Name: 分裂和池合成及肽叔酰胺图书馆表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: 学习分裂和池合成方法制备肽叔酰胺组合库，利用天然氨基酸构建亚单体并固相合成肽连接区。该方法可高通量筛选新型蛋白配体，推动药物发现研究。

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作者谨此感谢 Jumpei Morimoto 博士和 Todd Doran 博士提供的宝贵帮助。本研究工作获得了美国国家心肺血液研究所（NHLBI）合同（NO1-HV-00242）的支持。

1. 分裂-混合合成的基本原理
为了高效地在固相上生成大量化合物，通常采用分割-混合合成法作为通用策略。如图所示 图4， Tentagel 树脂珠首先&#160;分为三份，每份与不同的试剂反应，在树脂珠上生成第一个残基。第一次反应后，将三份混合并重新合并，再分成三份。每份再次与不同的试剂反应，在树脂珠上生成第二个残基。经过两次分池合并操作后，共生成九种化合物。
在亚单体合成中，首先将树脂珠分为若干份，分别在偶联试剂存在下与不同的溴代酸反应。用溶剂洗涤后，将所有树脂珠合并并混匀，再重新分为若干份，分别与不同的伯胺反应。胺化反应完成后，将所有树脂珠重新合并，并充分洗涤，从而在每颗树脂珠上完成一个完整的单体合成。此过程可重复进行，直至达到所需的多样性。
2. 从天然氨基酸制备酰溴
在亚单体合成中，每个单体的合成分为两个独立步骤：1. 酰溴的偶联；2. 与伯胺的胺化反应（图2）。为了合成肽类叔酰胺，将从天然氨基酸出发制备在α碳上带有侧链的手性酰溴。本文描述了将天然氨基酸高立体保真地转化为相应酰溴的方法。我们以丙氨酸为例进行说明；在类似条件下，丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等其他氨基酸也可转化为溴代酸。需要注意的是，含有酚羟基、胍基或氨基等功能基团的某些氨基酸在转化前需要进行保护。反应装置如图3所示。
安全注意事项：由于以下反应涉及 HBr、NaNO2 及其他腐蚀性/有毒化学品，必须使用适当的安全设备，如护目镜、实验服和耐化学手套。所有反应均应在通风橱内由经验丰富的化学研究人员操作。
<ol>
	<li>将370 ml水加入630 ml 48% HBr溶液中，配制1 L的30% HBr溶液。将500 ml乙二醇加入1 L的浴槽容器中，加入干冰以维持温度在-10 °C。注意：48% HBr溶液具有强酸性和腐蚀性，操作时需小心。使用前请阅读材料安全数据表（MSDS）。</li>
	<li>将D-丙氨酸（8.9 g，0.1 mol）和KBr（11.9 g，0.1 mol）加入带有磁力搅拌子的250 ml三颈圆底烧瓶中。加入100 ml上一步制备的30% HBr溶液。将烧瓶置于步骤2.1中准备好的乙二醇浴中，保持温度为-10 °C。通过一根长针从烧瓶底部通入氩气，持续10分钟，如图3所示。用磁力搅拌子以300 rpm的速度搅拌溶液。</li>
	<li>将NaNO2（8.28 g，0.12 mol）溶于100 ml烧杯中的20 ml水中。将该溶液加入恒压滴液漏斗中，并用隔膜密封滴液漏斗。缓慢打开滴液漏斗的阀门，使NaNO2溶液滴入烧瓶中。调节阀门以控制滴加速度约为每秒2滴。保持300 rpm的搅拌速度，并持续从烧瓶底部通入氩气&#160;。在全部NaNO2加入完毕前，烧瓶应始终保持在-10 °C的乙二醇浴中。注意：此步骤在加入NaNO2溶液过程中会产生热量和气体。滴加速度应严格控制，整个系统应通过氩气出口保持开放。</li>
	<li>继续搅拌3小时&#160;，使温度从-10 °C逐渐升至室温。所得溶液应为无色至淡黄色；&#160;若颜色过深，可施加真空以除去反应过程中生成的过量氮氧化物和可能产生的Br2。</li>
	<li>使用分液漏斗，用3 × 35 ml&#160;乙醚&#160;从溶液中萃取产物。合并有机相，并用饱和食盐水洗涤。若有机相颜色较深，可在食盐水洗涤前用少量NaHCO3洗涤以去除颜色。将有机相在Na2SO4上干燥6小时。</li>
	<li>过滤除去Na2SO4，并在减压下蒸发溶剂，得到无色至淡黄色油状粗产物。粗产物可通过在115 °C、3 mm Hg条件下蒸馏，或使用硅胶柱层析（洗脱剂为3:1正己烷:乙酸乙酯）进一步纯化。</li>
	<li>纯品为无色油状物，6.6 g（产率74%），密度 = 1.69 g/ml，[α]D20 = +24°（甲醇），1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.41 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 1.86 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。对于(S)-2-溴丙酸-d4（由d4-L-丙氨酸制备），纯品为无色油状物，产率78%，密度 = 1.72 g/ml，[α]D20&#160; = -19°（甲醇）。1H NMR中未观察到明显的氢信号。ESI-MS- [M-1]-&#160; = 155.1（理论值154.97）。对于(S)-2-溴-4-甲基戊酸（由L-亮氨酸按相同方法制备），纯品为无色油状物，产率89%，[α]D20&#160; = +37°（甲醇），1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.30 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 1.94 (dd, J = 10.8, 3.9 Hz, 2H), 1.81 (tt, J = 13.2, 6.5 Hz, 1H), 0.96 (dd, J = 18.2, 6.6 Hz, 7H)。对于(S)-2-溴-3-苯基丙酸（由L-苯丙氨酸按相同方法制备），纯品为淡黄色油状物，产率72%，[α]D20&#160; = +17°（甲醇），1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 – 7.19 (m, 5H), 4.42 (dd, J = 8.1, 7.3 Hz, 1H), 3.47 (dd, J = 14.2, 8.2 Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 14.2, 7.2 Hz, 1H)。</li>
