水稀释 10 倍，加入 0.02% 叠氮化钠（Sigma）和 0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS），并在使用前立即加入 1 mM PMSF 和 10 μl/ml PIC。</li>
 <li>以 2,000 × g 微量离心 10 分钟，沉淀细胞碎片。收集上清液（以下简称“裂解液”）。</li>
 <li>向包被抗-GFP 的磁珠中加入 1 mg 裂解液蛋白，用 1× RIPA+ 缓冲液定容至 1 ml，4 °C 下翻转孵育 1 小时。注意：在肽竞争实验中，可在加入包被抗-GFP 的磁珠前，先将 1 mg 裂解液蛋白与 2 μg SMRwt 或 SMRmut 肽在 1 ml 1× RIPA+ 缓冲液中预孵育。</li>
 <li>通过重悬于 1 ml 洗涤缓冲液（50 mM Tris•HCl pH 7.4，150 mM NaCl，0.1% Tween 20）中洗涤磁珠。4 °C 下翻转孵育 5 分钟。使用磁力分离架分离磁珠与洗涤液。第二和第三次洗涤分别使用含 250 mM 和 300 mM NaCl 的洗涤缓冲液。</li>
 <li>将磁珠重悬于 200 μl PBS 中，转移至洁净试管，使用磁力架分离磁珠与洗涤液。在 50 μl Laemmli 样品缓冲液中 95 °C 煮沸 5 分钟，室温冷却 10 分钟，再次置于磁力架上分离，收集上清液（“洗脱液”）。</li>
 <li>在 8–16% Tris-HCl Criterion 预制胶上通过 SDS-PAGE 分离洗脱液中的蛋白。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>质谱分析
 <ol>
 <li>从考马斯亮蓝染色的凝胶中切取目标蛋白条带。</li>
 <li>在 37 °C 条件下，使用 10 mM 1,4-二硫苏糖醇（DTT）还原样品 45 分钟。</li>
 <li>在 25 °C 条件下，使用 55 mM 碘乙酰胺烷基化样品 45 分钟。</li>
 <li>在 37 °C 条件下，使用测序级胰蛋白酶（Promega）过夜消化样品。</li>
 <li>使用 C-18 ZipTip（Millipore）对样品肽段进行脱盐。将样品肽段与 alpha-CHC 基质（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）混合，点样至 MTP 目标板 III（Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA）。</li>
 <li>使用 Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF 仪器进行串联基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF/TOF）质谱分析。</li>
 <li>使用 Mascot 算法（<a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a>）将 MS/MS 数据比对至 NCBI 非冗余数据库和 Swiss-Prot 数据库。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>免疫印迹分析
 <ol>
 <li>在 4–20% 或 8–16% Tris-HCl Criterion 预制胶（Bio-Rad）上通过 SDS-PAGE 分离蛋白样品。通过电泳将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜。</li>
 <li>在 Tris 缓冲盐水（TBS；Bio-Rad）中洗涤膜 5 分钟。在含 0.1% Tween 20 的 TBS（TTBS）中加入 5% 脱脂奶粉，室温摇动封闭 1 小时。</li>
 <li>在 4 °C 下，使用含特定一抗的 5% 脱脂奶粉溶液摇动孵育膜过夜。用 TTBS 洗涤 20 分钟，随后加入含辣根过氧化物酶（HRP）标记的 IgG（H+L）二抗的 5% 脱脂奶粉溶液，室温孵育 1 小时。再用 TTBS 洗涤 30–60 分钟。</li>
