一种重力喂养的经心灌注方法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析

该协议提供了一种在小鼠中固定灌注的简单方法，无需大量投资即可进行CNS组织的组织学研究。这里介绍的重力灌注方法的主要优点是，可以使用易于获得的组件构建富足设备。演示该程序的将是来自Xin Jie Chen博士实验室的MD-PhD学生Arnav Rana。

首先，使用锋利的剃须刀片，将内部吸管从两个500毫升的洗涤瓶中修剪，方法是将它们切成与盖子上的螺钉内侧齐平。在每个缓冲瓶的底部切一个四乘四厘米的正方形孔，然后在每个瓶子的底部再切一个小孔，以允许弯曲的不锈钢微刮刀通过。接下来，在微型刮刀中创建一个S形弯曲，以便它们可以用作悬挂缓冲瓶的钩子。

将弯曲的微刮刀插入缓冲瓶中的适当开口中。接下来，将两根25厘米长的管子与外瓶吸管出口紧密连接，并将这些管的末端与Y形连接器连接在一起，然后将2米长的管子连接到Y形连接器的自由端。从1毫升注射器中取出柱塞后，首先用剃须刀刀片划伤塑料，然后急剧折断注射器塑料，将注射器切开距离尖端约6厘米。

将注射器的切割面插入塑料管的自由端，使其达到足够的深度，并确保紧密密封。接下来，将一个缓冲瓶标记为PFA，另一个标记为PBS。测量距离瓶子开口约1/3的长度，并在此时围绕瓶子周长画一条线，以表示灌注液溶液的适当填充水平。

拉直大回形针后，创建一个可以适合管子圆周的环，并将该环放在管子周围，刚好靠近注射器，然后在玻璃托盘中放置一个适当大小的聚苯乙烯泡沫块，将回形针的末端放入聚苯乙烯泡沫块中以固定管子并使用纸巾， 将玻璃托盘的前端抬高约 2 厘米。用蒸馏水冲洗1升烧杯后，用大约800毫升的18毫欧分子生物学级水填充。在微波炉中加热烧杯三分钟或直到水温达到65摄氏度，然后将其放在通风橱中的加热板或搅拌板上。

接下来，用蒸馏水冲洗搅拌棒并将其放入烧杯中。启动搅拌器并将热板调至中火，确保水温不超过70摄氏度。戴上外科口罩，手套和实验室外套后，测量40克PFA粉末并将其加入热水中，然后使用转移移液管，向溶液中加入几滴5摩尔氢氧化钠。

让粉末完全溶解。如果粉末尚未完全溶解，请根据需要添加更多的氢氧化钠。一旦所有PFA几乎溶解，停止搅拌和加热，立即加入100毫升10倍PBS，然后使用18毫欧分子生物学级水将烧杯加满至1升标记。

用保鲜膜盖住烧杯，将其放入零下20摄氏度的冰箱中，直到溶液达到室温。使用适当的标准校准pH计后，当烧杯在搅拌板上时测量溶液的pH值。加入盐酸直至pH值达到7.4。

如果pH值太低，加入5-摩尔氢氧化钠以增加pH值。接下来，将真空瓶连接到真空瓶，并在烧瓶中放置一个带有滤纸的清洁陶瓷Buchner漏斗。打开真空后，使用装有4%PFA溶液的转印移液管润湿滤纸，然后将溶液缓慢倒入滤纸上，直到所有溶液都被过滤。

过滤后，将溶液储存在4摄氏度的避光容器中直至使用。在通风橱中，将聚苯乙烯泡沫塑料解剖块放入玻璃托盘中。确保解剖块有五到六根短针在手术过程中抑制小鼠，两根长针支撑灌注管。

接下来，用蒸馏水冲洗灌注装置。沥干所有水后，将富足瓶悬挂在待灌注动物上方一米处，然后使用用分子生物学级水稀释的10x PBS制备非无菌的1x PBS。使用止血器钳夹灌注装置的主线，然后用另一个止血器钳夹PFA管线。

用PBS填充缓冲容器后，将灌注装置的注射器端放在烧杯中以收集废物缓冲液并除去阻塞主管路的止血剂。当PBS流过管线时，用力敲击管壁以除去滞留的空气。一旦所有空气都从缓冲液和主管线上除去，通过在主管线上放置止血器来阻塞流动。

接下来，从PFA管路中取出止血剂，允许PBS以逆行方式流向PFA瓶，同时敲出PFA管线中的任何气泡。继续允许PBS进入PFA管路，直到可以在瓶子开口的正上方看到它，然后用止血剂阻塞PFA管路以阻止PBS流入PFA瓶。接下来，将蝴蝶输液针头连接到灌注注射器上，打开主线止血器，将PBS冲洗通过管路并去除灌注注射器上的气泡。

去除气泡后，关闭主线止血剂。确保 PBS 瓶现在大约装满了 1/3 的 PBS。如有必要，通过主管线冲洗PBS或将更多PBS填充到缓冲瓶中，直到其全部容量的1/3。

一旦从PBS，PFA和主管道中去除了所有气泡，请在室温下用4%PFA溶液填充PFA瓶，直到瓶子上的黑色标记。接下来，通过先用水清洁必要的器械，然后用70%乙醇清洁必要的器械，为非生存手术做准备。将麻醉的C57黑色6J小鼠固定在聚苯乙烯泡沫块后，通过用皮钳抬起腹部皮肤并用大剪刀切穿腹壁开始手术。

继续腹部切口上部朝向肝脏，然后将肝脏从前腹壁上分离，并继续将初始切口上部朝向膈肌。当切口到达横膈膜时，使用细解剖剪刀在横膈膜上打一个洞，并在鼠标右侧的肋骨大约在右腋窝的一半处切开，然后通过隔膜的左侧几乎一直切到左腋窝。反射胸壁并将其固定在聚苯乙烯泡沫块上。

识别左心室后，使用细弯曲的镊子，用轻压保持心脏稳定，然后打开主线止血器，让PBS流过针头，并立即用针刺穿左心室。确保将针头插入心室不超过0.5厘米。接下来，将蝴蝶管放在用聚苯乙烯泡沫塑料制成的X上，用两个大的18号针。

识别下腔静脉，因为它离开肝脏，并使用精细解剖剪刀将其切除。继续PBS灌注，直到流出下腔静脉的液体无血，然后快速工作，用止血剂阻塞PBS管并打开PFA管。让PFA灌注几分钟，直到尾巴开始卷曲。

一旦尾巴开始卷曲，开始50分钟的计时器。50分钟后，用止血剂闭塞主线，并将针头从左心室取出。接下来，将小鼠置于4摄氏度的标记的PFA溶液容器中过夜。

高质量灌注表现为肝脏、脊髓和深部中枢神经系统结构中没有血液。在大脑中观察到的血液位于颅骨和硬脑膜之间，因此没有问题或提示低质量的灌注。在这种灌注方法下检测到的α-突触核蛋白表明，与表达人A53T α-突触核蛋白的7个月大无症状小鼠相比，磷酸化的α-突触核蛋白在15.5个月大的有症状小鼠中积累显着更高。

该结果与描述这些小鼠脊髓前角和中脑细胞病理学富集的报告一致。重要的是，在进入胸腔时不要切开腹部器官。此外，灌注针不得放置在左心室内太深的地方。