Name: 一种重力喂养的经心灌注方法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 学习一种简便的重力灌注方法，用于小鼠中枢神经系统组织学分析。该方案使用常见实验材料，可在帕金森病模型中实现磷酸化α-突触核蛋白的免疫荧光检测，为神经退行性疾病研究提供可靠的技术支持。

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作者感谢王晓雯、Liam Coyne 和 Jason Grullon 在本方案开发过程中提供的帮助。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 AG061204 和 AG063499。

<ol><li>Tao-Cheng, J. H., Gallant, P. E., Brightman, M. W., Dosemeci, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+synapses+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Structural changes at synapses after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 501 (5), 731-740 (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>McFadden, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+in+brain+banking%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation in brain banking: a systematic review.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 146(2019).</li>
<li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+fine+structure%2C+and+immunostaining+for+neuropeptides%3A+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (3), 389-398 (1986).</li>
<li>Adickes, E. D., Folkerth, R. D., Sims, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+perfusion+fixation+for+improved+neuropathologic+examination%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 121 (11), 1199-1206 (1997).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).</li>
<li>Martin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+alpha-synuclein+transgenic+mice+develop+neuronal+mitochondrial+degeneration+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death.</a> Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+is+phosphorylated+in+synucleinopathy+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions.</a> Nature Cell Biology. 4 (2), 160-164 (2002).</li>
<li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+and+insolubility+of+alpha-synuclein+in+transgenic+mouse+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes.</a> EMBO Reports. 3 (6), 583-588 (2002).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> American Journal of Hypertension. 14, 405-408 (2001).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本工作描述了进行心脏灌注的关键步骤。在构建灌注装置（方案第1部分）时，重要的是使用足够柔软的管路，以便能被止血钳完全夹闭。一些较硬的管路可能无法被止血钳充分夹闭，从而在初始PBS灌注期间仍允许PFA渗入主线路。在配制4% PFA溶液时，必须确保其pH值为生理水平（7.4）。由于PFA溶液的配制过程需要将其加热至65 °C，因此在测量pH值前必须将其冷却至25 °C，因为pH计的校准是在该温度下进行的。
在进行腹部初始切口时，必须注意避免损伤腹腔器官（方案第2节）。向上分离至横膈膜时，应特别注意避免损伤肝脏，因为肝脏常与腹前壁粘连。为避免此情况，需先将肝脏从腹前壁小心地钝性分离，再继续向横膈膜方向切开。通过横膈膜进入胸腔时，应注意避免损伤心脏、大血管及肺组织。为避免损伤，应保持剪刀尖端浅层操作，并与肋骨呈锐角。
从开始切口到暴露心脏的初步解剖过程大约需要2分钟。在此期间，预计会有一些空气进入蝴蝶针的针尖。若将这些空气注入小鼠循环系统，将导致灌注质量不佳。因此，在插管心脏前，必须打开主通路，并立即用PBS冲洗针头，以去除气泡。理想情况下，应在针尖持续有少量PBS流出的状态下进行心脏插管，以确保穿刺左心室时完全无空气存在。
当针头进入左心室（LV）时，不得刺入过深，以免针尖进入右心室（RV）。若针头置于右心室或越过二尖瓣，则在开始灌注时会立即导致肺部&#34;膨胀&#34;，这是不理想的情况，必须将针头略微回撤以确保其位于左心室内。若针头位置正确，灌注过程中肺部将保持扁平状态。开始灌注时，有时可观察到有透明液体从动物张开的口腔中流出，这通常是由于灌注压力过高或针头在心脏内位置不当所致。作者推测，过高的灌注压力会导致灌注液从微动脉毛细血管床外渗，并经支气管树逆流进入食管和口腔。
必须通过降低PBS瓶中PBS液面高度或降低PBS瓶的位置来减小灌注压力。或者，如果针头插入左心室过深，可能会穿过二尖瓣，将灌注液送入左心房，从而导致灌注液经肺静脉逆流，并渗入小动脉，如上所述。使用PBS彻底清除循环系统中的血液尤为重要，以避免后续固定液灌注时因固定液诱导血液成分发生交联而导致血管阻塞。可通过观察肝脏颜色变化以及从尾部腹侧基部切口处流出的PBS液体颜色变化来有效评估清除效果。通常在PBS灌注3分钟后血液清除即已完成；然而，若在更短时间内已观察到明显的清除迹象，则可提前于3分钟时开始引入固定液。不建议延长清除时间，因为固定液灌注延迟会导致中枢神经系统细微结构出现人工假象1。
灌注PFA时，需密切监测PFA瓶中溶液的液面高度。当PFA液面降至距离PFA瓶口不足4 cm时，应及时补充。灌注完成后，必须用蒸馏水彻底冲洗灌注装置。这一点至关重要，因为主管路中残留的PFA会污染后续的初始PBS灌注液，导致灌注质量下降。&#160;通常建议对体重在20–30 g范围内的普通成年小鼠使用25 G蝶形针。然而，对于体型较大或较小的小鼠，可能需要适当调整针头规格（即使用稍粗或稍细的针头），并相应调节固定液瓶的高度，以获得最佳的灌注流速。
对于中枢神经系统解剖和OCT包埋（方案第3部分），脊髓组织在30%蔗糖溶液中通常无法完全沉底。因此，无论组织是否沉底，均将其在蔗糖溶液中放置2天后进行OCT包埋。当在OCT中冷冻组织时，某些组织在放入冷却的2-甲基丁烷中可能会出现开裂。这种情况在脑组织中更为常见，通常是由于在组织上使用了过多的OCT所致。为避免此问题，在立即冷冻前仅需使用足以覆盖组织表面的OCT量即可。在某些方案中，即使组织完全浸没于OCT中，开裂现象也较少发生，这通常是由于采用了较慢的冷冻方法，例如使用干冰冷却的2-甲基丁烷或将冷冻模具直接放置在干冰块上。本研究中优先选用液氮冷却的2-甲基丁烷，因其冷冻速度显著更快，可能比慢速冷冻方法更有利于保持组织形态。
在进行组织冷冻切片（方案第4部分）时，应避免多次冻融循环。因此，最佳做法是从单个OCT包埋块中切下所有切片，以获取特定脑区用于分析，而不是反复冻融选定区域。如果无法实现这一点，用户在获得若干切片后，可将OCT包埋块重新冷冻，并在-80 °C超低温冰箱中保存1至2次，以供后续使用。
与更传统的泵或气压灌注液输送方法相比，本方法的主要优势如下：（1）灌注装置成本低且易于获取；（2）使用者在整个灌注过程中无需手动维持灌注装置内的压力；（3）相较于其他低成本灌注方式（如注射器推注），本法的灌注压力更低且更稳定。根据伯努利方程计算，当灌注液瓶相对于针头抬高1 m时，本实验构建的重力驱动灌注装置可维持约73 mm Hg的灌注压力。由于该压力显著低于这些动物的收缩压，因此足以避免血管破裂12。
研究人员已成功利用该灌注系统在帕金森病小鼠模型中检测到磷酸化α-突触核蛋白的存在。在此期间，该灌注方法并未出现除泵灌注递送方法本身固有的问题之外的显著局限性。该技术的主要局限在于，与滴注固定相比，灌注过程较为耗时。然而，由于灌注能使固定剂更深入地渗透至中枢神经系统结构，因此该方法优于滴注固定。该技术的第二个局限是操作需要一定的外科技能，因为在打开胸腔后必须迅速完成心脏插管。不过，经过训练的操作人员在积累经验后，通常可在腹部初始切口后1分钟内完成心脏插管。

