Name: 应用生物标志物发现在前列腺癌:个别赫尔维位点表达微阵列鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-02T17:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 了解如何使用定制高密度微阵列技术检测前列腺癌组织中人类内源性逆转录病毒（HERV）的特异性表达位点，从而发现新型生物标志物并改善诊断特异性。

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我们感谢 Cecile Montgiraud、Juliette Gimenez、Magali Jaillard 和 Bertrand Bonnaud 对 HERV-V2 方案的初步开发与优化所做出的贡献。我们还感谢 Hader Haidous 在伦理问题方面提供的指导。

1. 手术
一旦由外科医生切除，应将前列腺置于冰上保存，直至移交病理科医生处理。
2. 前列腺组织的处理
<ol>
	<li>为减少围手术期缺血的影响，应在手术切除后30分钟内由专人将根治性前列腺切除标本置于冰上并迅速转运至实验室。冷冻前的延迟时间应少于20-30分钟（图3A）。</li>
	<li>按照常规方案称重并标记前列腺（例如右侧标记为绿色，左侧标记为黑色，参见图3B和图3C）。</li>
	<li>在腺体后侧进行一次大的横向切面（图3D）。将前列腺定向后置于前侧，再用无菌手术刀在后侧进行一次大的横向切开。</li>
	<li>从左侧和右侧的外周带以及移行带分离组织块，注意保持切缘完整（图3E）。</li>
	<li>将组织核心放入Eppendorf管中，速冻后储存在液氮中（图3F）。若不进行生物样本库保存，则直接进入步骤2.7。</li>
	<li>仅当穿刺活检中肿瘤总长度超过10 mm时才进行前列腺组织库保存。使用缝合线闭合前列腺，以防止腺体变形并尽量减少对手术切缘的干扰（图3G）。随后按照常规程序用福尔马林固定根治性前列腺切除标本，并进行石蜡包埋以供组织学分析。</li>
	<li>将冷冻组织核心垂直固定于少量OCT包埋剂的小丘上，在冷冻切片机中进行切片。先切取一张5 µm的冷冻切片，用蓝色甲苯胺蓝染色。</li>
	<li>进行快速组织学检查以分析组织性质（即良性或恶性）。对于肿瘤组织，评估肿瘤细胞所占比例，仅选择肿瘤细胞比例超过80%的组织核心。</li>
	<li>随后再切取一张5 µm的冷冻切片，使用苏木精、伊红和沙黄（Safran）染色。然后连续切取15张30 µm厚的切片，放入无RNA酶的Eppendorf管中。</li>
	<li>最后再取一张5 µm的冷冻切片，用苏木精、伊红和沙黄染色，以在操作结束时确认肿瘤细胞的比例。</li>
	<li>将Eppendorf管置于干冰中，随后将样本送至分子生物学实验室。</li>
</ol>
3. RNA 提取、纯化与质量控制
<ol>
	<li>匀浆化。在每100 mg组织中加入1 ml&#160;Trizol进行匀浆，直至组织完全溶解于溶液中。逐步加入Trizol溶液，并在冰上使用手持式研磨器小心操作。匀浆完成后，将溶液分装至离心管中，在室温下静置5分钟。</li>
	<li>相分离。加入300 µl&#160;氯仿（或每1.5 ml&#160;Trizol加入150 µl&#160;BCP）。涡旋振荡15秒&#160;，然后在室温下静置2–3分钟。在2–8 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。</li>
	<li>RNA沉淀。小心转移上层水相至新管中。加入750 µl&#160;异丙醇。室温孵育10分钟（通过反复倒置混匀），随后在-19 °C至-31 °C下孵育2小时。在2–8 °C条件下以12,000 × g离心30分钟。</li>
	<li>RNA洗涤与重悬。离心后弃去上清液。用1 ml&#160;80%乙醇洗涤RNA沉淀（轻轻倒置混匀）。在2–8 °C条件下以7,500 × g离心10分钟。使用P1000和P10移液器吸除上清液。让残留乙醇在空气中干燥2–3分钟。加入100 µl&#160;无RNase水，将离心管置于70 °C金属浴中静置2–3分钟以溶解沉淀，随后置于冰上。短期储存于-19 °C至-31 °C，长期储存则置于-80 °C。</li>
	<li>RNA纯化。使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）进行RNA纯化。简要步骤如下：向100 µl&#160;RNA样品中加入350 µl RLT缓冲液并充分混匀，随后按照Qiagen操作说明进行。最后，取纯化产物中的3 µl&#160;（总量50 µl）用于质量控制（步骤3.6）。短期储存于-19 °C至-31 °C，长期储存则置于-80 °C。</li>