 <li>使用 Western Blotting Luminol 试剂（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）检测蛋白条带。将膜暴露于X光胶片。注意：在部分实验中，使用剥离试剂（Pierce, Rockford, IL）剥离膜，随后与不同的第一抗体和第二抗体进行再次杂交。</li>
 <li>将X光胶片扫描至 Adobe Photoshop 5.0.2。使用 ImageJ 软件（美国国立卫生研究院，Bethesda, MD）进行密度分析。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
II. 抗体抑制在功能分析中的应用
II.1. 使用 Chariot 蛋白递送试剂盒共转染抗体
<ol>
 <li>每转染反应体系中，将1 μg wtNef-GFP质粒DNA和1 μg抗mortalin抗体或抗α-微管蛋白抗体用1×PBS稀释至终体积100 μl。注意：先前研究发现，共转染抗α-微管蛋白抗体对exNef分泌无明显影响，因此在本实验中可作为有效的阴性对照。</li>
 <li>将6 μl未稀释的Chariot转染试剂用无菌水稀释至终体积100 μl，并与已稀释的DNA-抗体混合液混合。</li>
 <li>室温孵育30分钟，以形成Chariot/DNA-抗体复合物。</li>
 <li>通过在600 × g离心5分钟，沉淀3 × 105个Jurkat细胞。</li>
 <li>用1×PBS洗涤细胞两次，然后重悬于Chariot/DNA-抗体复合物中。</li>
 <li>向细胞悬液中加入400 μl无血清RPMI 1640培养基，将细胞接种于培养板中，在37 °C培养2小时。</li>
 <li>每孔加入1 ml含10%胎牛血清（FBS）的新鲜RPMI 1640培养基，于37 °C继续培养48小时。</li>
</ol>
II.2. 抗体抑制 Nef-GFP 分泌的荧光板读数仪检测
<ol>
 <li>收集收获细胞后的无细胞条件培养基，并将100 μl转移至96孔黑色微孔板的各个孔中。</li>
 <li>使用Tecan GENEios荧光计在激发波长485 nm、发射波长515 nm条件下，以相对荧光单位测定培养基中的GFP荧光强度。</li>
 <li>将对照组（共转染Nef-GFP和抗α-微管蛋白抗体的细胞培养基）中的GFP荧光水平设定为100%。</li>
 <li>将该值与共转染抗mortalin抗体细胞培养基中的GFP荧光水平进行比较，以确定Nef-GFP分泌的变化。</li>
</ol>

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<li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

阐明Nef调控外泌体运输途径的分子机制，将有助于设计新型外泌体Nef（exNef）分泌抑制剂。抑制exNef的分泌有望减轻导致HIV/AIDS发病机制的CD4+ T细胞耗竭和慢性免疫激活（CIA）。为实现这一目标，我们开发了多种新型试剂和方法，用于分析exNef分泌的遗传学基础，并初步确定参与该过程的细胞蛋白。该研究策略还促成了首个直接靶向exNef分泌的抑制剂——SMRwt肽的开发。
本研究的一个关键发现是，源自全长蛋白中特定基序的短肽（在本例中为 HIV-1 Nef 蛋白）不仅能够保留其生物学功能，还能竞争性地抑制全长蛋白的功能。由于这些短肽保留了其生物学活性，因此可用于鉴定全长蛋白中的功能结构域。实现这一目标需要两点：一是合成一组覆盖目标蛋白全长或其特定区域（推测含有功能结构域）的扫描肽段；二是建立一种检测特定生物学功能的实验方法。由于我们缺乏可将凋亡诱导基序的搜索范围缩小至 Nef 蛋白特定区域的信息，因此采用了覆盖其全长的一组肽段。尽管 Nef 蛋白相对较小，使这一过程更为简便，但我们也已将该方法应用于更大的（&gt;75 kDa）蛋白。我们采用了一种成熟的凋亡检测方法（...