</ol>
3. 利用转氨酶对丙氨酸进行同位素标记
在组合库合成中，特别是在单珠单化合物（OBOC）库的分割与混合合成中，从每颗微珠获得的化合物量相对较少（通常为1 pmol至10 nmol）。此外，由于质谱具有高灵敏度，常被用于最终化合物的鉴定与表征。为了利用质谱确定最终PTA产物中手性中心的绝对立体构型，应在使用前对溴代酸对映体进行同位素标记。本文描述了使用转氨酶和D2O对L-丙氨酸进行标记的方法。
<ol>
	<li>在50 ml聚乙烯管中，将L-丙氨酸（300 mg，3.36 mmol）溶于10 ml D2O中。加入α-酮戊二酸（10 mg，0.068 mmol）作为共底物。将管子加热至37 °C，并用1 M NaOD溶液调节pD至8.5–8.7。注意：pD通过pH试纸测定。使用配备对H+选择性玻璃电极的传统电化学pH计可能对D+产生错误读数。</li>
	<li>将丙氨酸转氨酶（0.1 mg，EC 2.6.1.2，来源于猪心，Roche Diagnostics，Indianapolis，IN）加入上一步制备的pD 8.5–8.7、37 °C的溶液中。将管子置于37 °C培养箱中，在轻微振荡条件下过夜孵育，推荐转速为10至30 rpm。</li>
	<li>过夜孵育后，取0.5 ml D2O溶液，通过1H-NMR检测反应进程。丙氨酸的所有质子信号，δ 3.76（q，J = 7.2 Hz，1H）、1.46（d，J = 7.3 Hz，3H），1H NMR 400 MHz，应因氘代而显著减弱。如先前所述23，应有超过98%的质子被氘取代。注意：若反应在较大规模（&#62;200 ml D2O）下进行，D2O可通过蒸馏部分回收。通常可从溶液中蒸馏回收60%至80%的D2O。</li>
	<li>用液氮冷冻上述溶液，并使用冷冻干燥机进行冻干，得到白色氘代L-丙氨酸粉末。</li>
</ol>
4. 肽模拟物连接区的合成
连接区对于PTA文库的合成并非必需。然而，为了避免基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱在较低分子量范围（100–600）内出现高背景信号，并提高化合物的离子化效率，通常会使用含有多个极性残基的肽类模拟物（peptoid）连接子。该肽类模拟物连接子可通过标准的peptoid合成方法制备。本文中，我们将合成一个由五个N-甲氧基乙基甘氨酸残基组成的五聚体作为连接子（如图5所示）。
<ol>
	<li>将90 μm Tentagel树脂珠（含RAM接头，1 g，0.27 mmol/g）用10 ml DMF溶胀3小时&#160;在12 ml注射器反应器中轻轻振荡。</li>
	<li>从反应器中排出DMF，加入10 ml 20%哌啶DMF溶液，以脱除Rink酰胺接头上的Fmoc保护基。用20%哌啶溶液震荡树脂珠30分钟，随后用DMF洗涤5次。&#160;以去除所有哌啶。</li>
	<li>从注射器中取出少量珠粒，用氯醌试验进行检测。若Fmoc成功脱保护，珠粒应变为深棕色（氯醌试验显示伯胺阳性）。</li>
	<li>配制以下溶液：1. 20 ml 的 2 M 溴乙酸/DMF 溶液；2. 20 ml 的 2 M DIC/DMF 溶液；3. 10 ml 的 1 M 甲氧基乙胺/DMF 溶液。</li>
	<li>向珠中加入5 ml 2 M 溴乙酸/DMF溶液，轻轻振荡。然后向珠中加入5 ml 2 M DIC/DMF溶液；用活塞密封注射器并置于摇床中，振荡10分钟。</li>
	<li>用DMF充分洗涤树脂珠。向树脂珠中加入2 ml由步骤4.4制备的1 M甲氧基乙胺/DMF溶液。用推杆密封注射器，并在摇床中振荡反应30分钟。</li>
	<li>用DMF洗涤珠子5次。取少量珠子进行氯醌测试，若结果为阳性（珠子变蓝），则继续下一步操作；若为阴性，则重复步骤4.6。</li>
	<li>重复步骤 4.5 至 4.7，共 4 次&#160;以完成五聚体的组装。</li>
</ol>
5. 使用 (R)- 和 (S)-2-溴丙酸进行PTA库的分池-合并合成
本文描述了使用步骤4.8中获得的1 g&#160;树脂珠合成一个理论多样性为9,261种化合物的小型PTA化合物库。需要注意的是，每克90 µm的Tentagel树脂珠约含有290万个树脂珠；因此，该化合物库的冗余度为2.9 × 106 / 9,261 = 312个拷贝。我们将使用溴乙酸、(R)-2-溴丙酸以及同位素标记的(S)-2-溴丙酸-d4作为酰化试剂，并选用7种不同的胺（A1 ~ A7，详见图5）进行胺化反应。合成过程将采用注射器反应器和真空多通道装置进行。
<ol>
	<li>从步骤4.8中向注射器加入10 ml 1:1二氯甲烷:二甲基甲酰胺（DCM:DMF）；使用带有截短吸头的1,000 μl移液器将全部1 g样品分装&#160;将珠子均匀分配至三个5 ml注射器反应器中，标记为 B （溴乙酸）， R ((R)-2-溴丙酸) 和 S (S)-2-溴丙酸-d4用二氯甲烷（DCM）清洗所有3支注射器各3次；用无水四氢呋喃（THF）清洗标记为R和S的注射器各3次，用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）清洗标记为B的注射器3次。</li>
	<li>注射器 R 和 S溴代丙酸的BTC偶联反应。
	<ol>
		<li>在通风橱中，向小瓶内加入约 200 mg BTC，盖上瓶盖密封。称量小瓶中 BTC 的实际质量。根据称量结果计算所需溶剂体积，并加入无水 THF，配制成 20 mg/ml 的 BTC/THF 溶液。</li>
