分裂和池合成及肽叔酰胺图书馆表征
June 20th, 2014
肽叔酰胺（贸易协定）的肽模拟物，包括但不限于肽，拟肽和N-甲基化的肽的一个家族。在这里，我们描述它结合了两个分裂和池和子策略单体合成家教会的一珠一化合物库的合成方法。
该程序的总体目标是演示如何合成包含肽三级 amid 或 PTA 单元的组合文库。这是通过首先从天然氨基酸制备 PTA 亚单体来实现的。第二步是在固体载体上合成肽接头区域。
接下来，合成包含 PTA 和肽亚基的组合文库。最后一步是表征 synthesized library 以确保 synthesis 的质量。最终，合成了一个包含确认限制性 PTA 亚基的组合文库，这样的文库可用于高通量筛选，以提供蛋白质配体并导致新药发现。
因此，本文主题的化学研究旨在尝试找到比我们之前研究过的一些肽和其他物质更硬的分子。我们的想法是，如果鉴定出更硬的分子文库，它们将与亲和力高得多的蛋白质靶标结合，我们认为这对于尝试开发未来的药物甚至有趣的探针分子非常非常重要。这个 PTA suborder synthesis 的视觉演示非常关键，因为 synthesis 很难学习，因为温度和 timing control 对于成功的 synthesis 非常关键。
首先，将 8.9 克 dine 和 11.9 克溴化钾加入到 500 毫升带磁力搅拌棒的三颈圆底烧瓶中。然后将 100 毫升预先制备的 30% 溴化氢溶液加入烧瓶中。将培养瓶置于负 10 摄氏度的乙二醇中后，干冰浴从培养瓶底部用长针使氩气冒出 10 分钟。
用磁力搅拌棒以 300 RPM 的速度搅拌溶液。然后，将先前制备的亚硝酸钠溶液添加到连接到三个颈部圆底烧瓶的压力平衡滴液漏斗中，并用隔垫密封。缓慢打开滴液漏斗的阀门，让亚硝酸钠溶液滴入培养瓶中。
控制阀门，将滴落速度调整为大约每秒两滴。亚硝酸钠添加完成后，继续搅拌溶液三个小时，让温度从零下 10 摄氏度升至室温。如果溶液的颜色太深，请施加真空以去除反应过程中产生的过量氮氧化物和可能的溴。
将溶液转移至提取漏斗后，用 35 毫升达乙醚萃取产品 3 次。混合有机相并用饱和盐水洗涤后，将其收集到烧瓶中，并在硫酸钠上干燥 6 小时。过滤硫酸钠后，在真空下蒸发溶剂，得到透明至淡黄色的油。
通过硅胶柱色谱纯化粗品，用 3 比 1 乙酸己烷乙酯进行同位素标记，将 300 毫克 L 丙氨酸与 10 毫升氘代水溶解在 50 毫升聚乙烯管中。加入 10 毫克 α 酮戊二酸作为 cos 底物后，将试管加热至 37 摄氏度。完成后，使用一摩尔的二氧化钠溶液和 pH 试纸将 pH 值调节至 8.5 至 8.7。
接下来，向溶液中加入 0.1 毫克丙氨酸转氨酶。将试管置于 37 摄氏度的培养箱中，以 10 至 30 RPM 的转速轻轻摇动孵育过夜。此时，在 12 毫升注射器反应器中，用 Ram 接头在 12 毫升注射器反应器中用 10 毫升二甲基甲酰胺溶胀 10 至凝胶珠 3 小时，从反应器中排出二甲基甲酰胺，并加入 10 毫升 20%pi Perine 二甲基甲酰胺溶液，以在接头中保护 FOC 基团免受溜冰场的影响。
用 20% 佩珀代因溶液摇动珠子 30 分钟后，用二甲基甲状肉清洗五次，以去除所有佩珀代因。接下来，从注射器中取出一些珠子，并用氯醛测试它们。向珠子中加入 2 毫升 2 毫升溴乙酸二甲基甲酰胺溶液，轻轻摇晃。
然后向珠子中加入 2 毫升 2 摩尔二丙基卡波二胺二甲基甲酰胺溶液。用柱塞密封注射器后，在摇床上摇晃珠子 10 分钟。用二甲基甲酰胺彻底洗涤珠子后，向其中加入两毫升先前制备的 1 摩尔甲氧基乙基二甲基甲酰胺溶液。
摇动珠子并用二甲基甲酰胺洗涤五次后，用三氯醛测试检查一些珠子。然后，将 10 毫升一对一二氯醛甲烷二甲基甲酰胺溶液添加到先前使用的注射器中。使用 1000 微升移液管和截短移液器吸头，将所有 1 克微珠均匀地分成三个 5 毫升注射器反应器中。
用氯甲烷洗涤三个注射器 3 次后，用无水 tet 氢弗林蛋白酶洗涤 r 和 s 标记的注射器 3 次，用二甲基甲酰胺洗涤 B 标记的注射器 3 次。对于溴丙烷 NOIC 酸的 tristine 偶联，将大约 200 mg 的 tristine 添加到通风橱中的小瓶中。瓶盖上瓶盖后，称量样品瓶中 tristine 的量。
然后在小瓶中加入适量的无水四氢铁，制成每毫升 20 毫克的三光气四氢铁溶液。为了制备溴酸三光气混合物，将 89 微升 R 2 溴丙烷 NOIC 酸和 S 2 溴丙烷 NOIC 酸 D 4 分别装在两个小瓶中，加入 5 毫升三苯乙烯四氢呋喃溶液。密封小瓶后，将它们放入零下 20 摄氏度的冰箱中 20 分钟。
同时，将 1， 125 微升二对一四氢呋喃二异丙胺溶液添加到注射器 r 和 s 中。分别向每个小瓶中加入 356 微升 2 4 6 三甲基嘌呤，这些小瓶中含有冷却的溴酸光气混合物，产生白色沉淀物。立即将相应的悬浮液直接涂抹在化好的珠子上，然后将它们放在摇床上，在 120 RPM 下摇动 2 小时。
对于溴乙酸与二异丙基卡波二胺的偶联，向注射器 B 中加入 5 毫升 2 摩尔溴乙酸二甲基甲酰胺溶液，摇动后，将 5 毫升 2 摩尔二丙基卡波二胺二甲基甲酰胺溶液加入同一注射器中，然后按照将注射器 B 置于与注射器 r 和 s 相同的摇床上轻轻摇晃。然后用二氯甲烷和二甲基甲酰胺彻底清洗注射器后，摇动注射器两小时。将注射器 R、s 和 B 中的所有珠子汇集到一个 12 毫升注射器反应器中。
用二甲基甲酰胺洗涤珠子 5 次后，向注射器中加入 10 毫升一对一的二氯甲烷二甲基甲酰胺溶液。使用 1000 微升移液管将所有珠子均匀地分成 7 个单独的 2 毫升注射器中，并使用截断的移液器吸头进行射出，将 5 毫升先前制备的 7 个摩尔胺溶液加入相应的注射器中。将所有 7 个注射器在 60 摄氏度的培养箱中摇动孵育孵育后过夜。
用二氯醛甲烷清洗需要裂解的珠子五次。摇晃珠子 15 分钟并再次用二氯甲烷清洗后，将注射器中的二氯甲烷排出。然后将每个单独的珠子转移到 96 孔板中。
使用光学显微镜和吸头截短的移液器，用盖玻片盖住 96 孔板，然后将其放入负 20 摄氏度的冰箱中 15 分钟。从冰箱中取出板后，向每个含有珠子的孔中加入 20 微升先前制备的冷却一对一 TFA DI 氯甲烷溶液。装回盖玻片，将 96 壁板放在摇床上，放回负 20 摄氏度的冰箱中。
摇晃 20 分钟后，从冰箱中取出 96 壁板并撕下盖玻片。通过向每口井吹气，将每口井中的二氯甲烷吹干。当在室温下使用 50%TFA DI CHLORO 甲烷溶液裂解时，观察到显著降解。