小鼠中枢神经系统（CNS）病理学的组织学表征是神经退行性研究中常用的常规技术。由于神经组织在死亡后会迅速降解，通常需向CNS组织灌注化学固定剂（如多聚甲醛）以保存其形态结构1,2化学固定可通过用固定液进行全身灌注，或通过分离组织并将其浸入固定液中（称为浸泡固定）来完成。 &#34;滴加固定液&#34;灌注是固定剂递送的首选方法，因为滴加固定可能无法使固定液快速渗透到中枢神经系统深部结构3,4,5此外，由于未固定的脊髓难以从椎管中取出，通过灌注方式输送固定液可实现对脊髓的充分固定 原位 保存脊髓的显微和大体解剖结构，并使组织硬化以减少取出过程中的损伤。
用于固定所需的缓冲液和固定液的递送通常通过市售泵或气压装置完成。灌注液的重力递送可作为泵递送的一种替代方案，原因如下：（1）在某些情况下，泵或气压递送可能需要操作者在整个灌注过程中手动维持系统压力，而重力递送可在无需人工干预的情况下持续维持灌注液的输送。（2）操作者可通过获取 readily 可得的材料，以较低成本自行构建重力驱动的灌注装置&#160;从标准科学供应商处获取。本研究描述了如何使用洗瓶和乙烯基管构建一个简单的重力灌注装置。利用帕金森病小鼠模型，本研究展示了该系统在组织分离前对脑和脊髓组织进行灌注的有效性。本研究全面描述了从动物体内解剖固定组织、快速冷冻包埋并进行冷冻切片，以及通过间接免疫荧光显微镜检测脑和脊髓中磷酸化α-突触核蛋白存在的全部步骤、技术和所需材料。

