大鼠中枢神经系统及外周淋巴结组织切片的免疫组织化学分析

本实验的总体目标是靶向大鼠组织中的特定蛋白质。首先分离组织，经固定和石蜡包埋后，将组织切片并贴附于载玻片上。第二步是脱去石蜡包埋组织切片中的石蜡并进行再水化，随后阻断内源性过氧化物酶活性。

接下来，通过抗原修复暴露表位。随后进行封闭，以减少在加入抗体前的非特异性结合。最后一步是通过一抗和二抗进行免疫标记，以检测特定表位，并显影标记的二抗所产生的信号。

最终，通过光学显微镜观察信号，以显示组织切片中蛋白质的定位模式。尽管该方法可用于研究大鼠中枢神经系统及外周淋巴结中蛋白质的定位与表达模式，但也同样适用于其他器官和物种。演示该操作流程的将是一名技术人员。

她名为 Katalin Benedek，来自卡罗林斯卡学院微生物学、肿瘤与细胞生物学中心的核心设施。开始组织制备时，将解剖所得的脑、脊髓及外周淋巴结组织浸入4%多聚甲醛中，并于4°C条件下放置24小时。组织固定后，将其转移至磷酸盐缓冲液（P-B-S）中，并在4°C下保存，直至进一步处理。

开始处理组织时，使用剃刀将组织切成约五毫米大小的片段。随后，使用真空渗透仪启动组织硬化过程。标准操作流程为依次浸入浓度递增的乙醇，然后是二甲苯，最后是石蜡。

接下来，将组织放入模具中。在样品周围倒入液态石蜡，制成石蜡包埋块，并于室温下保存。在对组织进行切片前，需将石蜡包埋块置于冷台或冰箱中过夜冷却。

石蜡包埋块冷却后，将其放入切片机的固定夹持器中，使包埋块能够相对于刀片前后移动。然后，根据刀片的几何形状、切片速度和技术，调整包埋块与切片刀至最佳角度。从石蜡包埋块上连续切下三张厚度为五微米的横切面切片。

然后，将切好的组织片转移至盛有水的容器中，并从水中将组织片捞起，贴附到商用预涂黏附剂的玻片上。接着，小心地将贴好的组织片轻压在纸巾上，以去除残留的水分和可能存在的气泡。将贴好组织的玻片置于50至60摄氏度的烘箱中干燥数小时。

切片干燥后，将切片浸入二甲苯中两次，每次15至20分钟。随后，用99%乙醇冲洗每张切片。为阻断内源性过氧化物酶活性，将切片在含有0.25%过氧化氢的甲醇溶液中孵育30分钟。

然后，通过用乙醇溶液依次冲洗组织切片进行复水，乙醇溶液中水的含量逐渐增加。最后一步复水在蒸馏水中进行。在盖玻片封片前，务必保持切片湿润。

为获取抗原，使用家用蒸锅将载玻片与pH 8.5的EDTA缓冲液加热处理60分钟。随后，将载玻片在室温下冷却约一小时。待载玻片冷却后，用Tris缓冲盐水（即T-B-S）每张冲洗三至五次。

接下来，将组织切片置于含有10%胎牛血清和90%洗涤缓冲液的封闭液中，在室温下孵育30分钟，以阻断任何非特异性背景反应。组织切片封闭完成后，用封闭液稀释所需量的一抗，将切片置于该一抗溶液中，在4°C条件下过夜孵育。次日，用TBS缓冲液冲洗切片3至5次。

然后将切片与用封闭液稀释的二抗在室温下孵育一小时。随后，再次用TBS缓冲液冲洗切片三至五次。接着，将切片与链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物（按1:100比例用封闭液稀释）在室温下孵育一小时。

一次孵育一小时完成后，用 TBS 缓冲液将玻片冲洗三至五次。按照文本方案中所述配制快蓝溶液后，轻轻摇动培养皿并过滤所得混合物。将溶液倒入玻璃比色皿中的玻片上。

在37摄氏度下开始孵育，并每隔15至30分钟在光学显微镜下观察显色过程。孵育完成后，用TBS缓冲液将玻片冲洗三至五次，随后将玻片转移至PBS缓冲液中。配制DAB过氧化氢显色液时，先将1毫升DAB储备液加入49毫升PBS中稀释。

加入16.5微升过氧化氢，然后过滤溶液。将溶液倒入载玻片上，并确保在光学显微镜下控制显色过程，以避免高背景信号掩盖特异性信号。随后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗载玻片三至五次，最后用蒸馏水或自来水洗涤一次。

使用水溶性封片剂，直接从水中将盖玻片封片。避免在盖玻片与载玻片之间产生气泡。封片后，将载玻片于4°C孵育过夜，以使封片剂完全干燥。

将干燥的载玻片在室温下保存。对免疫后第7天从大鼠分离的外周淋巴结组织切片进行双重染色显示，CD8阳性T淋巴细胞不分泌趋化因子C-C-L 11。相反，C-C-L 11被发现与E-D1共定位，E-D1是活化巨噬细胞中溶酶体蛋白的标志物。

通过对大鼠脊髓进行 I-H-C 双重染色，发现 C-C-L 11 在神经元胞体、树突和轴突中表达，但在 I-B-A 1 阳性的巨噬细胞和脑内常驻的小胶质细胞中不表达。此外，大多数 E-D 1 阳性的巨噬细胞和脑内常驻的小胶质细胞也不表达 C-C-L 11。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在组织切片中对蛋白质进行特异且可靠的免疫组织化学定位。