免疫组化分析大鼠中枢神经系统和周围淋巴结组织切片

该程序的总体目标是靶向大鼠组织中的特定蛋白质。这是通过首先分离、固定和石蜡包埋组织，然后切片组织并将其固定在载玻片上来实现的。第二步是石蜡包埋的组织切片脱蜡和再水化，然后封闭内源性过氧化物酶。

接下来，通过抗原修复发现表位。随后，在引入抗体之前进行封闭以减少非特异性结合。最后一步是通过用一抗和二抗进行免疫标记来检测特异性表位，并从标记的二抗中产生信号。

最终，使用光学显微镜对信号进行可视化，以显示组织切片中的蛋白质定位模式。虽然这种方法可以深入了解大鼠中枢神经系统和外周淋巴结中的蛋白质定位和表达模式，但它也可以应用于其他器官和物种。为了演示该程序，将由技术人员负责。

她的名字叫 Katalin Benedek，来自卡罗林斯卡医学院微生物肿瘤和细胞生物学中心的核心设施。开始组织制备时，将解剖的大脑、脊髓和外周淋巴结组织浸入 4% 的多聚甲醛中，并将其置于 4 摄氏度下 24 小时。组织固定后，将组织转移到 PBS 中并储存在 4 摄氏度直至进一步处理。

要开始处理组织，请使用剃须刀片将组织切成大约 5 毫米大小的部分。然后，使用真空浸润处理器启动组织硬化过程。标准程序基于浸入浓度递增的乙醇中，然后浸入二甲酚，最后浸入石蜡中。

接下来，将纸巾放入模具中。将液体石蜡倒入样品周围，形成石蜡块，并在室温下储存。在对组织进行切片之前，将石蜡块在冷板或冰箱中冷却过夜。

石蜡块冷却后，将块放入雪橇式切片机的固定支架中，该切片机可以在刀上来回移动。然后，将切片机块和切片机刀调整到最佳角度，这取决于刀的几何形状以及切割速度和技术。从石蜡块上切下三个 5 微米厚的横截面。

然后，将切割的切片转移到水容器中，并将切片从水中安装到商用预涂层粘性载玻片上。接下来，小心地将安装的部分压在纸巾上，以去除残留的水和潜在的气泡。将安装好的载玻片在设置为 50 到 60 摄氏度的炉子中干燥几个小时。

玻片干燥后，将玻片浸入二甲酚中两次，每次 15 至 20 分钟。然后，用 99% 乙醇冲洗每张载玻片。为了阻断内源性过氧化物酶活性，将切片在含有 0.25% 过氧化氢的甲醇溶液中孵育 30 分钟。

然后，用含水量增加的乙醇溶液冲洗，继续对组织切片进行再水化。在蒸馏水中执行最后的再水化步骤。确保保持切片湿润，直到安装盖玻片。

要回收抗原，请用家用蒸笼和 EDTA 缓冲液在 pH 8.5 下加热玻片 60 分钟。然后，在室温下冷却载玻片约 1 小时。载玻片冷却后，用 Tris 缓冲盐水或 TBS 冲洗每张载玻片 3 到 5 次。

接下来，在含有 10% 胎牛血清和 90% 洗涤缓冲液的封闭溶液中，将组织切片在室温下孵育 30 分钟，以封闭任何非特异性背景反应。封闭组织切片后，在封闭溶液中稀释所需量的一抗，并将载玻片在该一抗溶液中于 4 摄氏度孵育过夜。第二天，用 TBS 缓冲液冲洗载玻片 3 到 5 次。

然后将玻片与在封闭溶液中稀释的二抗在室温下孵育 1 小时。然后，再次用 TBS 缓冲液冲洗载玻片 3 到 5 次。然后，将载玻片与在封闭溶液中稀释 1 至 100 的亲和素辣根过氧化物酶复合物在室温下孵育 1 小时。

孵育 1 小时后，用 T-B-S 缓冲液冲洗玻片 3 到 5 次。按照文本方案中的说明制备固蓝溶液后，轻轻摇动培养皿并过滤获得的混合物。将溶液倒在玻璃比色皿中的载玻片上。

37 摄氏度下开始孵育，并在光学显微镜下每 15 到 30 分钟观察一次发育过程。孵育完成后，用 T-B-S 缓冲液冲洗玻片 3 到 5 次，然后将玻片转移到 P-B-S 缓冲液中。要制备 D-A-B 过氧化氢显影液，首先在 49 毫升 P-B-S 中稀释 1 毫升 D-A-B 储备液。

加入 16.5 微升过氧化氢，然后过滤溶液。将溶液倒在载玻片上，并确保在光学显微镜下控制显影过程，以避免可能掩盖特定信号的高背景。然后，用 PBS 冲洗载玻片 3 到 5 次，然后用蒸馏水或自来水进行最后洗涤。

使用水性封固剂直接从水中封片带盖玻片。避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡。安装切片后，将载玻片在 4 摄氏度下孵育过夜，以使安装介质完全干燥。

将干燥的玻片储存在室温下。免疫后第 7 天从大鼠分离的外周淋巴结组织切片的双重染色显示，CD8 阳性 T 淋巴细胞不分泌趋化因子 C-C-L 11。或者，发现 C-C-L 11 与活化巨噬细胞中溶酶体蛋白的标志物 E-D one 共定位。

大鼠脊髓的 I-H-C 双染色在神经元核周、树突和轴突中发现了 C-C-L 11 的产生，但在 IBA 阳性巨噬细胞和脑驻留的小胶质细胞中没有。此外，还发现大多数 E-D one 阳性巨噬细胞和脑驻留小胶质细胞不是 C-C-L 11 阳性。观看此视频后，您应该对如何在组织切片中直接对蛋白质进行特异性和可靠的免疫组织化学靶向有很好的了解。