Name: 免疫组化分析大鼠中枢神经系统和周围淋巴结组织切片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学习大鼠中枢神经系统和周围淋巴结组织切片的双重免疫组化染色方法，通过石蜡包埋、抗原修复和免疫标记实现蛋白质定位可视化，该技术可应用于神经科学和免疫学研究。

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我们感谢Hans Lassmann和Jan Bauer提供的指导与支持。同时感谢Katalin Benedek提供的出色技术协助，以及Caroline Westerlund在语言和内容方面的审阅与评价。
本研究由Biogen Idec、Wenner-Gren基金会、瑞典研究理事会、瑞典神经功能障碍患者协会、瑞典脑基金会、欧盟第六框架计划EURATools（LSHG-CT-2005-019015）和Neuropromise（LSHM-CT-2005-018637）提供的资助支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

伦理声明 
本研究严格遵循瑞典实验动物管理局指南和欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC），并在经北斯德哥尔摩动物伦理委员会批准的伦理许可 N338/09、N15/10 和 N65/10 下进行。
1. 组织制备
<ol>
	<li>灌注 &amp;#38; 固定
	<ol>
		<li>使用异氟烷麻醉动物，经左心室进行心脏灌流。先用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗血管系统以去除血液成分，随后灌注0.1 M PBS中的4%多聚甲醛（PFA）。</li>
		<li>将解剖得到的脑组织、脊髓和外周淋巴结组织浸入PFA中进行固定。4 °C下固定24小时后，将组织从PFA转移至PBS中，4 °C保存备用。除商用PBS外，也可将9 g NaCl溶解于250 ml Sörensen缓冲液中，再加入750 ml去离子水（dH₂O）配制。2O)；配制 0.2 M Sörensen 缓冲液（pH 7.4），需溶解 13.8 g NaH2PO4 x 1H2O 和 71.2 g Na2HPO4 x 2H2O₂ 在 2.5 L 去离子水中2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水 &amp;#38; 包埋
	<ol>
		<li>使用剃刀将组织切成约5 mm厚的片状。</li>
		<li>使用 Tissue-Tek 启动组织硬化过程（脱水）V.I.P 真空渗透处理仪（标准程序：依次浸入浓度递增的乙醇，随后二甲苯，最后石蜡）表1).</li>
		<li>将组织放入模具中，并在样品周围倒入液态石蜡，以形成包埋块 &#34;石蜡包埋块&#34;长期储存需在室温（RT）下进行。然而，在切片前建议将包埋块冷却。 例如， 4 °C 过夜（o/n）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 切片
<ol>
	<li>将石蜡包埋块放入滑动式切片机的固定夹持器中，使其能够来回穿过刀片。调整包埋块与切片刀之间的最佳角度（该角度取决于刀片的几何形状，也与切割速度和技术有关）。</li>
	<li>从石蜡包埋块上切下 3 - 5 µm 厚的横切片。</li>
	<li>将刚切下的切片转移至水浴容器中，随后将其从水中捞起并贴附到载玻片上。</li>
	<li>小心地将贴好的切片压在纸巾上，以去除残留水分和可能存在的气泡。建议使用 commercially pre-coated adhesive glass slides（商品化预涂黏附载玻片）。</li>
	<li>将贴好切片的载玻片在 50 - 60 °C 的烘箱中干燥数小时。</li>
</ol>
3. 脱蜡（复水） &amp;#38; 阻断内源性过氧化物酶活性)
<ol>
	<li>将切片浸入二甲苯（或替代品XEM-200）中2次，每次15–20分钟。</li>
	<li>用99%乙醇冲洗。</li>
	<li>为阻断内源性过氧化物酶活性，将切片在含有0.25%过氧化氢的甲醇溶液中孵育30分钟。</li>
	<li>通过使用含水量逐渐增加的乙醇（99%、70%）进行再水化，最后置于蒸馏水中。</li>
	<li>从此步骤开始直至盖玻片封片完成，切片必须始终保持湿润。</li>
</ol>
4. 抗原修复
<ol>
	<li>使用食物蒸锅将载玻片在抗原修复液（此处为 pH 8.5 的 EDTA 缓冲液）中煮沸 60 分钟（EDTA 缓冲液储存液的配制：将 1.21 g Tris 和 0.37 g EDTA 溶解于 50 ml dH2O 中；工作液的配制：取 2.5 ml EDTA 储存液加入 47.5 ml dH2O 稀释）。</li>
	<li>将载玻片在室温下冷却约 1 小时，然后用 Tris 缓冲盐水（TBS，也可使用 PBS）冲洗 3–5 次；TBS 由 0.05 M Tris 和 0.15 M NaCl 组成，用 HCl 调节 pH 至 7.5。也可使用市售的 TBS 溶液。</li>
</ol>
5. 封闭非特异性结合位点
<ol>
	<li>为避免非特异性背景反应，将切片置于含有10%胎牛血清（FCS）和90% DAKO缓冲液的封闭液中，在室温下孵育30分钟。</li>
</ol>
6. 双重免疫标记：同时与一抗孵育
<ol>
	<li>将所需量的一抗用封闭液稀释，于4 °C孵育过夜。进行双重免疫染色时，将α-eotaxin（Ccl11；1:300）与α-Cd68（Ed1；1:1,000）、或α-Iba1（Aif1；1:1,000）、或α-Cd8α（Ox-8；1:200）联合使用。</li>
	<li>用TBS缓冲液冲洗切片3–5次（也可选用10倍稀释的DAKO缓冲液）。</li>