		<li>制备溴代酸/BTC 混合物。加入 (R)-2-溴丙酸（89 μl，0.95 mmol）和 (S)-2-溴丙酸-d4 （89 μl，0.95 mmol）分别加入两个小瓶中。向每个小瓶中加入5 ml上述20 mg/ml BTC/THF溶液。密封两个小瓶，置于-20 °C冰箱中反应20分钟。</li>
		<li>向注射器中加入 1,125 μl 2:1 THF/DIPEA（750 μl THF，375 μl DIPEA，2.2 mmol） R 和 S 分别进行。用移液枪头将磁珠混匀，静置5分钟。</li>
		<li>从步骤5.2.2中取出两个已冷却的溴代酸/BTC混合物，向每个小瓶中加入2,4,6-三甲基吡啶（356 μl，2.7 mmol）。立即有白色沉淀生成。将相应的悬浮液直接加入至碱化的珠子中（注射器 R 和 S 在步骤5.2.3中尽快操作，随后将样品置于摇床中，以120 rpm振荡2小时。 
		注意：反应全程中，注射器反应器内的溶液应呈淡黄色悬浮液。若颜色变深，表明在初始加入酰氯溶液时释放了过多热量。可通过进一步冷却或稀释溴代酸/BTC混合物来解决此问题。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射器 B溴乙酸与DIC的偶联
	<ol>
		<li>配制20 ml新鲜的2 M溴乙酸/DMF溶液。配制20 ml的2 M DIC/DMF溶液。</li>
		<li>加入2&#160;向注射器中加入2 M溴乙酸/DMF溶液1 ml B，轻轻振荡。加入2&#160;向注射器中加入2 M DIC/DMF溶液1毫升 B，轻轻振荡。</li>
		<li>将注射器放入 B 与注射器置于同一摇床中 R 和 S，振荡反应2小时。注意，溴乙酸/DIC的偶联反应在30分钟内即可完成；延长反应时间是为了方便进行裂分-混合合成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2小时后，取注射器 R，S 和 B 从摇床中取出。用二氯甲烷彻底清洗所有三个注射器&#160;5次。然后用DMF洗涤5次。注意注射器 R 和 S 在使用DMF清洗之前，必须先用DCM或THF清洗。</li>
	<li>合并所有注射器中的珠子 R, S 和 B 将所有珠子转入一个12 ml注射器反应器中，用DMF洗涤5次。</li>
	<li>向注射器中加入10 ml 1:1 DCM:DMF；使用带截短吸头的1,000 μl移液器将所有微珠均匀分配至7个独立的2 ml注射器中，标记为A1-A7。</li>
	<li>胺化反应。为所列的7种伯胺中的每一种分别配制10 ml、2 M的伯胺/DMF溶液。 图5向相应的注射器 A1-A7 中各加入 5 ml 胺溶液。将全部 7 个注射器置于 60 °C 摇床培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>孵育后，用DMF彻底洗涤所有珠子。&#160; 从每个注射器中取出少量珠粒，用氯醌试验检测。若珠粒在3分钟内变为绿色（结果为阳性），则进行下一步。若结果为阴性，则对结果为阴性的注射器重复步骤5.7。</li>
	<li>重复步骤 5.1 至 5.8 两次，以完成三聚体的合成。可选步骤：每个循环结束后，建议按如下所述通过质谱检测合成质量。目前所有 9,261 种化合物均已合成在 Tentagel 树脂上，构成 OBOC 组合库。</li>
	<li>PTA 的质谱确认 
	PTA 是具有高度结构化的寡聚物，具备许多 N-甲基化肽的共同特征。N-甲基化肽的固相合成中一个常见问题是三氟乙酸（TFA）裂解过程中发生的酸降解。为抑制酸降解，类似环孢素等分子从固相载体上的裂解通常在低温条件下进行。我们比较了多种裂解条件对不同 PTA 分子从固相载体上裂解的效果。结果表明，通常情况下，低温和降低 TFA 浓度可有效抑制酸降解，获得纯度更高的化合物。
	<ol>
		<li>在15 ml离心管中配制10 ml 1:1 TFA/DCM溶液。密封管子并置于-20 °C冰箱中冷冻20分钟。</li>
		<li>用二氯甲烷洗涤需裂解的珠子5次。将珠子在二氯甲烷中振荡15分钟，再用二氯甲烷洗涤5次。</li>
		<li>将二氯甲烷从注射器中排出。使用光学显微镜和带有截短尖端的移液器，将每个微珠单独转移至96孔板中，每孔一个微珠。</li>
		<li>用盖玻片覆盖96孔板，将板置于-20 °C冰箱中冷冻15分钟。</li>
		<li>从步骤5.10.1中取出已冷却的1:1 TFA/DCM溶液，向每个含有微珠的孔中加入20 μl。重新盖上盖玻片，将96孔板置于-20 °C冰箱中的摇床上。</li>
		<li>振荡20分钟。取出96孔板，揭去盖玻片。通过吹入空气或氩气将每个孔中的TFA/DCM吹干。若裂解的微珠超过10个，可使用真空离心浓缩仪（speedvac）对整块板进行干燥以去除TFA/DCM。需注意，此时并非所有化合物均已从微珠上完全裂解，但已裂解的化合物量应足以进行质谱分析。</li>
		<li>加入 20 μl 6:4 乙腈:水2O溶液以溶解各孔中的裂解产物。取每种化合物溶液0.6 μl，与0.6 μl CHCA MALDI基质混合后点样于MALDI靶板上。</li>
		<li>使用基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI质谱）测定各化合物的分子量及其序列（MS/MS）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 氯醌试验
<ol>
	<li>每次测试前需新鲜配制以下试剂。溶液A：2% 氯醌（CAS: 118-75-2）的DMF溶液。溶液B：2% 乙醛（CAS: 75-07-0）的DMF溶液。</li>
	<li>在1.5 ml离心管中，将100 μl溶液A与100 μl溶液B混合；加入微珠后轻轻振荡。若微珠在5分钟内变为蓝色，表明微珠表面含有仲胺。伯胺则呈现深棕色，不会变蓝。</li>
</ol>