随着抗逆转录病毒疗法的出现，西方世界的艾滋病流行已有所减缓，但并未得到遏制，全球范围内艾滋病毒的传播仍然是重大的公共卫生负担。除效果有限的RV144泰国试验外，迄今为止的HIV疫苗均未能显示出预防感染的保护作用。因此，对其他潜在治疗靶点的研究仍然十分必要。
除了CD4 T细胞耗竭外，持续性全身免疫活化也是HIV感染的特征之一。这种慢性免疫活化（CIA）可导致细胞更新加快、淋巴细胞亚群活化与分化、细胞耗竭和衰老，并通过活化诱导的细胞死亡（AICD）1,2,3 杀伤T细胞和B细胞，已被广泛证实为疾病进展最强的预测指标之一4,5,6,7,8,9,10,11,12。然而，HIV感染中CIA和CD4 T细胞耗竭的潜在机制仍有待完全阐明。
我们实验室及其他实验室的研究证据使我们提出了一个疾病进展模型（图1），其中HIV蛋白Nef（负向调节因子）可诱导其从HIV-1感染的细胞中以外泌体形式分泌13,14。这些含Nef的外泌体（exNef）可在多种细胞谱系中诱导细胞凋亡，包括未感染的CD4 T细胞15,16。此外，在单核细胞/巨噬细胞中，exNef可改变基因表达模式，例如细胞因子的表达，并似乎诱导了一种非程序性免疫激活状态。这些证据表明exNef在CIA及CD4 T细胞耗竭中具有重要作用。
阐明Nef调控外泌体运输途径的分子机制，将有助于设计新型外泌体Nef（exNef）分泌抑制剂。抑制exNef的分泌应可减轻导致艾滋病（HIV/AIDS）发病机制的CD4+ T细胞耗竭和慢性免疫激活（CIA）。
为了收集支持我们提出的HIV/AIDS疾病进展模型的证据，以及进一步完善该模型的相关数据，我们开发了一系列新型试剂和方法，使我们能够分析exNef分泌的遗传机制，并初步确定参与其中的细胞蛋白。在早期研究中，我们发现Nef蛋白可诱导旁观者细胞发生凋亡，并能从转染Nef基因的细胞以及HIV感染的细胞中释放到细胞外15。此前已有研究表明，来源于SDF-1α（基质细胞衍生因子-1，具有选择性剪接的α亚型）的肽段能够保留全长分子大部分的结合和信号传导活性17。我们推测，Nef蛋白的肽段可能也保留了全长蛋白的部分促凋亡活性，而这些肽段必然包含Nef的促凋亡结构域。为鉴定这些肽段及其对应的Nef促凋亡结构域，我们从美国国家卫生研究院（NIH）艾滋病研究与参考试剂项目获得了一组由20条HIV-1 Nef扫描肽组成的肽库。这些20个氨基酸长度的肽段彼此之间重叠10个氨基酸，以其最后一个氨基酸的编号命名，i.e. N20覆盖Nef蛋白第1至20位氨基酸，N30覆盖第11至30位氨基酸，依此类推16。我们发现，将特定肽段外源性地作用于T细胞，这些肽段若覆盖Nef全长蛋白中两个不同的10个氨基酸结构域，则可诱导T细胞发生凋亡。对这些来源于Nef的促凋亡肽段的进一步分析表明，它们能够与T细胞表面的趋化因子受体CXCR4发生直接的物理相互作用，其结合动力学特征使这些肽段能够竞争性地抑制CXCR4与其天然配体SDF-1α之间的结合。最终发现，这些来源于Nef的促凋亡肽段与CXCR4的相互作用可在T细胞中引发应激反应，从而导致细胞凋亡。这些证据使我们能够快速定位Nef蛋白的功能结构域，而若采用丙氨酸扫描突变等传统的DNA诱变技术，则需耗时更长。此外，该研究也表明，这些短的Nef衍生肽段保留了全长蛋白中促凋亡结构域的生物学功能。
在确定了细胞外Nef的作用后， 即 T细胞凋亡，我们希望更深入地了解Nef蛋白从细胞中分泌的机制。通过使用一系列突变的Nef构建体，我们定位了HIV Nef及其恒河猴等同物SIV Nef蛋白N端区域中高度保守的蛋白基序mac （猴免疫缺陷病毒）Nef，对exNef分泌至关重要13 其中一个基序——分泌修饰区（Secretion Modification Region, SMR；66VGFPV70）尤为关键，因其五个氨基酸中的任何一个被丙氨酸取代后，均会显著降低或完全阻断外泌Nef（exNef）的分泌。当通过Active Motif公司的Chariot蛋白递送试剂将包含SMR并连接FLAG肽序列的肽段（SMRwt）递送至细胞时，发现其可抑制Nef转染细胞和HIV感染细胞中外泌Nef的分泌。 18根据我们之前对多肽的研究经验，我们决定采用该多肽来阐明介导Nef SMR在exNef分泌中作用的分子及其机制。