	<li>将所需量的二抗（生物素化抗山羊抗体和碱性磷酸酶标记的抗小鼠抗体，均为1:200）用封闭液稀释，在室温下孵育1小时。</li>
	<li>用TBS缓冲液冲洗切片3–5次（也可选用10倍稀释的DAKO缓冲液）。</li>
	<li>将切片与辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素-过氧化物酶复合物用封闭液稀释后，在室温下孵育1小时。</li>
	<li>用TBS缓冲液冲洗切片3–5次（也可选用10倍稀释的DAKO缓冲液）。</li>
</ol>
7. 可视化
<ol>
	<li>结合的碱性磷酸酶标记二抗的显色
	<ol>
		<li>通过将 12.1 g Tris 溶解于 1 L dH2O 中配制 0.1 M Tris-HCl 缓冲液，并用 HCl 调节 pH 值。使用相同的 Tris-HCl 缓冲液配制 1 M 左旋咪唑溶液。新鲜配制 4% NaNO2 溶液于 dH2O 中。</li>
		<li>为获得 50 ml 快速蓝（FB）底物（一个标准玻璃比色皿所需体积），将 6.25 mg 萘酚-AS-MX-磷酸盐溶解于 312.5 µl DMF 中，加入玻璃管内，然后混入 50 ml 预热（37 °C）的 Tris-HCl 缓冲液中。将 12.5 mg FB RR 盐溶解于 312.5 µl 2 N HCl 中，加入 312.5 µl 新鲜配制的 4% NaNO2 溶液，将混合物搅拌进入同一份 50 ml 预热的 Tris-HCl 缓冲液中。轻轻振荡，直至黄色液体变澄清，最后加入 77 µl 新鲜配制的 1 M 左旋咪唑溶液。过滤所得混合液，并将其倒入放置于玻璃比色皿中的载玻片上。</li>
		<li>在 37 °C 下开始孵育，并每隔约 15 - 30 分钟在光学显微镜下观察显色过程。若显色模糊，应更换为新鲜的 FB 溶液。</li>
		<li>用 TBS 缓冲液冲洗载玻片 3 - 5 次，随后转移至 PBS 缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结合的生物素化二抗的显色
	<ol>
		<li>通过将 1 ml DAB 储存液（每 1 ml PBS 含 25 mg DAB）稀释于 49 ml PBS 中，配制 DAB/H2O2 显色液。加入 16.5 µl H2O2，在倾倒至切片前进行过滤。</li>
		<li>发色剂 DAB 转化为沉淀性棕褐色色素的过程可能非常迅速。应在光学显微镜下密切监控显色过程（即使孵育时间延长数秒，也可能导致背景过高，掩盖特异性信号）。</li>
		<li>棕褐色沉淀的强度可通过在含 2% 硫酸铜和 0.9% NaCl 的溶液中孵育 5 分钟进行增强。</li>
		<li>用 PBS 冲洗载玻片 3 - 5 次，最后用 dH2O 冲洗，也可选择使用自来水。</li>
		<li>直接从水中用 GelTol 水性封片介质加盖玻片封片。避免产生气泡。</li>
		<li>让封片介质完全干燥，例如，在 4 °C 过夜。将干燥后的载玻片在室温下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.</td>
			<td>% 乙醇</td>
			<td>20'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.</td>
			<td>% 乙醇</td>
			<td>60'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.</td>
			<td>% 乙醇</td>
			<td>90'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>% 乙醇</td>
			<td>60'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.</td>
			<td>% 乙醇</td>
			<td>90'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.</td>
			<td>% 乙醇</td>
			<td>60'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.</td>
			<td>% 乙醇</td>
			<td>90'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.</td>
			<td>% 乙醇</td>
			<td>120'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9.</td>
			<td>二甲苯</td>
			<td>30'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.</td>
			<td>二甲苯</td>
			<td>60'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11.</td>
			<td>石蜡</td>
			<td>60'</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.</td>
			<td>石蜡</td>
			<td>60'</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.</td>
			<td>石蜡</td>
			<td>60'</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.</td>
			<td>石蜡</td>
			<td>120'</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 使用Tissue-TekV.I.P真空浸润处理仪进行组织处理。