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<li>Sleebs, M. M., Scanlon, D., Karas, J., Maharani, R., Hughes, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+Synthesis+of+the+Antifungal+Depsipeptide+Petriellin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Total Synthesis of the Antifungal Depsipeptide Petriellin A.</a> J Org Chem. 76, 6686-6693 (2011).</li>
<li>Vaisar, T., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+fragmentation+of+protonated+mono-N-methylated+peptides.+Analogy+with+solution-phase+acid-catalyzed+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Gas-phase fragmentation of protonated mono-N-methylated peptides. Analogy with solution-phase acid-catalyzed hydrolysis.</a> Journal of Mass Spectrometry. 33, 505-524 (1998).</li>
<li>Creighton, C. J., Romoff, T. T., Bu, J. H., Goodman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+of+an+unusual+amide+bond+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies of an unusual amide bond scission.</a> Journal of the American Chemical Society. 121, 6786-6791 (1999).</li>
<li>Sewald, N., Sewald, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+racemization-free+peptide+coupling+of+N-alkyl+amino+acids+by+using+amino+acid+chlorides+generated+in+situ--total+syntheses+of+the+cyclopeptides+cyclosporin+O+and+omphalotin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Efficient, racemization-free peptide coupling of N-alkyl amino acids by using amino acid chlorides generated in situ--total syntheses of the cyclopeptides cyclosporin O and omphalotin A.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 41, 4661-4663 (2002).</li>
<li>Astle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seamless+Bead+to+Microarray+Screening%3A+Rapid+Identification+of+the+Highest+Affinity+Protein+Ligands+from+Large+Combinatorial+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Seamless Bead to Microarray Screening: Rapid Identification of the Highest Affinity Protein Ligands from Large Combinatorial Libraries.</a> Chem Biol. 17, 38-45 (2010).</li>
<li>Strohalm, M., Kavan, D., Novak, P., Volny, M., Havlicek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mMass+3%3A+a+cross-platform+software+environment+for+precise+analysis+of+mass+spectrometric+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data.</a> Anal Chem. 82, 4648-4651 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

肽类叔酰胺（PTA）是一类肽模拟寡聚物的超家族。除了已被广泛研究的肽、肽拟物（peptoids）和N-甲基化肽之外，该家族中大量化合物仍缺乏深入研究，主要原因是缺乏适用于通用N-烷基化肽的合成方法。本文中，我们描述了一种利用源自氨基酸的手性构筑单元高效合成PTA的方法。此前，我们已报道过采用一种新的亚单体路线合成PTA分子库。23我们已证明，PTA 是具有高度结构的寡聚物，其骨架具有构象限制。在测试时 体内PTA分子表现出增强的细胞通透性，因而活性提高25然而，尽管PTA具有诸多优势，其合成过程也面临一些挑战，主要源于位阻位置上仲胺的酰化反应。提供构象限制的α-侧链也会对后续的偶联步骤产生空间位阻。为了克服这些合成难题，我们开展了系统的优化研究，确定BTC为该反应的最佳偶联试剂。23.