	<li>RNA质量控制（图4A）。根据制造商说明书，使用Bioanalyzer（Agilent）和Nanodrop（Thermo）检测RNA质量和完整性。采用RNA完整性数（RIN）评估RNA质量。特别建议在后续实验中使用能清晰检测到18S和28S峰的样品。</li>
</ol>
4. WT-ovation RNA 扩增
使用WT-Ovation扩增试剂盒进行扩增步骤时，建议在以下最佳条件下操作：
<ul>
	<li>每次运行不少于八个扩增样本，以确保移液精度。当准备需要将试剂盒分为三批、每批八个反应的主混合液时，应额外计入一个废液体积。</li>
	<li>除非另有说明，解冻后的试剂和反应管必须始终置于冰上。</li>
	<li>纯化步骤中仅可使用新鲜配制的80%乙醇溶液。</li>
	<li>在实验方案的任何阶段均不得中途停止。</li>
</ul>

<ol>
	<li>将总RNA稀释至浓度为25 ng/µl，取2 µl稀释后的样品进行后续操作。</li>
	<li>通过将Poly-A RNA原液用Poly-A对照稀释缓冲液（Affymetrix）进行系列稀释，配制Poly-A RNA spike-in对照溶液，最终实现1:25,000的稀释比例。 第一步：第一链cDNA合成（步骤4.3–4.8）。供应商对所提及试剂的编号如下：A1（第一链引物混合液）、A2（第一链缓冲液混合液）、A3（第一链酶混合液）。 
	</li>
	<li>将A1和A2在室温下解冻，使用涡旋混合器混匀2秒&#160;，离心2秒，随后迅速置于冰上。将A3置于冰上预冷。</li>
	<li>取2 µl总RNA（50 ng）加入0.2 ml PCR管中，再加入2 µl A1（终体积：4 µl）。盖紧管盖，离心2秒。</li>
	<li>于65 °C孵育5分钟&#160;，然后将PCR管置于冰上冷却。</li>
	<li>按下表配制第一链cDNA主混合液（以单个反应计）。使用移液器吹打混匀，短暂离心，立即置于冰上。
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<th>试剂</th>
					<th>体积</th>
				</tr>
				<tr>
					<td>第一链缓冲液混合液（A2）</td>
					<td>5 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Poly-A RNA对照（1:25,000）</td>
					<td>0.5 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>第一链酶混合液（A3）</td>
					<td>0.5 µl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
	</li>
	<li>向含RNA/引物的PCR管中加入6 µl主混合液。轻弹管壁混匀，离心2秒&#160;，迅速置于冰上（终体积：10 µl）。</li>
	<li>依次在4 °C孵育1分钟、25 °C孵育10分钟、42 °C孵育10分钟&#160;，然后在70 °C孵育15分钟。孵育结束后于4 °C冷却。从热循环仪中取出反应管，短暂离心后置于冰上。立即进入第二链cDNA合成步骤。 第二步：第二链cDNA合成（步骤4.8–4.12）。供应商对所提及试剂的编号如下：B1（第二链缓冲液混合液）和B2（第二链酶混合液）。 
	</li>
	<li>将B2和B3离心2秒&#160;，迅速置于冰上。B1于室温解冻，使用涡旋混合器混匀2秒，离心2秒&#160;，迅速置于冰上。</li>
	<li>按下表配制第二链主混合液（以单个反应计）。使用移液器吹打混匀，短暂离心，立即置于冰上。
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<th>试剂</th>
					<th>体积</th>
				</tr>
				<tr>
					<td>第二链缓冲液混合液（B1）</td>
					<td>9.75 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>第二链酶混合液（B2）</td>
					<td>0.25 µl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
	</li>
	<li>向每个第一链反应管中加入10 µl主混合液。吹打混匀3次，离心2秒&#160;，置于冰上（终体积：20 µl）。</li>
	<li>依次在4 °C孵育1分钟、25 °C孵育10分钟、50 °C孵育30分钟，然后在70 °C孵育5分钟。孵育结束后于4 °C冷却。从热循环仪中取出反应管，短暂离心后置于冰上。立即进入第二链合成后增强步骤。 第三步：第二链合成后增强（步骤4.13–4.15）。供应商对所提及试剂的编号如下：B1（第二链缓冲液混合液）、B3（反应增强酶混合液）。 
	</li>