峰 593 和 484 分别对应于接头和 PTA 三聚体，表明整个分子在磁珠上成功合成，但在切割过程中降解。当如上所述在低温条件下裂解时，TFA 诱导的降解量被大大抑制。其切割机制在以前的文献中已经描述过，据信通过一个奥兰碱中间体PTA分子可以通过 Ms.MS 进行测序，其碎裂模式类似于肽和肽。
用 S 2 溴戊酸 D 4 合成的 PTA 分子通常在 MS 和 MSM 中产生更宽的峰。Ms.Spectra 由于存在不完全持续时间的产物，如 S 2 溴丙、NOIC 酸 D 3，这可以用作测序过程中 R 手性中心存在的指示，PTA 分子也倾向于形成比肽肽更多的加合物。因此，低钠水和塑料器具是首选。
另一个潜在的副产品是胺化过程中溴去除形成的丙烯酰胺。一旦形成丙烯酰胺，序列就终止了。这可以通过将伯胺浓度降低到 1 摩尔以减少溶液来解决。
Basicity 一旦掌握了一个大小合适的文库，如果执行得当，可以在两天内准备好。现在这种化学已经完全开发并且合成非常有效，我希望其他研究人员能够采用这种强大的技术来制造构象受限的肽模拟物，用于药物开发和探针开发。
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概述
本文描述了一种创建肽三级酰胺（PTA）的合成方法，这是一类肽模拟物。该方法结合了分割-池合成和亚单体策略，生成PTA的一个珠一个化合物库。
关键研究组成部分
科学领域
- 肽合成
- 组合化学
- 药物发现
背景
- 肽三级酰胺是一类多样化的化合物超家族。
- 它们包括肽、肽脲和N-甲基化肽。
- 组合库对于高通量筛选非常有价值。
- PTA可以为药物发现提供新的蛋白质配体。
研究目的
- 合成含有PTA单元的组合库。
- 利用天然氨基酸创建PTA亚单体。
- 为药物发现实现高通量筛选。
使用的方法
- 从天然氨基酸制备PTA亚单体。
- 在固相支持上合成肽连接器区域。
- 创建含有PTA和肽亚单元的组合库。
- 对合成的库进行质量保证表征。
主要结果
- 成功合成了含有构象受限PTA亚单元的组合库。
- 该库可用于高通量筛选。
- 潜在应用包括新的蛋白质配体的发现。
- 该方法展示了有效的合成和表征技术。
结论
- 该合成方法为创建PTA库提供了一种强有力的方法。
- 这些库对于推进药物发现工作至关重要。
- 这项工作为肽模拟物和组合化学领域做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Conformationally constrained peptide mimetics such as peptide tertiary amides (PTAs) address a key challenge in early drug discovery: identifying high-affinity protein ligands from combinatorial libraries. By introducing steric and stereochemical constraints through side chains on both α-carbon and backbone nitrogen, PTAs enhance structural preorganization, improving the likelihood of target engagement. This approach supports mechanistic de-risking in lead generation by expanding chemical space beyond traditional peptides and peptoids, offering improved predictive confidence in ligand discovery campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through structurally constrained peptidomimetics that reduce conformational entropy upon binding.
- Operational Value: Supports biological de-risking by generating ligands with increased proteolytic stability and cell permeability, as demonstrated in prior peptoid studies.
- Predictive Value: Enhances target validation confidence by increasing the probability of identifying high-affinity binders from screened libraries.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces one-bead one-compound (OBOC) libraries suitable for high-throughput screening against protein targets.
- Reproducibility: Employs split-and-pool synthesis with sub-monomer chemistry to ensure uniform bead-based compound presentation.
- Scalability: Enables generation of diverse PTA-peptide chimeric libraries amenable to automation and parallel synthesis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a pathway from discovery-stage ligand identification to preclinical validation using MS/MS-sequenceable PTA scaffolds.
- Mechanistic De-risking: Reduces attrition risk by delivering ligands with defined conformation and reduced flexibility, improving target specificity predictions.