合成路线的关键步骤是由BTC促进的仲胺酰化反应。在此过程中，BTC能够促进酰氯的生成。 原位26,27大多数其他偶联试剂在连续合成PTA时，因形成活性酯或酸酐等中间体，无法实现...

拟肽类化合物是一类模拟天然肽结构的化合物。其设计旨在保留生物活性的同时，克服天然肽存在的一些问题，如细胞通透性差以及易被蛋白酶降解等1-3。由于这类化合物具有寡聚特性，可通过单体或亚单体合成路线方便地构建大规模合成文库4-7。其中研究最为广泛的一类拟肽化合物是&#160;肽素（peptoids）。肽素是由N-烷基化甘氨酸组成的寡聚物，可通过亚单体策略简便地合成8,9。通过针对蛋白质靶标筛选大规模合成的肽素文库，已成功鉴定出多种有用的蛋白质配体1,10-14。然而，从肽素文库中鉴定出的“命中”化合物通常难以达到对蛋白质靶标的极高亲和力1,10-14,22。肽素与天然肽之间的一个主要差异在于，大多数肽素由于缺乏手性中心和构象限制，通常无法形成二级结构。为解决这一问题，过去十年中已发展出多种策略，主要集中于修饰主链氮原子上的侧链15-22。最近，我们开发了一种新的合成路线，可将天然氨基酸侧链引入肽素骨架，从而构建肽类叔酰胺结构23。
肽类叔酰胺（PTA）是一类包含但不限于肽（R2&#160;= H）、肽拟物（peptoids，R1&#160;= H）和N-甲基化肽（R1&#160;≠ H，R2&#160;= Me）的拟肽类化合物超家族。（见图1）我们的合成路线采用天然氨基酸作为α-碳上手性中心和侧链的来源，并使用市售的伯胺来引入N-取代基团。因此，可探索比简单肽、肽拟物或N-甲基化肽更广阔的化学空间。圆二色光谱表明，PTA分子在溶液中具有高度有序的结构。对其中一个PTA-蛋白质复合物的表征明确显示，PTA的构象限制对其与靶标结合至关重要。最近，我们还发现某些PTA分子相较于其对应的肽拟物和肽类化合物具有更优的细胞通透性。我们认为，这些PTA化合物库可作为针对蛋白质靶标的高亲和力配体的良好来源。本文将详细讨论一个单珠单化合物（OBOC）PTA库的合成方法，并介绍一些改进的偶联与裂解反应条件。

<table><tbody><tr><td>2,4,6-三甲基吡啶</td><td>ACROS</td><td>161950010</td><td>CAS:108-75-8</td></tr><tr><td>2-吗啉乙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06680</td><td>CAS:2038-03-1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>48% HBr 水溶液</td><td>ALFA AESAR</td><td>AA14036AT</td><td>CAS:10035-10-6</td></tr><tr><td>乙醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402788</td><td>CAS:75-07-0&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher</td><td>SR015AA-19PS</td><td>CAS:75-05-8</td></tr><tr><td>无水四氢呋喃（THF）</td><td>EMD</td><td>EM-TX0277-6</td><td>CAS:109-99-9</td></tr><tr><td>苄胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>185701</td><td>CAS:100-46-9</td></tr><tr><td>双(三氯甲基)碳酸酯（BTC）</td><td>ACROS</td><td>258950050</td><td>CAS:32315-10-9</td></tr><tr><td>溴乙酸</td><td>ACROS</td><td>106570010</td><td>CAS:79-08-3</td></tr><tr><td>四氯苯醌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23290</td><td>CAS:118-75-2</td></tr><tr><td>环己基甲胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101842</td><td>CAS:3218-02-8</td></tr><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>剑桥同位素</td><td>DLM-4-99.8-1000</td><td>CAS:7789-20-0</td></tr><tr><td>D-丙氨酸</td><td>Anaspec</td><td>61387-100</td><td>CAS:338-69-2</td></tr><tr><td>二氯甲烷（DCM）</td><td>Fisher</td><td>BJ-NS300-20</td><td>CAS:75-09-2</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Fisher</td><td>BJ-076-4</td><td>CAS:68-12-2</td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>奥克伍德</td><td>44710</td><td>CAS:107-21-1</td></tr><tr><td>异戊胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W321907</td><td>CAS:107-85-7</td></tr><tr><td>KBr</td><td>ACROS</td><td>424070025</td><td>CAS:7758-02-3</td></tr><tr><td>L-丙氨酸</td><td>Anaspec</td><td>61385-100</td><td>CAS:56-41-7</td></tr><tr><td>3-甲氧基丙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M25007</td><td>CAS:5332-73-0</