<ol><li>Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Mason, D. Y., Sammons, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+peroxidase%3A+anti-peroxidase+complexes+for+immunocytochemical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use.</a> Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).</li>
<li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).</li>
<li>Polak, J. M., Van Noorden, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolak%2C+JM+%22Introduction+to+immunocytochemistry%22">Introduction to immunocytochemistry</a>. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).</li>
<li>Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+detection+efficiency+of+the+peroxidase+antiperoxidase+%28PAP%29%2C+avidin-biotin+peroxidase+complex+%28ABC%29%2C+and+peroxidase-labeled+avidin-biotin+%28LAB%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods.</a> American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of immunohistochemistry.</a> Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Ccl11+associates+with+immune+response+modulation+and+protection+against+neuroinflammation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats.</a> PloS one. 7, 39794(2012).</li>
<li>Bauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+in+PLP-overexpressing+transgenic+rats%3A+gray+matter+oligodendrocytes+are+more+vulnerable+than+white+matter+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuropathology+and+experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes.</a> Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).</li>
<li>Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+contribution+of+CD4+and+CD8+T+lymphocytes+to+T-cell+infiltration+of+the+intact+and+the+degenerative+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord.</a> The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).</li>
<li>Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+populations+of+microglia%2Fmacrophages+in+the+retina+and+their+activation+after+retinal+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury.</a> Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).</li>
<li>Hirasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microglia+in+living+tissues+using+Iba1-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice.</a> Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).</li>
<li>Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+adhesion+mediated+by+CD8+and+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules.</a> Nature. 336, 79-81 (1988).</li>
<li>Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+formaldehyde+fixation+irreversibly+reduces+immunoreactivity+of+Bcl-2+in+the+nuclear+compartment+of+breast+cancer+cells%2C+but+not+in+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).</li>
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<li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Letter%3A+Cleavage+of+heme+from+horseradish+peroxidase+by+methanol+with+inhibition+of+enzymic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).</li>
<li>Streefkerk, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+erythrocyte+pseudoperoxidase+activity+by+treatment+with+hydrogen+peroxide+following+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).</li>
<li>Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endogenous+tissue+alkaline+phosphatase+with+the+use+of+alkaline+phosphatase+conjugates+in+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).</li>
<li>Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+biotin+on+phosphorylation%2C+acetylation%2C+methylation+of+rat+liver+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+reports%22%5BJournal%5D)">Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones.</a> Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).</li>
<li>Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+endogenous+biotin-containing+proteins+in+mouse+Bergmann+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells.</a> The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).</li>
<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

标准的免疫组化（IHC）操作流程通常需要进行特定调整才能获得最佳结果，这往往依赖于丰富的经验，同时也需要采用&#34;试错&#34;的方法。从组织制备到靶标显色，几乎每一步都可能需要进行个性化优化，以提升最终的实验效果。本文所展示的双重染色方案，是一种基于免疫组化的蛋白质检测方法，特别适用于分析神经炎症影响下的甲醛固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和淋巴结（LN）组织切片中目标蛋白之间的相互关系。因此，该方案既可作为学习免疫组化技术的教程，也可为更深入的实验提供参考。但需注意的是，若将本方案直接套用于其他蛋白质检测或不同类型的组织，可能无法获得理想结果。
原位 使用锁核酸（LNA）核糖探针进行杂交 Ccl11 在同源近交系大鼠的中枢神经系统中表现出相应mRNA水平的上调10该结果通过qPCR分析得以证实。此外，qPCR还揭示 Ccl11 在疾病保护性同类系大鼠品系中，与野生型（wt）品系相比，同类系外周淋巴结也出现上调现象。最后，蛋白质印迹（WB）显示，该品系两种靶组织中Ccl11蛋白均显著上调<s...