	<li>按下表将B1与B3混合配制主混合液（以单个反应计）。使用移液器吹打混匀，短暂离心，立即置于冰上。
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<th>试剂</th>
					<th>体积</th>
				</tr>
				<tr>
					<td>第二链缓冲液混合液（B1）</td>
					<td>1.9 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>反应增强酶混合液（B3）</td>
					<td>0.1 µl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
	</li>
	<li>向每个第二链反应管中加入2 µl主混合液。吹打混匀3次，离心2秒&#160;，置于冰上（终体积：22 µl）。</li>
	<li>依次在4 °C孵育1分钟、37 °C孵育15分钟，然后在80 °C孵育20分钟。孵育结束后于4 °C冷却。从热循环仪中取出反应管，短暂离心后置于冰上。立即进入SPIA扩增步骤。 第四步：通过SPIA程序合成单链cDNA（sscDNA）（步骤4.16–4.19）。供应商对所提及试剂的编号如下：C1（SPIA引物混合液）、C2（SPIA缓冲液混合液）、C3（SPIA酶混合液）。 
	</li>
	<li>将C1和C2于室温解冻，使用涡旋混合器混匀，离心2秒&#160;，迅速置于冰上。C3在冰上解冻，轻轻翻转混匀5次，注意避免产生气泡。混匀后离心2秒&#160;，置于冰上。</li>
	<li>按下表配制SPIA主混合液（需额外预留0.5的损耗体积）。使用移液器吹打混匀，短暂离心，立即置于冰上。
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<th>试剂</th>
					<th>体积</th>
				</tr>
				<tr>
					<td>SPIA缓冲液混合液（C2）</td>
					<td>5 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>SPIA引物混合液（C1）</td>
					<td>5 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>SPIA酶混合液（C3）</td>
					<td>10 µl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
	</li>
	<li>向增强后的第二链反应管中加入20 µl SPIA主混合液。吹打混匀6–8次，离心后迅速置于冰上（终体积：42 µl）。</li>
	<li>依次在4 °C孵育1分钟、47 °C孵育60分钟&#160;，然后在95 °C孵育5分钟。孵育结束后于4 °C冷却。从热循环仪中取出PCR管，短暂离心后置于冰上。</li>
</ol>
5. sscDNA 纯化与质量控制
<ol>
	<li>sscDNA 纯化。使用 QIAquik PCR 纯化试剂盒（Qiagen）纯化 sscDNA。简而言之，首先将 200 µl PB 缓冲液加入 42 µl&#160;扩增后的 cDNA 产物中，混匀后上柱。随后按照 Qiagen 的操作流程进行。最后，取 30 µl 纯化后 sscDNA 产物中的 3 µl&#160;用于质量控制（步骤 5.2）。</li>
	<li>sscDNA 产量及片段长度分布验证（图 4B）。根据制造商说明书，使用 Bioanalyzer 和 Nanodrop 检测 sscDNA 的产量和片段长度分布。扩增后 cDNA 的片段长度通常分布在 100 至 1,500 个碱基之间，主峰约在 600 个碱基左右。</li>
</ol>
6. sscDNA 片段化
<ol>
	<li>将2 µg cDNA用无核酸酶水调整至30 µl。</li>
	<li>使用10倍浓缩的One-Phor-All Buffer PLUS溶液配制1倍One-Phor-All Buffer PLUS（OPA）溶液。</li>
	<li>将1 U/µl DNase I稀释5倍，配制成0.2 U/µl的DNase I溶液。</li>
	<li>按以下组分配制片段化主混合液（以单个反应为例）：
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<th>试剂</th>
					<th>体积</th>
				</tr>
				<tr>
					<td>10X One-Phor-All Buffer PLUS</td>
					<td>3.6 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>DNase I (0.2 U/µl)</td>