<table><tbody><tr><td>2-甲基丁烷（ACS认证），Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1029572</td><td></td></tr><tr><td>Artman Instruments 4.5&quot; 直型卡斯特罗维霍弹簧剪</td><td>亚马逊</td><td>B0752XHK2X</td><td>&quot;精细剪刀&quot;</td></tr><tr><td>BD通用型与PrecisionGlide皮下注射针头，18 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td></td></tr><tr><td>BD通用型与PrecisionGlide皮下注射针头，22 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826B</td><td></td></tr><tr><td>康宁PES针筒式滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-29</td><td></td></tr><tr><td>Cytiva HyClone 磷酸盐缓冲液（PBS），10 倍浓缩液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents 牛血清白蛋白（BSA）无蛋白酶粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 弯头中等尖端通用镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-110</td><td>&quot;弯头有孔镊&quot;</td></tr><tr><td>Fisherbrand 弯曲超细精密尖头镊</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td>&quot;弯头精细镊&quot;</td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性刻度移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 高精度直头超细尖镊子/钳子</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td>&quot;直头精细镊子&quot;</td></tr><tr><td>Fisherbrand 圆头微量刮勺</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-5</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 瓷质布氏漏斗（带固定式穿孔板）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB966J</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 优质盖玻片，24 x 50</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 优质组织镊，1×2 齿，5 英寸，德国钢</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-820-074</td><td>&quot;皮肤镊&quot;</td></tr><tr><td>Fisherbrand 可重复使用厚壁过滤瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB3002000</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 标准解剖剪</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td>&quot;解剖剪&quot;</td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性无菌注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-464</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 直型锁扣式止血钳</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-115</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 乙烯基管路和连接器套装，1/4 英寸</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-174-1C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 湿强定性滤纸圆片</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-790-12F</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Y型连接器，内径1/4英寸 - 聚丙烯 - 质量控制</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-000-686</td><td></td></tr><tr><td>加维经济型单刃切割刀片</td><td>亚马逊</td><td>B001GXFAEQ</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）二抗，DyLight 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35552</td><td></td></tr><tr><td>理想钳 Stant 高压夹具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-198-5A</td><td>&quot;软管夹&quot;</td></tr><tr><td>IMEB公司 Sakura Accu-Edge低剖面一次性切片刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9822467</td><td></td></tr><tr><td>Kawasumi 25 号标准带翼采血套装</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-010-137</td><td>&quot;蝴蝶针&quot;</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 一次性擦拭纸（单层）</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Molecular Probes ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 窄口 Right-to-Know LDPE 洗瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2425-0506</td><td>&quot;缓冲液瓶&quot;</td></tr><tr><td>PAP笔</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛颗粒</td><td>电子显微镜系统</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 玻璃干燥皿，34.9 x 24.9 x 6 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242D</td><td></td></tr><tr><td>重组抗α-突触核蛋白（磷酸化 S129）抗体 [EP1536Y]</td><td>abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-2.5kg</td><td></td></tr><tr><td>18盎司不锈钢饮水杯</td><td>亚马逊</td><td>B0039PPO9U</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖（分子生物学级）CAS：57-50-1</td><td>Us Biological</td><td>S8010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Us Biological</td><td>T8655</td><td></td></tr><tr><td>Vetone Fluriso 异氟烷 USP</td><td>MWI动物健康</td><td>502017</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法

A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System

对从小鼠分离的脑和脊髓标本进行组织学分析，是评估该模型系统病理状况的常规做法。为了保持这些精细组织的形态，通常需要通过麻醉动物的心脏插管（经心灌注）注入化学固定剂（如多聚甲醛）。传统的小鼠心脏经心灌注依赖蠕动泵或气压装置来输送此过程所需的生理盐水和固定剂溶液。作为一种更易获取的替代方法，本研究展示了一种利用重力驱动的灌注液输送方法，其所需材料在大多数五金商店均可购得。
为了验证这种新的灌注方法，本研究展示了在脑组织和脊髓中敏感检测磷酸化α-突触核蛋白所需的全部后续步骤。这些步骤包括固定后脑组织和脊髓组织的解剖、组织的快速冷冻包埋与冷冻切片，以及免疫荧光染色。由于该方法可实现固定液的全身输送，因此也可用于制备其他非神经组织以进行组织学分析。