尽管已采用针对甲基化组、转录组甚至蛋白质组水平的先进高通量分析技术，免疫染色仍然是在组织样本、细胞培养物或细胞涂片中直接检测蛋白质的金标准。通过揭示目标蛋白的定位/分布模式，免疫组织化学（IHC）可评估其相对比例和空间拓扑关系，甚至提示其生物学活性。因此，IHC 被广泛应用于临床诊断和科学研究。 例如用于疾病诊断、治疗评估、疾病机制研究以及动物模型中的功能与表型改变分析， 等等。
免疫组织化学（IHC）本质上涵盖了组织学、病理学、生物化学和免疫学，自1941年首次使用荧光标记的抗体鉴定感染组织中的Pneumococcal抗原以来，已取得显著进展1。IHC通过抗体（Abs）与其特异性抗原（Ag）的结合来实现对细胞产物和组分的可视化。除了使用荧光素标记的抗体外，还可利用过氧化物酶2,3或碱性磷酸酶4等酶来显示免疫反应。此外，胶体金标记的抗体5可用于光学显微镜和电子显微镜下检测特异性的抗原-抗体相互作用，而放射性标记则通过自显影技术进行可视化。
抗原-抗体免疫反应可通过直接法和间接法进行检测。直接法本质上更快、更简单，因其使用直接标记的一抗6。然而，由于其灵敏度显著较低，通常更倾向于采用间接法。两步间接检测法首先使用未标记的一抗，然后使用针对一抗的标记二抗作为第二层7。通过引入与二抗结合的酶偶联三抗（三步间接法），可实现信号放大。常用的间接检测方法包括亲和素-生物素法和过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法。此外，也可使用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）复合物替代PAP法。值得注意的是，碱性磷酸酶（AP）法的灵敏度似乎甚至高于免疫过氧化物酶法4。亲和素-生物素复合物（ABC）法采用生物素化的二抗，与标记的亲和素-生物素复合物（LAB）或标记的链霉亲和素-生物素复合物（SLAB）联合使用。通过使用过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的亲和素，可进一步提高检测灵敏度8。其他正在使用的检测方法还包括聚合物标记法、酪胺信号放大法和免疫滚环扩增法9。值得注意的是，不同的检测方法可联合用于同一组织样本中的多种抗原检测，该技术最早于1978年被报道4。本文所展示的双重免疫染色实验分别在福尔马林固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和淋巴结（LN）组织切片上进行，分别使用了过氧化物酶标记和AP偶联的二抗。信号分别通过3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色剂和Fast Blue（FB）APAAP复合物进行显色。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>异氟烷（Isoflurane）：1-氯-2,2,2-三氟乙基（二氟甲基醚），2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷（C&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ClF&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O）</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td>眼部照射。可能影响生育能力并对子宫内胎儿造成损害。仅可在配备完善的麻醉环境中使用。</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Merck</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（OH(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)&lt;sub&gt;n&lt;/sub&gt;H（n = 8 - 100）），1×PBS 中含 4%</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td><td>健康危害。腐蚀性。易燃。急性毒性。</td></tr><tr><td>乙醇 &amp;#8805;99.5%，无水（CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td>易燃。</td></tr><tr><td>二甲苯（Xylenes，组织学级；C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>易燃。急性毒性。</td></tr><tr><td>Histo-Comp 石蜡</td><td>Tissue-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>粘附性显微镜载玻片</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯替代物 XEM-200</td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>呼吸道致敏。致癌性。</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-CD8（Ox-8）小鼠抗大鼠一抗</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Iba1（AIF1）小鼠抗大鼠一抗</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-CD68（ED1）小鼠抗大鼠一抗</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-嗜酸性粒细胞趋化因子 C-19（CCL11）山羊抗大鼠一抗</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶（AP）标记二抗</td><td>Dakopatts, Denmark</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>生物素化二抗</td><td>Amersham Biotech</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>亲和素-辣根过氧化物酶复合物（HRP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>萘酚AS-MX磷酸盐（C&lt;sub&gt;19&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875-1G</td><td>急性毒性。</td></tr><tr><td>快蓝RR盐，偶氮重氮24号（C&lt;sub&gt;15&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;ClN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; x 1/2 ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑盐酸盐（C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;13&lt;/sub&gt;ClN&lt;sub&gt;2S&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>急性毒性。</td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB显色剂）</td><td>DAKO</td><td>S3000</td><td>高度易燃。有毒。</td></tr><tr><td>硫酸铜（CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>急性毒性。环境危害。</td></tr><tr><td>水溶性封片剂 GelTol</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢，30%（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck</td><td>107210</td><td>急性毒性。</td></tr><tr><td>甲醇（CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;OH）</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>急性毒性。呼吸道致敏。致癌性。易燃。</td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷，TRIS碱（C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>皮肤和眼睛刺激。</td></tr><tr><td>Tris缓冲盐水（TBS），片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>二水合磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; × 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Merck</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; × 1H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>DAKO细胞染色洗涤缓冲液10×</td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>应储存于2-8 &amp;deg;C以抑制细菌生长。避免起泡。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二甲基甲酰胺；DMF（C&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;NO）</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>易燃。急性毒性。</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 24 × 36 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;#228;ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，浓（HCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>腐蚀性，刺激性，渗透性。肺部致敏（以酸雾形式）。有毒。</td></tr><tr><td>盐酸溶液，容量法，2 M HCl（2 N）</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>腐蚀性，刺激性，渗透性。肺部致敏（以酸雾形式）。有毒。</td></tr><tr><td>亚硝酸钠，试剂级，&amp;#8805;99.0%（NaNO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2252</td><td>氧化剂。有毒。对环境有害。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA；C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt; × 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Merck</td><td>1.08454</td><td>口服暴露可能引起生殖和发育毒性。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tissue-Tek&lt;sup&gt;V.I.P&lt;/sup&gt; 真空渗透处理仪</td><td>Sakura</td><td>5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz</td><td></td></tr><tr><td>Hacker-Bright 8000 系列底座滑动式切片机</td><td>Hacker instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>家用食品蒸锅</td><td>Braun</td><td>MultiGourmet FS 20</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Leica Polyvar 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠中枢神经系统及外周淋巴结组织切片的免疫组织化学分析