以SMRwt肽作为“诱饵蛋白”，我们从未感染的T细胞裂解液中共同免疫沉淀了SMR的细胞结合伴侣18。FLAG肽序列为我们提供了便捷的抓手，可利用抗FLAG亲和树脂捕获SMRwt肽。我们先前发现，SMRwt肽中单个缬氨酸到丙氨酸的突变足以消除其对exNef分泌的抑制作用，这一发现确定了一种便捷且高度特异性的对照肽（SMRmut），用于排除非SMR特异性的共免疫沉淀蛋白。使用仅包含特定目的结构域的肽段而非全长蛋白，使我们能够绕过对结合Nef其他结构域的数十种细胞因子的筛选19。
在确定了SMR结合蛋白后，合乎逻辑的下一步是证明这些鉴定出的细胞结合蛋白对生物学功能具有重要作用18。实现这一目标的标准方法是使用靶向特定蛋白的miRNA或siRNA降低蛋白水平，随后检测其对生物学功能的影响。我们采用了miRNA敲低技术，该技术通过抑制靶mRNA的翻译，减少目标蛋白（在本例中为SMR结合蛋白）的生成。这种靶蛋白水平的降低是一种间接效应，可能对其所参与的生物学功能产生延迟影响。因此，我们还采用了较为少见的抗体抑制技术，以确定直接干扰靶蛋白的活性是否能够减弱或消除该生物学功能。在此实验中，将针对靶蛋白产生的抗体利用Chariot试剂转染入细胞，使其直接与靶蛋白结合，从而将其隔离于功能位点之外，或阻断其关键的结合结构域。通过该方法对靶蛋白进行抑制，可直接破坏其功能，并可作为RNA敲低实验的补充，进一步验证靶蛋白在该生物学功能中的重要性。
尽管Chariot试剂在将多肽和蛋白质递送入细胞方面具有较好效果，但该过程耗时较长，且限制了可开展的实验类型， 例如 长期或重复暴露 体内 因此，我们在SMRwt肽上添加了一段细胞穿透肽（CPP）序列，制备了SMRwt-CPP肽18 以生成一种可从培养基中被动进入细胞的多肽。该版本在抑制外泌Nef分泌方面与前者同样有效。
这些已发表实验的结果表明，含有特定功能基序的小肽能够通过竞争性抑制来拮抗全长蛋白的功能，并可用于分离与这些基序结合的蛋白质。可以预期，这些技术在许多实验方案中都具有应用价值。此外，它们还可用于设计针对多种细胞过程的新型肽类抑制剂；若与细胞穿透肽（CPP）序列连接，其功能可进一步增强。

<table><tbody><tr><td>含有10个氨基酸重叠的20肽序列集合</td><td>NIH 艾滋病研究与参考试剂项目</td><td>4641</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL 检测</td><td>罗氏（Roche）</td><td>11 684 809 910</td><td></td></tr><tr><td>Chariot 蛋白递送试剂</td><td>Active Motif</td><td>30100</td><td></td></tr><tr><td>Tecan GENEios 荧光计</td><td>（Tecan Group，瑞士）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔黑色微孔板</td><td>Corning</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG M2亲和凝胶</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>100.03D</td><td></td></tr><tr><td>MagnaSphere 技术磁性分离架（双位置）</td><td>Promega Corp.