					<td>3 µl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
	</li>
	<li>向30 µl sscDNA中加入6.6 µl片段化混合液。</li>
	<li>短暂离心后，于37 °C孵育10分钟，随后在95 °C灭活DNase I 10分钟&#160;，然后立即置于冰上。取1 µl片段化cDNA用于基于Agilent的片段大小分布验证。</li>
	<li>sscDNA片段大小分布验证（图4C）。使用Bioanalyzer（Agilent）检测sscDNA的片段大小分布，片段化cDNA的大小分布通常应在35至200个碱基之间。</li>
</ol>
7. 片段化 sscDNA 的标记
<ol>
	<li>用DEPC水将DLR-1a从7.5 mM稀释至5 mM。</li>
	<li>按下表配制标记主混合液（以单个反应为例）：
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<th>试剂</th>
					<th>体积</th>
				</tr>
				<tr>
					<td>5x TdT反应缓冲液</td>
					<td>14 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>CoCl2 (25 mM)</td>
					<td>14 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>DLR-1a (5 mM)</td>
					<td>1 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>末端脱氧核苷酸转移酶 (400 U/µl)</td>
					<td>4.4 µl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
	</li>
	<li>向每份片段化的cDNA样品中加入33.4 µl标记混合液。</li>
	<li>轻弹管壁混匀，短暂离心后于37 °C孵育60分钟，随后置于冰上保存。</li>
</ol>
8. 与HERV芯片微阵列的杂交
<ol>
	<li>用 200 µl 预杂交液（Affymetrix）预润湿 HERV GeneChip，于 50 °C、60 rpm 条件下孵育 10 分钟。</li>
	<li>按以下配方制备杂交液（以单次反应计）：
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<th>试剂</th>
					<th>体积</th>
				</tr>
				<tr>
					<td>对照寡核苷酸 B2（3 nM）</td>
					<td>3.3 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20 倍真核杂交对照</td>
					<td>10 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>2 倍杂交液</td>
					<td>100 µl</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>99.9% DMSO</td>
					<td>17.7 µl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
	</li>
	<li>在室温下，将 131 µl 杂交液加入 69 µl 已片段化并标记的 cDNA 中，终体积为 200 µl。</li>
	<li>混匀后于 95 °C 变性 2 分钟&#160;，然后在 50 °C 孵育 5 分钟&#160;，再以最大转速离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去预润湿的 HERV GeneChip 中的液体，加入 200 µl 目标样品溶液。在两个隔膜上贴上防漏贴片。</li>
	<li>于 50 °C、60 rpm 条件下杂交 18 小时。</li>
	<li>杂交 18 小时后，弃去 HERV GeneChip 中的溶液，将收集的杂交液于 4 °C 保存。向探针阵列中加入 250 µl 洗涤缓冲液 A。若芯片未立即进行流体工作站处理，则于 4 °C 保存。</li>
</ol>
9. 清洗与染色
<ol>
	<li>从 GCOS 菜单栏运行流体系统。在流体系统对话框中，选择目标工作站（1 - 4），然后为所有模块选择 Shutdown_450 程序并运行。将 3 根流体系统吸液管浸入 Milli-Q 水中。按照液晶显示屏上的说明操作。</li>
	<li>对所有模块应用 Prime_450 程序。将 Wash Buffer A 的管路放入装有 400 ml Wash Buffer A 的瓶子中，将 Wash Buffer B 的管路放入装有 200 ml Wash Buffer B 的瓶子中。然后继续按照液晶显示屏上的说明操作。</li>