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

免疫组织化学（IHC）可实现高度特异、可靠且直观的蛋白质可视化。基于IHC的多色标记实验的正确操作与结果解读具有挑战性，尤其是在评估富含脂肪组织（如中枢神经系统，CNS）中靶蛋白之间相互关系时更为复杂。
本方案是对标准免疫标记技术的优化，特别适用于检测受神经炎症影响的大鼠中枢神经系统及外周淋巴结（LN）中的结构蛋白和可溶性蛋白。然而，无论是否进行进一步修改，本方案也可能用于检测其他相关蛋白靶点，甚至适用于本文所述以外的其他器官和物种。

对经甲醛固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和淋巴结（LN）组织切片进行双重免疫染色（共染色）。使用推拉式切片机切割3-5 µm厚的组织切片，将其连续贴附于预涂有黏附剂的玻璃载玻片上，并按先前所述方法处理10,11,12。简言之，切片经脱蜡、再水化及内源性过氧化物酶灭活后，进行抗原修复，随后进行封闭以阻断非特异性结合位点。共染色实验采用以下组合：i) Ccl11/Iba-1，ii) Ccl11/Ed1，以及 iii) Ccl11/Cd8。每种共染色所用的一抗分别来自两种不同物种（山羊和小鼠），从而可同时孵育。Ccl11通过棕黄色的过氧化物酶反应产物显色，而Iba-1、Ed1和Cd8则通过蓝色的碱性磷酸酶（AP）信号显色。
本文所展示的结果已在我们近期关于Ccl11趋化因子在多发性硬化症（MS）样神经炎症中作用的研究中进行了更详细和更全面的阐述10。根据在大鼠中枢神经系统（CNS）中进行的免疫组化分析，C...