，麦迪逊，威斯康星州，美国</td><td>Z5332</td><td></td></tr><tr><td>C-18 ZipTip</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>C18 树脂（0.6 &amp;mu;l 或 0.2 &amp;mu;l 床体积）。适用于水溶液中的寡核苷酸或小分子（&amp;lt;50 kDa）蛋白质/肽段</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于肽段的功能基序及其结合伴侣的鉴定

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

源自全长蛋白质中特定基序的短肽（在本例中为HIV-1 Nef蛋白），不仅能够保留其生物学功能，还可竞争性地抑制全长蛋白的功能。我们使用了一组由20个氨基酸组成、彼此重叠10个氨基酸的20条Nef扫描肽，用于鉴定Nef中负责诱导细胞凋亡的基序。含有这些促凋亡基序的肽段诱导细胞凋亡的水平与全长Nef蛋白相当。另一条肽段源自Nef的分泌修饰区（SMR），仍保留与参与Nef外泌体分泌（exNef）的细胞蛋白相互作用的能力。该SMRwt肽被用作共免疫沉淀实验中的“诱饵”蛋白，以分离特异性结合Nef SMR基序的细胞蛋白。通过蛋白转染和抗体抑制手段，可物理性阻断Nef与其中一种被分离出的SMR结合蛋白——mortalin之间的相互作用，并利用基于荧光的exNef分泌检测方法测定其效应。SMRwt肽能够竞争性地取代全长Nef与结合SMR基序的细胞蛋白的相互作用，使其成为首个exNef分泌抑制剂。因此，通过采用本文所述的技术，利用源自全长蛋白中特定基序的短肽的独特性质，可加速蛋白质中功能基序的鉴定以及基于肽段的致病功能抑制剂的开发。

利用多肽绘制生物学功能基序 在Nef蛋白上鉴定出两个可诱导凋亡的区域。观察到由多肽驱动的细胞凋亡现象。图2) 从肽段 N50（aa30-50）开始出现，至 N60（aa40-60）和 N70（aa50-70）达到峰值，到肽段 N100（aa80-100）时减弱至背景水平。以 aa50-60 为中心的主要基序 1（M1）峰可诱导 &gt;全长Nef蛋白诱导的凋亡水平的80%。第二个较小的凋亡峰出现在N180（aa160-180）和N190（aa170-190）肽段范围内。该以aa170-180为中心的次要基序2（M2）峰可诱导全长Nef蛋白约30%的凋亡水平。16.
使用多肽进行竞争性抑制分析 在 图3含有完整SMR基序的肽段显著抑制了exNef的分泌。无论该基序位于肽段的N端（Wildtype-1）、中部（Wildtype-2），还是在肽段中重复出现（Wildtype-3），均具有抑制作用。相反，对该基序中的任一氨基酸进行丙氨...

本文描述了研究HIV-1 Nef蛋白通过外泌体分泌机制的实验技术。通过利用源自Nef的特异性短肽及蛋白质转染方法，确定了Nef分泌修饰区的结构、功能及其相互作用蛋白。这些实验方法在多种机制性研究中具有普遍应用价值。

源自完整蛋白质基序的特异性短肽，以我们研究的HIV-1 Nef为例，不仅保留其生物学功能，而且可以……