	<li>抬起针头，在位置 #1 和 #2 分别放置含有 600 µl 染色混合液 1（SAPE 溶液混合液）和 600 µl 染色混合液 2（抗体溶液混合液）的微量离心管，在位置 #3 放置含有 800 µl 芯片保存缓冲液的微量离心管。</li>
	<li>为每个模块分配正确的芯片，选择 FS450-004 协议，并根据屏幕上的提示运行每个模块。</li>
</ol>
10. 扫描
<ol>
	<li>启动 GS3000 扫描仪。当指示灯变为绿色时，表示扫描仪已准备就绪，可以开始扫描。</li>
	<li>在隔垫上贴上加固贴片以防止泄漏，然后将芯片装入自动进样器，或直接放入扫描仪中。开始扫描。</li>
	<li>扫描芯片后，将生成 .cel 文件。检查图像，并调整网格与斑点对齐，以识别探针单元（图 4D-F）。</li>
</ol>
11. 数据分析
<ol>
	<li>质量控制。参考标准 Affymetrix 质控指标，验证 HERV-V2 芯片是否符合质控标准。为此可使用以下图示：对数强度值分布图（密度图和箱线图）、中位绝对偏差（MAD）与强度中位数（MAD-Med）关系图、背景信号图、归一化未缩放标准误差（NUSE）图以及相对对数表达量（RLE）图。</li>
	<li>归一化。此外，应探索数据集以识别潜在的批次效应，并在统计分析前进行校正。数据预处理包括背景校正（例如基于色氨酸探针基线信号），随后进行 RMA 归一化与汇总15。</li>
	<li>数据挖掘与差异表达基因筛选。对芯片数据进行归一化处理，并采用层次聚类方法分析数据集（图6A）。随后，使用经典的微阵列显著性分析（SAM）方法16检测差异表达基因（DEG），并进行错误发现率（FDR）校正17。需注意，这些步骤已完全集成于某些软件分析套件（如 Partek GS），也可使用 R 统计软件18结合 Bioconductor 项目中的相关软件包实现19。统计分析后，过滤数据集，排除表达值低于 26 的探针组。</li>
	<li>可视化与结果解读。在专用界面中结合注释数据库，对 HERV-V2 微阵列的结果进行可视化与生物学解读。</li>
</ol>

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本工作由生物梅里埃股份有限公司（bioMérieux SA）、里昂中心医院（Hospices Civils de Lyon）以及法国公共机构OSEO（先进诊断用于新治疗策略，法国政府资助的个性化医疗项目）提供支持。PP、VC、GO、NM和FM为生物梅里埃股份有限公司的员工。PP、NM和FM已就本文所述研究成果提交了专利申请。

在过去的10年中，大多数针对HERV表达量检测的研究尝试均采用RT-PCR技术，以特异性地检测某一特定基因座20-24 或基于该序列相对保守性 pol 基因以评估HERV属内的总体趋势25,26此外，使用高度简并引物结合低密度微阵列进行PCR扩增，旨在检测并定量HERV家族的表达水平27,28为了追踪单个位点在家族中的表达，基于保守区域的PCR扩增并结合后续克隆与测序的方法，能够鉴定出具有转录活性的HML-2不同元件29,30 或 HERV-E4.131 识别家族。基因组重复表达监测技术同样以克隆和测序步骤结束，旨在从已识别的重复序列中鉴定出具有活性的HML-2特异性人类孤立LTR启动子32,33我们相继开发了两代用于HERV转录组分析的高密度微阵列，引入了适用于重复元件探针设计的方法学，以最大限度减少同一家族内旁系同源元件之间的交叉反应34,35HERV-V2 芯片针对 HERV-W、HERV-H、HERV-E 4.1、HERV-FRD、HERV-K HML-2 和 HERV-K HML-5 家族的 2,690 个独特前病毒和 2,883 个单独的 LTR 序列，揭示了 1,718 个 HERV 位点的表达 （图7A 和 B) 在多种组织中35，本文通过鉴定潜在的前列腺癌生物标志物对此进行了说明。此外，利用特定基因座上的多个探针组可提供有关其转录调控的信息。首先，U3区呈阴性信号而U5区呈阳性信号，表明该长末端重复序列（LTR）具有启动子功能；相反，U3区阳性而U5区阴性则可能提示其参与多聚腺苷酸化作用。基于芯片提供的U3-U5二分信号，我们鉴定了326个在多种组织中广泛存在的启动子型LTR，并据此提出假设，且针对部分选定案例进行了实验验证，证实此类自主转录受到甲基化依赖的表观遗传机制调控。34 (图8）。其次，检测来自 例如 长末端重复序列， gag 和 环境 独立的探针组或靶向特定剪接位点的探针所产生的数据可揭示前病毒的剪接策略，这一点可通过ERVWE1/Syncytin1在胎盘或肿瘤性睾丸中的表达谱得到例证34这表明，HERV特异性探针筛选流程具有足够的稳健性，能够像常规基因一样高效地支持组织相关剪接策略的鉴定。36 (图8).