高质量灌注的标志是肝脏、脊髓和深部中枢神经系统结构中无血液残留（图4C 和 图5G、H）。硬脑膜下方（例如静脉窦内）或硬脑膜与颅骨之间的残留血液通常不会造成问题，因为这些血液并未进入脑实质。在 图4A 中观察到的血液位于颅骨与硬脑膜之间，因此并不影响灌注质量，也不提示灌注效果不佳。新鲜的脑和脊髓组织质地较软，在操作过程中容易受损。相比之下，充分固定的组织则较为坚实。为评估本灌注方法对组织质量及组织形态保存的效果，本研究展示了在15月龄和7月龄表达人源A53T突变型α-突触核蛋白的小鼠中脑和腰段脊髓中磷酸化α-突触核蛋白的检测结果（图6）。
A53T 突变在常染色体显性遗传帕金森病（PD）患者中出现频率较高。此外，当在小鼠中表达携带 A53T 突变的人源 α-突触核蛋白时，可重现人类帕金森病的多种特征6,7. 已有研究表明，α-突触核蛋白在丝氨酸129位点的磷酸化 体内 和 体外 诱导α-突触核蛋白聚集8路易小体是帕金森病（PD）或路易小体痴呆患者中典型的组织病理学发现。9路易小体中大部分的α-突触核蛋白在丝氨酸129位点被磷酸化10,11因此，磷酸化α-突触核蛋白的累积被用作帕金森病（PD）病理组织学严重程度的标志物。本研究发现，在15.5月龄有症状的小鼠中，磷酸化α-突触核蛋白的累积水平显著高于7月龄无症状的表达人源A53T α-突触核蛋白的小鼠。这一结果与已有报道一致，这些报道描述了在这些小鼠脊髓前角和中脑区域细胞病理学改变的富集现象。6 由此得出结论，本文所述的简化灌注方法可为中枢神经系统组织提供高质量的固定，适用于后续的组织学表征。
<img alt="中脑、腰椎脊髓的α突触核蛋白A53T突变体荧光显微图像；PS129标记，年龄比较示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63386/63386fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：帕金森病小鼠模型中脑和腰段脊髓组织中磷酸化α-突触核蛋白的标记。对一只15.5月龄的终末期瘫痪小鼠与一只7月龄的健康小鼠进行比较。这两只小鼠均表达一种易于错误折叠的人源α-突触核蛋白突变体（A53T），可诱导类似帕金森病的病理变化。比例尺 = 100 µm（上排图像）和50 µm（下排图像）。缩写：α syn-A53T = α-突触核蛋白的A53T突变体；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；PS129 = α-突触核蛋白丝氨酸129位点的磷酸化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63386/63386fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

介绍了一种便捷的重力灌注法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析。在帕金森病小鼠模型中，展示了磷酸化α-突触核蛋白的免疫荧光检测。本研究还全面描述了经心脏灌注、解剖、组织冷冻/包埋以及冷冻切片等步骤。