td></tr><tr><td>2-甲氧基乙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>143693</td><td>CAS:109-85-3</td></tr><tr><td>N-(3-氨基丙基)-2-吡咯烷酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>136565</td><td>CAS:7663-77-6&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）</td><td>ACROS</td><td>115211000</td><td>CAS:693-13-0</td></tr><tr><td>N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125806</td><td>CAS:7087-68-5</td></tr><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ACROS</td><td>424340010</td><td>CAS:7631-99-4</td></tr><tr><td>NAOD 水溶液（40%）</td><td>ACROS</td><td>200058-506</td><td>CAS:7732-18-5</td></tr><tr><td>哌啶</td><td>ALFA AESAR</td><td>A12442-AE</td><td>CAS:110-89-4</td></tr><tr><td>胡椒基胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P49503</td><td>CAS:2620-50-0</td></tr><tr><td>丙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240958</td><td>CAS:107-10-8</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>CAS:76-05-1</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td>CAS:28166-41-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;alpha;α-酮戊二酸</td><td>ALFA AESAR</td><td>AAA10256-22</td><td>CAS:328-50-7</td></tr><tr><td>RINK连接臂的Tentagel树脂</td><td>Rapp-聚合物</td><td>S30023</td><td></td></tr><tr><td>丙氨酸转氨酶</td><td>罗氏</td><td>10105589001</td><td>又称：谷氨酸-丙酮酸转氨酶（GPT）</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>Innova44</td><td></td></tr><tr><td>核磁共振（NMR）</td><td>Bruker</td><td>400 MHz</td><td></td></tr><tr><td>MALDI 质谱仪</td><td>应用生物系统公司</td><td>4800 MALDI-TOF/TOF</td><td></td></tr><tr><td>冻干机</td><td>SP Scientific</td><td>VirTis 台式 K</td><td></td></tr><tr><td>注射器反应器</td><td>INTAVIS</td><td>反应柱</td><td>3 ml、5 ml、10 ml、20 ml</td></tr><tr><td>真空 manifold</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td>Vac-Man</td></tr></tbody></table>

裂分与混合合成及肽类叔酰胺库的表征

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

拟肽类化合物是蛋白质配体的重要来源。由于这类化合物具有寡聚特性，我们可以通过组合化学方法在固相上构建大规模的合成文库。其中研究最为广泛的一类拟肽化合物是肽类似物（peptoids）。肽类似物易于合成，且已被证明具有抗蛋白酶降解和细胞通透性等优点。在过去十年中，通过筛选肽类似物文库已鉴定出许多有用的蛋白质配体。然而，从肽类似物文库中鉴定出的大多数配体亲和力较低，仅有极少数例外。这可能部分归因于肽类似物分子中缺乏手性中心和构象限制。最近，我们报道了一种新的合成途径，可用于获得肽类叔酰胺（PTAs）。PTA是一类包含但不限于肽、肽类似物和N-甲基化肽的拟肽超家族。由于其侧链同时存在于α-碳原子和主链氮原子上，这些分子的构象受到空间位阻和烯丙基1,3-张力的显著限制。（图1）我们的研究表明，这些PTA分子在溶液中具有高度有序的结构，可用于识别蛋白质配体。我们认为，这类分子有望成为未来高亲和力蛋白质配体的来源。本文中，我们描述了一种结合了“分割-混合”（split-and-pool）与“亚单体”（sub-monomer）策略的合成方法，用于构建一个单珠单化合物（OBOC）PTA文库的示例。

此处展示了带有连接臂的PTA三聚体的三个代表性MALDI质谱图。如图6A所示，当使用50% TFA/DCM溶液在室温下进行裂解时，观察到明显的降解现象。图6A中，质荷比为593和484的峰分别对应于连接臂和PTA三聚体，表明整个分子已在树脂上成功合成，但在裂解过程中发生了降解。如上所述，在低温条件下进行裂解时，TFA引起的降解显著减少，如图6B所示。此类裂解的机理已在先前的文献中有所描述24，被认为经过一个噁唑烷中间体。PTA分子可通过MS/MS进行测序，其裂解模式与肽和拟肽相似，如图6C所示。使用(S)-2-溴丙酸-d4合成的PTA分子在MS和MS/MS谱图中通常产生更宽的峰，这是由于存在氘代不完全的副产物，例如(S)-2-溴丙酸-d3（图7A和图7B）。这一现象可在测序过程中作为R手性中心存在（由S构型在胺化过程中发生构型翻转所致）的指示。我们还发现，PTA分子比拟肽...