该方法首次尝试利用基于Affymetrix技术的定制高密度微阵列来鉴定单个内源性逆转录病毒（HERV）位点的表达。微阵列技术在解析HERV转录组方面具有明显优势，包括：（i）可协调地检测多个HERV家族；（ii）能够对每个位点的不同区域进行同步且独立的分析。 例如U3和U5区段用于单独及前病毒LTR， gag 或 环境 与前病毒结构相关的区域及可能的剪接位点，无需任何 先验的 关于HERV元件功能的研究前景依赖于微阵列相关生物计算工具注释功能的改进。这将有助于将芯片信号转化为生物学假设，例如，已发现的活跃HERV是否驱动长链非编码RNA（lncRNA）的转录，或是否调控邻近编码基因的表达水平。事实上，近期研究已为这一假设提供了支持，这些研究鉴定出与前列腺癌相关的非编码RNA转录本，其中包含来自HERV-K内源性逆转录病毒家族的病毒ORF组分或病毒LTR启动子区域的片段。37，以及两个基因融合事件，即 HERV-K22q11-ETV1 和 HERV-K17-ETV38,39综上所述，这种结合了LTR功能与剪接策略鉴定的全转录组方法，可能有助于解析内源性人类逆转录病毒（HERV）表达在慢性疾病中作为标志物与触发因素的组分。40,41 传染病42,43.

人类内源性逆转录病毒（也称为 HERVs）广泛分布于我们的基因组中。它们起源于祖先种系中的祖先感染事件，随后通过“复制-粘贴”机制进行扩增，形成多拷贝家族。如今，这些病毒已不再具有感染性，但它们占据了人类基因组的 8%；作为对比，外显子仅占人类基因组的 2%。2012 年发表的 ENCODE 项目数据显示，各类 RNA 覆盖了约 62% 的基因组，其中三分之一位于基因间区域。此外，转录调控元件的数量至少是编码蛋白质的外显子所对应数量的 4.5 倍。HERV 的长末端重复序列（LTR）具有多种潜在的转录调控功能，这与其在感染性逆转录病毒中的典型功能一致。历史上，除少数在胎盘或睾丸中表达的位点外，人们普遍认为 HERV 因表观遗传调控而处于沉默状态。因此，我们设计了一款高密度微阵列（采用 Affymetrix 格式），旨在对单个 HERV 位点的表达进行最优表征，以更深入地理解它们是否具有活性，是否驱动长链非编码 RNA（lncRNA）的转录，或是否调控编码基因的表达。这款被称为 HERV-V2 GeneChip 的工具整合了 23,583 个 HERV 探针组，能够区分由单独 LTR、完整前病毒及部分前病毒组成的 5,573 个不同的 HERV 元件（图 2）。
诊断、评估与计划：
前列腺癌的诊断基于临床实验室中前列腺特异性抗原（PSA）生物标志物的检测水平、通过直肠指检评估前列腺形态学改变，以及最终由病理学家观察前列腺活检样本。数十年的临床实践已广泛认识到，传统癌症生物标志物（如用于前列腺癌的PSA）在特异性和敏感性方面均存在不足1。最初，PSA被提出用于前列腺腺癌的诊断与治疗11；随后又被建议用于癌症筛查及监测疾病进展12。然而，一个经常被提出的问题仍然存在：“如何正确使用PSA？”（i）血清PSA浓度在2.5–10 ng/ml之间的“灰区”无法明确区分癌症与非癌症状态2；（ii）在欧洲和美国开展的两项大规模队列研究，纳入了数十万人，但均未能就筛查对降低疾病特异性死亡率的有效性得出明确结论13,14；（iii）尽管术后PSA动力学参数（如PSA清除率、PSA速度和倍增时间）在理论上较为简单，但在实际应用中可能面临显著挑战3,4。我们可预期，在未来几年内，生物标志物的应用将有助于临床决策，根据肿瘤表型在主动监测与不同程度的积极治疗之间做出选择。关于病理学家所作出的诊断，其首要局限性在于前列腺活检中存在约20%的假阴性率（许多癌症因取样误差而被遗漏）；第二个问题是，在初次活检结果为阴性后，可能需要进行重复活检，而该操作可能带来不良影响。
根治性前列腺切除术目前是前列腺癌的标准治疗方法之一。该手术适用于年龄在45至65岁之间的健康患者，尤其适用于具有侵袭性病理特征（Gleason评分7至10分）、多灶性肿瘤或可触及肿瘤的情况。目前，本院已采用机器人辅助手术方式进行该术式。鉴于越来越多的证据表明分子标志物在未来几年将具有极其重要的意义，我们决定向所有患者提供参与前列腺组织库项目的可能性。更具体地说，不断扩展的前列腺癌分子研究项目导致对高质量的新鲜前列腺切除标本肿瘤组织的需求日益增加。此类研究，特别是基因组学研究，需要大量具有高DNA/RNA质量的样本。需要来自同一患者的肿瘤组织及邻近的“非肿瘤”组织。根治性前列腺切除标本的处理与加工建议旨在保留决定肿瘤分期和切缘状态的病理学特征，从而影响后续治疗决策和预后判断。因此，任何新鲜组织取材方法均不得影响后续的病理学评估，方能被临床诊断所接受。前列腺的大体解剖较为困难，必须特别注意切缘组织和包膜侵犯情况：所有用于组织库保存的解剖操作均应由经过培训的泌尿病理医师根据事先商定的协议进行。医学院伦理委员会及州医学委员会已批准本项研究，所有纳入前列腺组织库的患者均签署了知情同意书。