对从小鼠分离的脑和脊髓标本进行组织学分析，是评估该模型系统病理状况的常规做法。要……

本方案提供了一种在小鼠中进行固定剂灌注的简单方法，可实现对中枢神经系统组织的组织学研究，且无需大量投入。本文所述重力灌注法的主要优势在于，灌注装置可使用 readily available 组件构建。演示该操作的是陈新杰博士实验室的医学博士生 Arnav Rana。首先，使用锋利的剃须刀片，将两个500毫升冲洗瓶内部的导管修剪平整，使其与瓶盖螺纹内侧齐平。在每个缓冲液瓶的底部切割一个4厘米×4厘米的方形孔，然后在每个瓶底再切一个小孔，以便插入弯曲的不锈钢微型刮勺。接下来，将微型刮勺弯成S形，使其可用作钩子来悬挂缓冲液瓶。将弯曲的微型刮勺插入缓冲液瓶的相应开口中。接着，用两根25厘米长的管子分别紧密连接外瓶的吸管出口，并用Y型连接头将这两根管子的末端连接在一起，然后将一根2米长的管子连接到Y型连接头的自由端。从1毫升注射器上取下推杆后，先用剃刀片在距离注射器尖端约6厘米处划痕，然后迅速折断注射器塑料部分。将注射器的切割面充分插入塑料管的自由端，并确保密封紧密。接下来，将一个缓冲液瓶标记为PFA，另一个标记为PBS。从瓶口起测量约三分之一瓶身长度，在该位置围绕瓶身画一条线，以标示灌注液的适当填充液位。将一个大号回形针拉直后，弯成一个可环绕管路周长的环形结构，并将此环固定在靠近注射器的管路位置。然后将一块大小合适的泡沫塑料块放入玻璃托盘中，将回形针的两端插入泡沫塑料块内以固定管路，并用纸巾将玻璃托盘前端抬高约2厘米。用蒸馏水冲洗一个1升烧杯后，加入约800毫升18兆欧·厘米的分子生物学级水。将烧杯放入微波炉加热3分钟，或直至水温达到65摄氏度，随后将其放置于通风橱内的加热板或搅拌板上。接着，用蒸馏水冲洗玻璃棒，并将其放入烧杯中。启动搅拌器，将电热板调至中等加热档位，确保水温不超过70摄氏度。佩戴外科口罩、手套和实验服后，称取40克PFA粉末，加入加热的水中，然后使用移液管向溶液中加入数滴5摩尔的氢氧化钠。让粉末充分溶解。如果粉末未完全溶解，可根据需要添加更多氢氧化钠。当所有PFA几乎完全溶解后，立即停止搅拌和加热，然后加入100毫升10×PBS，再用18兆欧·厘米的分子生物学级水定容至1升刻度线。用塑料膜盖住烧杯，并将其放入-20摄氏度的冷冻机中，直至溶液达到室温。使用适当的标准溶液校准pH计后，将烧杯置于搅拌台上，测量溶液的pH值。逐滴加入盐酸，直至pH值达到7.4。如果pH值过低，加入5摩尔的氢氧化钠以提高pH值。接下来，将真空瓶连接至真空泵，并在瓶口放置一个带有滤纸的洁净陶瓷布氏漏斗。开启真空泵后，使用装有4%PFA溶液的移液管润湿滤纸，然后缓慢将溶液倒入漏斗中的滤纸上，直至所有溶液完成过滤。过滤后，将溶液置于避光容器中，在 4 摄氏度保存直至使用。在通风橱内，将泡沫塑料解剖板放入玻璃托盘中。确保解剖板上有五到六根短针，用于手术过程中固定小鼠，另需两根长针用于支撑灌注管路。接下来，用蒸馏水冲洗灌注装置。待所有水排尽后，将灌注瓶悬挂于待灌注动物上方一米处，然后使用分子生物学级水稀释10x PBS，配制非无菌的1x PBS。用止血钳夹闭灌注装置的主线路，再用另一把止血钳夹闭PFA管路。用 PBS 填充缓冲液容器后，将灌注装置的注射器端放入烧杯中以收集废液，并移除阻断主通路的止血钳。在 PBS 流经管路时，用力轻敲管壁以去除 trapped 的空气。当缓冲液和主通路中的所有空气均被排出后，通过在主通路上夹紧止血钳来阻断液体流动。接下来，从PFA管路中移除止血钳，使PBS逆向流入PFA瓶中，同时轻弹PFA管路以排出其中的气泡。继续让PBS进入PFA管路，直至在瓶口上方可见液体，然后用止血钳夹闭PFA管路，阻止PBS继续流入PFA瓶。随后，将蝶形输液针连接至灌注注射器，并打开主路止血钳，使PBS流经管路，以排出灌注注射器中的气泡。气泡去除后，关闭主通路止血钳。确保 PBS 瓶中的 PBS 体积约为其容量的 1/3。如有必要，可通过主通路冲洗 PBS，或向缓冲瓶中添加更多 PBS，直至达到其满容量的 1/3。当 PBS、PFA 和主线路中的所有气泡均被排尽后，将室温下的 4% PFA 溶液加入 PFA 瓶中，直至液面达到瓶身的黑色标记处。接着，先用清水、再用 70% 乙醇清洁所需器械，以准备非存活性手术。将麻醉后的 C57 black 6J 小鼠固定于泡沫板上后，用皮肤镊提起腹部皮肤，并用大剪刀剪开腹壁，开始手术操作。继续向上方沿腹部切开至肝脏，然后将肝脏从腹前壁分离，并继续向上方延长初始切口至膈肌。当切口到达膈肌时，使用精细解剖剪在膈肌上打一个小孔，沿小鼠右侧肋骨剪开，约至右侧腋窝的一半位置；随后在膈肌左侧做类似但更长的切口，几乎延伸至左侧腋窝。将胸壁翻折并用针固定于泡沫板上。确定左心室后，使用精细弯头镊子轻轻夹住心脏以保持稳定，随后打开主路止血钳，使 PBS 流经针头，并立即用针头穿刺左心室。确保针头插入心室的深度不超过 0.5 厘米。接下来，将蝶形导管放置在聚苯乙烯泡沫上由两根较大的 18 号针头交叉形成的 X 形支架上。辨认下腔静脉从肝脏穿出处，使用精细解剖剪将其剪断。继续用 PBS 灌注，直至从下腔静脉流出的液体无血液成分。随后迅速用止血钳夹闭 PBS 管路，打开 PFA 管路。让 PFA 灌注数分钟，直至小鼠尾部开始卷曲。一旦尾部开始卷曲，立即启动50分钟计时器。50分钟后，用止血钳夹闭主输液管，并将针头从左心室撤出。随后，将小鼠放入标记好的容器中，置于4摄氏度的PFA溶液中固定过夜。高质量灌注的标志是肝脏、脊髓和中枢神经系统深部结构中无血液残留。观察到的脑部血液位于颅骨与硬脑膜之间，因此并不影响灌注质量，也不提示灌注效果不佳。采用此灌注方法后检测α-突触核蛋白发现，与表达人源A53T突变型α-突触核蛋白的7月龄无症状小鼠相比，15.5月龄有症状小鼠中磷酸化α-突触核蛋白的累积量显著更高。该结果与已有报道一致，即这些小鼠脊髓前角和中脑区域存在细胞病理学改变的富集现象。在暴露胸腔时，应注意避免切割任何腹腔器官。此外，灌注针头插入左心室时不可过深。