肽类叔酰胺（PTAs）是一类包含但不限于肽、肽拟物和N-甲基化肽的肽模拟物超家族。本文描述了一种结合了&#160;结合裂分-混合与单体前体策略，合成单珠单化合物的PTA库。

拟肽类化合物是蛋白质配体的重要来源。这类化合物的寡聚特性使我们能够在固相上构建大规模的合成文库……

本实验的总体目标是演示如何合成包含肽类三级酰胺（PTA）单元的组合库。首先，利用天然氨基酸制备PTA次级单体；第二步，在固相载体上合成肽连接区域。接下来，合成包含PTA和肽亚基的组合库。最后一步是对合成的组合库进行表征，以确保合成质量。最终，合成出含有构象受限PTA亚基的组合库，该库可用于高通量筛选，以获得蛋白质配体，并推动新药发现。因此，本文所涉及的化学方法是在尝试寻找比我们先前研究过的多肽及其他分子更刚性的分子过程中发展起来的。其核心思想是，如果能够鉴定出一系列刚性更强的分子，它们将能够以更高的亲和力与蛋白质靶标结合。我们认为，这对于未来药物的开发，甚至对于发现有趣的探针分子，都具有非常重要的意义。该PTA亚类合成方法的可视化演示至关重要，因为该合成过程难以掌握，其成功与否高度依赖于对温度和反应时间的精确控制。首先，将8.9克二烯和11.9克溴化钾加入装有磁力搅拌子的500毫升三颈圆底烧瓶中。然后向烧瓶中加入100毫升预先配制的30%溴化氢溶液。将烧瓶置于-10 °C的乙二醇-干冰浴中，从烧瓶底部通过长针通入氩气鼓泡10分钟。使用磁力搅拌子以300 RPM的速度搅拌溶液。随后，将预先配制的亚硝酸钠溶液加入与三口圆底烧瓶相连的恒压滴液漏斗中，并用隔膜密封。缓慢打开滴液漏斗的阀门，使亚硝酸钠溶液缓慢滴入烧瓶中。调节阀门，将滴加速度控制在每秒约两滴。亚硝酸钠加毕后，继续搅拌反应液三小时，使温度从零下10摄氏度升至室温。如果溶液颜色过深，可施加真空以除去反应过程中产生的过量氮氧化物及可能生成的溴。将溶液转移至分液漏斗后，用35毫升二乙醚萃取产物三次。合并有机相，用饱和食盐水洗涤后，收集入烧瓶中，并在硫酸钠上干燥六小时。过滤除去硫酸钠后，在减压条件下蒸发溶剂，得到无色至淡黄色油状物。使用三比一的正己烷-乙酸乙酯体系通过硅胶柱层析纯化粗产物。进行同位素标记时，将300毫克L-丙氨酸溶解于10毫升重水（D₂O）中，置于50毫升聚乙烯管内。加入10毫克α-酮戊二酸作为共底物后，将反应管加热至37摄氏度。反应完成后，使用1摩尔的氘氧化钠溶液和pH试纸将pH值调节至8.5至8.7。接下来，向溶液中加入 0.1 毫克丙氨酸转氨酶。将试管置于 37 °C 培养箱中，在 10 至 30 RPM 轻微振荡条件下孵育过夜。此时，在 12 毫升注射器反应器中，将 1 克 90 微米、10 至凝胶珠与 Ram 连接剂在 10 毫升二甲基甲酰胺中溶胀 3 小时，并持续轻微振荡，随后从反应器中排出二甲基甲酰胺，并加入 10 毫升 20% 哌啶二甲基甲酰胺溶液，以脱除 Rink 酰胺连接剂上的 Fmoc 保护基团。将珠子与20% Pepperdine溶液振荡30分钟后，用二甲基甲酰胺洗涤五次，以去除全部Pepperdine。接着，从注射器中取出少量珠子，用氯化铁试验检测。向珠子中加入2毫升2摩尔的溴乙酸二甲基甲酰胺溶液，轻轻振荡。然后向珠子中加入2毫升2摩尔的二异丙基碳二亚胺二甲基甲酰胺溶液。用活塞密封注射器后，在摇床中振荡珠子10分钟。珠子用二甲基甲酰胺充分洗涤后，向其中加入2毫升预先配制的1摩尔甲氧基乙基二甲基甲酰胺溶液。将珠子振荡并用二甲基甲酰胺洗涤五次后，用氯醛试验检测少量珠子。随后，向先前使用的注射器中加入10毫升体积比为1:1的二氯甲烷-二甲基甲酰胺溶液。使用截短吸头的1000微升移液器，将全部1克珠子均匀分装至三个5毫升注射器反应器中。