本视频展示了一组包含四个实验的方法，用于鉴定具有功能性的HIV-1 Nef蛋白基序并开发基于肽的抑制剂。从全长蛋白中发现的基序衍生出特定的短肽，这些短肽既能保留其生物学功能，又能竞争性地抑制全长蛋白的功能，从而鉴定出促凋亡基序。在HIV-1 Nef实验中，将Jurkat细胞暴露于Nef扫描肽，随后进行TUNEL凋亡检测，以鉴定能够诱导细胞凋亡的肽段。另一组含有 NEF 分泌基序变异的肽段。将分泌修饰区域（SMR）与 NPH GFP 一起转染细胞，由于竞争性抑制导致 NPH 分泌减少，通过荧光测定法评估 GFP，以鉴定与 NEF 的分泌修饰区域（SMR）相互作用的细胞因子。使用 SMR 野生型 NPH 作为诱饵进行免疫共沉淀实验。最后，为了检测这些相互作用是否影响分泌，将针对已鉴定结合伴侣的抗体转染入细胞。为评估它们是否拮抗 NF 基序的分泌，实验结果鉴定出 NEF 中两个功能性凋亡基序，以及一种拮抗功能性 NEF 分泌基序及其分泌所必需的细胞结合伴侣的抑制肽。本系列四个实验的总体目标是加速鉴定靶蛋白中的功能基序，并利用这些数据开发针对这些功能基序的多肽类抑制剂。该组实验方案已帮助我们课题组回答了与HIV致病机制相关的一些关键问题，例如阐明肾脏驱动的分泌在致病过程中的作用，以及解析Nef蛋白调控外泌体运输通路的机制。今天演示实验操作的是黄明波博士，他是我实验室的研究指导教师。开始本实验前，需准备一组覆盖目标区域的多肽。本实验所用的多肽为20个氨基酸长度、彼此间有10个氨基酸重叠的肽段，覆盖整个HIV-1 Nef蛋白序列，由AIDS试剂项目提供。为鉴定Nef蛋白中的促凋亡基序，可分别使用这些扫描多肽进行细胞凋亡检测：向每个直径35毫米的jerk hat细胞培养皿中加入含有10纳克/毫升多肽的1毫升培养基，将细胞在37摄氏度条件下培养24小时。孵育结束后，进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP、生物素缺口标记或TUNEL检测，以评估细胞凋亡。操作时，首先用PBS洗涤细胞，吸除PBS后，加入含4%多聚甲醛的PBS，室温孵育30分钟以固定细胞。固定后，再次用PBS洗涤细胞，加入Triton X-100，室温孵育10分钟以增加细胞通透性。细胞固定并通透处理后，加入TUNEL试剂，37°C孵育1小时。用 PBS 清洗细胞两次。然后在计算机控制的显微系统上通过落射荧光法测定染色细胞的百分比。按照随附文件所述，使用 Chariot 蛋白递送试剂盒将 NPH、GFP 质粒及 SMR 肽的不同变体转染入 jca 细胞后，收集培养基，通过荧光显微镜观察以测定转染效率。采集荧光和明场图像，并确定细胞百分比。为评估NPH GFP分泌的抑制情况，将100微升无细胞培养上清转移至96孔黑色微孔板的各个孔中。使用激发波长为485纳米、发射波长为515纳米的荧光计，以相对荧光单位测量培养基中的GFP荧光强度。读数完成后，将数据转移至计算机。将对照培养基中的GFP荧光水平设定为100%，然后与共转染了各种SMR肽的细胞培养基中的GFP荧光水平进行比较，以确定NPH GFP分泌的变化。用于分离基序结合伴侣的共免疫沉淀（co-IP）步骤较为困难。确保在孵育过程中充分振荡磁珠，并在每次洗涤步骤中尽可能去除磁珠中的液体。在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，于37°C条件下，在T75组织培养瓶中培养jerk hat细胞，通过在4°C下以1000 × g离心20分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于1毫升PBS中，并转移至1.5毫升微量离心管中。在1000 ×g条件下离心1分钟。然后用1 mL Flag抗体裂解缓冲液重悬沉淀，通过轻柔吹打进行差速微量离心。在2000 × g 条件下离心5分钟，在13,000 × g 条件下离心10分钟。分别收集上清液以沉淀细胞碎片和DNA，此处收集的上清液称为裂解液。测定蛋白浓度后，向20 µL Anti-Flag M2亲和凝胶中加入1 mg裂解液蛋白以及1 µg的SMR野生型或多肽或SMR突变型多肽。该亲和凝胶此后称为树脂，用co IP缓冲液将混合物调至最终体积为一毫升。