本文介绍了一种优化的详细方案，用于对甲醛固定、石蜡包埋的大鼠中枢神经系统（CNS）和外周淋巴结（LN）组织切片进行双重免疫染色。

免疫组织化学（IHC）可提供高度特异、可靠且直观的蛋白质可视化结果。正确地操作和解读基于IHC的……

本实验的总体目标是靶向大鼠组织中的特定蛋白质。首先分离组织，经固定和石蜡包埋后，对组织进行切片并贴附于载玻片上。第二步是脱除石蜡并复水石蜡包埋的组织切片，随后阻断内源性过氧化物酶。接下来，通过抗原修复暴露表位。随后进行封闭，以减少在加入抗体前的非特异性结合。最后一步是使用一抗和二抗进行免疫标记，以检测特定表位，并显影标记的二抗所产生的信号。最终，通过光学显微镜观察信号，以显示蛋白质在组织切片中的定位模式。尽管该方法可用于研究蛋白质在大鼠中枢神经系统及外周淋巴结中的定位与表达模式，但也同样适用于其他器官和物种。演示该实验操作的将是一名技术人员。她名为 Katalin Benedek，来自卡罗林斯卡学院微生物、肿瘤与细胞生物学中心的核心设施。开始组织制备时，将解剖所得的脑、脊髓及外周淋巴结组织浸入4%多聚甲醛中，置于4°C条件下固定24小时。组织固定完成后，将其转移至磷酸盐缓冲液（P-B-S）中，并在4°C下保存，直至后续处理。开始处理组织时，使用剃刀将组织切成大约五毫米大小的片段。然后，使用真空渗透仪启动组织硬化过程。标准操作程序是将组织浸入浓度递增的乙醇中，随后依次进入二甲苯，最后进入石蜡。接下来，将组织放入模具中，在样品周围倒入液态石蜡，形成石蜡块，并于室温下保存。在对组织进行切片前，需将石蜡游戏副本置于冷台或冰箱中过夜冷却。石蜡包埋块冷却后，将其放入切片机的固定夹持器中，切片机可带动包埋块在刀片上来回移动。然后，根据刀片的几何形状、切割速度和技术，调整包埋块与切片机刀片至最佳角度。从石蜡包埋块上连续切下三片厚度为五微米的横切片。然后，将切好的组织片转移至盛水容器中，并从水中将组织片捞出，贴附于 commercially pre-coated adhesive 玻璃载玻片上。接着，小心地将贴好的组织片轻压在纸巾上，以去除残留水分和可能存在的气泡。将贴好组织片的载玻片置于 50 至 60 摄氏度的烘箱中干燥数小时。待切片干燥后，将切片浸入二甲苯中两次，每次15至20分钟。然后用99%乙醇冲洗每张切片。为阻断内源性过氧化物酶活性，将组织切片在含有0.25%过氧化氢的甲醇溶液中孵育30分钟。然后，通过用含水量逐渐增加的乙醇溶液冲洗，继续对组织切片进行复水。最后一步在蒸馏水中完成复水。在封片前务必保持切片湿润。为获取抗原，使用家用蒸锅将载玻片与pH 8.5的EDTA缓冲液加热60分钟。随后，将载玻片在室温下冷却约一小时。待载玻片冷却后，用Tris缓冲盐水（即T-B-S）对每张载玻片冲洗三至五次。接下来，将组织切片置于含有10%胎牛血清和90%洗涤缓冲液的封闭液中，在室温下孵育30分钟，以阻断任何非特异性背景反应。组织切片封闭完成后，用封闭液稀释所需量的一抗，将切片置于该一抗溶液中，在4°C下孵育过夜。次日，用TBS缓冲液冲洗切片3至5次。然后将载玻片与用封闭液稀释的二抗在室温下孵育一小时。随后，再次用 TBS 缓冲液冲洗载玻片三至五次。接着，将载玻片与用封闭液按 1:100 稀释的亲和素-辣根过氧化物酶复合物在室温下孵育一小时。孵育一小时结束后，用 TBS 缓冲液冲洗载玻片三至五次。按照文本方案中所述方法配制快蓝溶液后，轻轻摇动培养皿并过滤所得混合物。将溶液倒入玻璃比色皿中的载玻片上。在37摄氏度下开始孵育，并每隔15至30分钟在光学显微镜下观察显色过程。孵育完成后，用TBS缓冲液将切片冲洗3至5次，随后将切片转移至PBS缓冲液中。配制DAB过氧化氢显色液时，先将1毫升DAB储备液加入49毫升PBS中稀释。加入16.5微升过氧化氢，然后过滤溶液。将溶液倒入载玻片上，并确保在光学显微镜下控制显色过程，以避免高背景信号掩盖特异性信号。随后，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗载玻片三至五次，最后用蒸馏水或自来水洗涤一次。使用水性封片剂，直接从水中将盖玻片封固于载玻片上。避免在盖玻片与载玻片之间产生气泡。封片后，将载玻片于4°C孵育过夜，以使封片剂完全干燥。将干燥的载玻片在室温下保存。对免疫后第7天从大鼠分离的外周淋巴结组织切片进行双重染色显示，CD8阳性T淋巴细胞不分泌趋化因子C-C-L 11。相反，C-C-L 11被发现与E-D1共定位，E-D1是活化巨噬细胞中溶酶体蛋白的标志物。通过对大鼠脊髓进行I-H-C双重染色，发现C-C-L十一在神经元胞体、树突和轴突中表达，但在I-B-A一阳性巨噬细胞和脑内常驻的小胶质细胞中不表达。此外，大多数E-D一阳性巨噬细胞和脑内常驻小胶质细胞也不表达C-C-L 11。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在组织切片中对目标蛋白进行特异且可靠的免疫组织化学定位。