用氯甲烷清洗三支注射器三次后，将标有 r 和 s 的注射器用无水四氢呋喃各清洗三次，将标有 B 的注射器用二甲基甲酰胺清洗三次。进行溴代丙酸与三苯甲基的偶联反应时，在通风橱中向小瓶中加入约 200 毫克三苯甲基。盖上瓶盖后，称量小瓶中三苯甲基的实际质量。然后向小瓶中加入适量的无水四氢呋喃，配制成 20 毫克/毫升的三光气四氢呋喃溶液。为制备溴代酸三光气混合物，分别将 89 微升 R-2-溴代丙酸和 S-2-溴代丙酸-d4 加入两个小的样品瓶中，再向每个样品瓶中加入 5 毫升的三光气四氢呋喃溶液。密封样品瓶后，将其置于 -20 摄氏度冰箱中冷冻 20 分钟。同时，向注射器 r 和 s 中各加入 1,125 微升体积比为 2:1 的四氢呋喃与二异丙基胺混合溶液。另取 356 微升 2,4,6-三甲基嘌呤，分别加入含有冷却的溴代酸光气混合物的各小瓶中，产生白色沉淀。立即将相应的悬浮液直接施加至活化的微珠上，随后将微珠置于摇床中，在 120 转/分钟条件下振荡反应 2 小时。将5毫升2摩尔的溴乙酸二甲基甲酰胺溶液加入注射器B中，用于溴乙酸与二异丙基碳二亚胺的偶联反应。振荡后，向同一注射器中加入5毫升2摩尔的二丙基碳二亚胺二甲基甲酰胺溶液，并轻轻振荡。随后将注射器B置于与注射器R和S相同的摇床上，继续振荡2小时。之后用二氯甲烷和二甲基甲酰胺彻底清洗注射器。将注射器R、S和B中的所有树脂珠合并至一个12毫升的注射器反应器中。将珠子用二甲基甲酰胺洗涤五次后，向注射器中加入10毫升体积比为1:1的二氯甲烷-二甲基甲酰胺溶液。使用截去尖端的1000微升移液枪将所有珠子均匀分装至七个独立的2毫升注射器中，随后向对应的每个注射器中加入5毫升预先配制好的2摩尔胺溶液。将七个注射器置于60摄氏度摇床中孵育过夜。孵育结束后进行后续操作。用二氯甲烷洗涤需要裂解的珠子五次。振荡珠子15分钟，再用二氯甲烷洗涤一次，然后从注射器中排出二氯甲烷。随后将每个珠子分别转移至96孔板中。使用光学显微镜和带有截短尖端的移液枪，用盖玻片覆盖96孔板，并将其置于-20摄氏度冰箱中冷冻15分钟。待板从冰箱中取出后，向每个含有微珠的孔中加入20 µL预先配制并冷却的1:1三氟乙酸（TFA）-二氯甲烷溶液。重新盖上盖玻片，将96孔板放回-20摄氏度冰箱中的摇床内。振荡20分钟后，从冷冻机中取出96孔板并揭去盖玻片。通过向各孔吹入空气，将二氯甲烷吹干。当使用50%三氟乙酸二氯甲烷溶液在室温下进行裂解时，可观察到明显的降解现象。峰593和484分别对应于连接臂和PTA三聚体，表明整个分子已在树脂上成功合成，但在裂解过程中发生了降解。如上所述，在低温条件下进行裂解时，三氟乙酸（TFA）诱导的降解程度显著降低。该裂解机制已在先前文献中有所描述，据信其通过烯胺中间体进行。PTA分子可通过串联质谱（Ms.MS）进行测序，其裂解模式与肽类相似。使用S-2-溴丙酸和D-4合成的PTA分子在质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）中通常产生更宽的峰，这是由于存在不完全反应产物，例如S-2-溴丙酸和D-3-诺伊酸。这一现象可在测序过程中作为R手性中心存在的指示。此外，PTA分子比肽类更容易形成加合物，因此建议使用低钠水和塑料器皿。另一个可能的副产物是在胺化过程中因溴消除而生成的丙烯酰胺。一旦形成丙烯酰胺，反应序列即被终止。该问题可通过将伯胺浓度降低至1摩尔以减少溶液中的副反应来解决。一旦掌握了该方法并建立了适当规模的文库，若操作得当，可在两天内完成制备。如今这一化学方法已得到充分发展，且合成效率较高，我希望其他研究人员能够采用这一强大的技术，用于药物开发和探针开发中的构象受限肽模拟物的制备。

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