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一种重力喂养的经心灌注方法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析

我们描述了一种小鼠经心脏灌注、脑组织的取出与切片，以及免疫过氧化物酶染色、树脂包埋和脑切片超薄切片的实验方案。完成这些步骤后，免疫染色的样品即可用于透射电子显微镜观察。...

小鼠脑组织免疫电子显微镜样品制备

来源：Schönherr, S., 等. 结合光遗传学与冰冻断裂复型免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布。 J. Vis. Exp.

小鼠脑组织冰冻断裂标本中神经元膜蛋白的免疫标记

通过从成年小鼠特定脑区分离神经元，并利用荧光膜电位染料成像技术，可研究成年小鼠单个神经元的活动。通过检测神经元对葡萄糖浓度变化的反应，该技术可用于研究成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对葡萄糖的敏感性。...

成年小鼠腹内侧下丘脑神经元膜电位染料成像用于研究葡萄糖感应

本文介绍了一种简单的方法，用于分离和流式细胞术分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞，该方法可获得随时间变化的定量数据，反映进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞数量及其活化状态。...

胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。...

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

透射电子显微镜与宫内转导相结合是一种研究神经系统发育过程中精细超微结构形态变化的有力方法。这种联合技术能够深入揭示神经可塑性相关结构细节的变化及其拓扑表征。...

子宫内转导发育期小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估

我们介绍一种流式细胞术方法，可同时鉴定从小鼠脑或脊髓中分离的不同细胞类型。该方法可用于在神经退行性疾病中分离或表征纯化的细胞群体，或用于定量评估在体内给予病毒载体或纳米颗粒后对细胞的靶向程度。...

通过不同匀浆方法从小鼠脑/脊髓中分离多种细胞类型的同步流式细胞术表征

本文描述了一种对小鼠下半身进行原位灌注的实验方案，包括膀胱、前列腺、性器官、骨骼、肌肉和足部皮肤。...

建立小鼠下腹部器官与后肢的原位闭路灌注技术

一种用于从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法

本方案描述了一种高效且可重复的小鼠脑组织学研究方法，包括灌注、脑切片、游离漂浮免疫染色、组织贴片和成像。...

小鼠脑组织的游离免疫染色

本研究描述了一种利用细胞核内流式细胞术对分离自脑组织的小胶质细胞进行全基因组组蛋白修饰定量的实验方案。本研究还包含了用于数据采集的小胶质细胞分离方案。...

利用核内流式细胞术定量分析分离的小鼠脑小胶质细胞中组蛋白全局翻译后修饰

学习一种简便的重力灌注方法，用于小鼠中枢神经系统组织学分析。该方案使用常见实验材料，可在帕金森病模型中实现磷酸化α-突触核蛋白的免疫荧光检测，为神经退行性疾病研究提供可靠的技术支持。

一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法

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