- Biomarker Alignment: Supports screening campaigns where conformational constraint correlates with functional activity in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling the synthesis of conformationally diverse PTA libraries that bridge peptidomimetic design and functional screening, supporting progression from target validation to lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening by generating ligands with restricted conformation, improving hit-to-lead progression potential.
- Screening: Delivers OBOC libraries compatible with bead-based assays, enabling standardized, quantitative readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables library characterization via MS/MS sequencing, with fragmentation patterns comparable to peptides, supporting identity confirmation and purity assessment.
- Translational Research: Supports advancement to preclinical studies by yielding proteolysis-resistant and cell-permeable scaffolds suitable for further optimization.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, platform-capable approach for generating diverse PTA libraries across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in ligand discovery by accessing chemically diverse, conformationally constrained peptidomimetic space.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible synthesis of OBOC libraries using split-and-pool and sub-monomer strategies on solid support.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by increasing the likelihood of identifying high-affinity binders, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets through enhanced ligand quality and structural definition in early screening stages.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organic synthesis, solid-phase chemistry, and sub-monomer techniques for PTA precursor preparation.
- Depends on anhydrous conditions, low-temperature reaction control, and inert atmosphere handling during key coupling steps.
- Necessitates access to microfluidic splitting tools, syringe reactors, and purification systems such as silica gel column chromatography.
- Involves optimization of cleavage conditions to minimize TFA-induced degradation, with low-temperature protocols recommended.
- Demands careful monitoring of side products such as acrylamide from amine overconcentration, which can terminate chain elongation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Preparation of Acid Bromide from Natural Amino Acids and Isotopic Labeling of Alanine Using Transaminase
4:39
Synthesis of Peptoid Linker Region
6:15
Split-and-pool Synthesis of PTA Library with (R)- and (S)-2-bromopropionic Acids
11:10
Results: Characterization of a One-Bead-One-Compound Peptide Tertiary Amine Library
13:00
Conclusion