同时准备一个阴性对照，其中裂解液与树脂混合，但不加入任一肽段。将混合物在四摄氏度下孵育过夜，同时进行颠倒旋转。第二天，使用微型离心机在5,000至8,000 ×g条件下离心30秒，使树脂沉淀。离心结束后，静置1至2分钟再处理样品，以使树脂充分沉降至管底。使用细尖吸头或Hamilton注射器小心移除上清液，注意避免转移任何树脂。用500微升洗涤缓冲液重悬树脂，通过微量离心机离心，重复洗涤四次。为洗脱结合的细胞蛋白，在50微升洗涤缓冲液中加入15微克过量的3×Flag肽至离心管中，在室温下于摇床上孵育30分钟，孵育结束后以5,000至8,000 ×g离心30秒。静置试管两分钟后，收集并保存含有洗脱蛋白的上清液。通过丙酮沉淀浓缩EITs后，将样品在裂解液缓冲液中煮沸。然后在40%至20%的Tris-HCl Criterion预制胶上进行SDS-PAGE分离蛋白，再用考马斯亮蓝R-250对凝胶染色。为了评估抗体抑制作用，使用随附文档中所述的Chariot蛋白递送试剂盒，将NGFP与Antifa微管蛋白或抗凋亡抗体共同转染JCA细胞，收集收获细胞的无细胞条件培养基。取100微升转移至96孔黑色微孔板的各个孔中。然后使用荧光计在激发波长485纳米、发射波长515纳米的条件下，以相对荧光单位测定培养基中的GFP荧光强度。读取酶标板后，将数据转移至计算机，并将抗脂肪微管蛋白对照组的GFP荧光水平设定为100%。将其与共转染抗凋亡抗体的细胞培养基中GFP荧光水平进行比较，以确定HIV-1 Nef蛋白中调控NEF-GFP分泌的凋亡基序。肽扫描分析按本视频所述方法进行。Y轴显示TUNEL标记的细胞百分比，X轴表示处理条件。如图所示，鉴定出HIV-1 Nef蛋白中两个独立的可诱导细胞凋亡的区域，这些区域通过暴露于Nef肽段后细胞TUNEL标记增加而得以识别。凋亡峰由基序一和基序二表示，用于评估SMR野生型肽对NPH分泌的竞争性抑制作用。将表达NPH-GFP克隆的JEG-3 CAT T细胞与各种SMR肽共转染后，收集培养基，通过检测培养基中GFP荧光来测定胞外NPH的分泌水平。含有一个或多个野生型NPH-SMR序列基序的肽可抑制胞外NEF的分泌，而该区域内任一氨基酸被丙氨酸取代后，肽的抑制效果显著降低。这表明SMR野生型肽可抑制胞外nph的分泌。其中，Neff凋亡基序的一个11个氨基酸的随机序列肽作为对照。此前已有报道并从Sigma Genesis获得的SM-1肽被用作阴性对照，其对胞外NEP的分泌无任何影响。该图显示了经考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 凝胶，其中 SMR 野生型肽段通过共免疫沉淀富集了四种大小分别为 60、65、75 和 250 千道尔顿的蛋白质。阴性对照 SMR 突变型肽段未捕获这些蛋白，且这些蛋白未与亲和树脂发生非特异性结合。在缺乏 SMR 野生型肽段的情况下，这些结果表明共沉淀的蛋白是特异性地与 SMR 野生型肽段中的 SMR 基序发生相互作用。酶标仪检测结果显示，将抗mortal抗体与neph表达质粒共转染后，完全抑制了胞外NPH的分泌。无关抗体对胞外ne的分泌无影响。这些结果表明，完整的NM功能相互作用是胞外neph分泌所必需的。综上所述，观看本视频后，您应当已充分理解如何运用描述性技术来识别靶蛋白中的功能基序，并利用这些数据开发针对这些功能基序的多肽类抑制剂。在进行共免疫沉淀（co-IP）操作时，关键是要仔细注意孵育和洗涤步骤，确保在孵育过程中充分震荡混合磁珠，并在每次洗涤步骤中尽可能彻底地去除磁珠上的液体。此外，在细胞裂解液与树脂洗涤过程中，每次离心后务必让树脂充分沉降。使用窄头移液器吸头进行四次洗涤，以充分降低背景至可接受水平。

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