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免疫组化分析大鼠中枢神经系统和周围淋巴结组织切片

本视频展示了小鼠脑切片中 Meynert...

小鼠脑基底前脑Meyner核内神经纤维的免疫组织化学染色

来源：Evilsizor, M. N., et. al., 冰冻切片大鼠脑组织免疫组织化学实验指南：小胶质细胞与神经元染色示例。 J. Vis. Exp.

大鼠冠状组织冰冻切片的小胶质细胞与神经元免疫组织化学染色

本入门级实验方案以小胶质细胞和神经元成分的标记物为例，介绍了完成啮齿类动物脑组织免疫组织化学染色所需的试剂、仪器和操作技术。...

冷冻切片大鼠脑组织免疫组织化学染色初学者指南：小胶质细胞与神经元染色示例

本文介绍一种简单且经济的方法，可用于定量分析肿瘤细胞在淋巴结（LN）冷冻切片上的黏附情况。通过光学显微镜可轻松识别黏附于淋巴结的肿瘤细胞，并采用基于荧光的方法进行确认，从而获得反映肿瘤细胞与淋巴结实质结合亲和力的黏附指数。...

淋巴结冷冻切片中肿瘤细胞黏附的定量分析

主要盆腔神经节包含支配盆腔器官的副交感和交感神经元。本文介绍了一种解剖方法，并提供了用于识别这些神经节及其相关神经的示意图。这些方法可用于在体实验中对这些神经节进行操作，或在死后取出以供进一步研究。...

大鼠盆腔自主神经节及其相关神经的分离（适用于雄性和雌性大鼠）

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本文介绍了两种优化的实验方案，用于分析中枢神经系统（包括脑、脊髓和脑膜）中的常驻免疫细胞及外周来源的免疫细胞。这些方案有助于确定在稳态和炎症条件下定位于这些解剖区域的细胞的功能与组成。...

分离中枢神经系统组织及其相关脑膜用于免疫细胞的下游分析

本文介绍了一种精确采集胸导管淋巴细胞并利用延时摄影技术观察肠道趋向性淋巴细胞在大鼠派尔集合淋巴结中迁移过程的方法，观察时长为3小时。该技术可用于阐明在炎症条件下淋巴细胞动态行为的变化。...

大鼠派伊尔集合淋巴结中淋巴细胞动态的显微观察

游离漂浮法可使研究人员对固定组织切片进行基于组织学的染色，包括免疫组织化学染色，以观察生物结构、细胞类型以及蛋白质的表达与定位。这是一种高效且可靠的组织化学技术，可用于研究多种组织，如脑、心脏和肝脏。...

基于组织切片的游离漂浮染色技术

介绍了一种便捷的重力灌注法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析。在帕金森病小鼠模型中，展示了磷酸化α-突触核蛋白的免疫荧光检测。本研究还全面描述了经心脏灌注、解剖、组织冷冻/包埋以及冷冻切片等步骤。...

一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法

本方案描述了一种用于评估过敏性鼻炎大鼠模型的多色免疫荧光技术。...

过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织切片的免疫荧光标记 通过 多色免疫分析

学习大鼠中枢神经系统和周围淋巴结组织切片的双重免疫组化染色方法，通过石蜡包埋、抗原修复和免疫标记实现蛋白质定位可视化，该技术可应用于神经科学和免疫学研究。

大鼠中枢神经系统及外周淋巴结组织切片的免疫组织化学分析

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