<table><tbody><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNA poly-A 对照品原液</td><td>Affymetrix</td><td>900433</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶1</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>1,000 U（1 U/&amp;micro;l)</td></tr><tr><td>末端转移酶</td><td>罗氏</td><td>3333574001</td><td>400 U，包括酶和辅酶（CoCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;).</td></tr><tr><td>DLR-1a</td><td>Affymetrix</td><td>900542</td><td></td></tr><tr><td>杂交内参对照 B2 和 20x 真核杂交对照</td><td>Affymetrix</td><td>900454</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 杂交、洗涤与染色</td><td>Affymetrix</td><td>900720</td><td>包含预杂交混合液和2倍杂交混合液，适用于30个反应</td></tr><tr><td>10x One-Phor-All Buffer PLUS</td><td></td><td></td><td>DEPC 处理水中成分：100 mM Tris-乙酸盐，pH 7.5；100 mM 乙酸镁；500 mM 乙酸钾。</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNA纯化实验方案</td></tr><tr><td>WT-Ovation RNA扩增系统</td><td>Nugen</td><td>2210-24</td><td></td></tr><tr><td>QIAquik PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>材料名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>评论</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Scanner 3000 7G</td><td>Affymetrix</td><td>GS30007G</td><td>可选：自动进样器</td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450</td><td>Affymetrix</td><td>FS450</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 杂交 640 烤箱</td><td>Affymetrix</td><td>640</td><td>包含 4 个 GeneChip 探针阵列载体</td></tr><tr><td>配备 GeneChip 操作软件（GCOS）的工作站，包括 GeneChip Scanner 3000 高分辨率扫描补丁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERV-V2芯片</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>定制芯片阵列&lt;br/&gt; 如需获取微阵列（仅限研究使用）的相关信息，请联系：&lt;br/&gt; Fran&amp;ccedil;ois Mallet&lt;br/&gt; 里昂市立医院-生物梅里埃联合研究实验室&amp;eacute;rieux&lt;br/&gt; 医学诊断发现部&lt;br/&gt; 里昂南医院中心，B&amp;acirc;timent 3F&lt;br/&gt; 69495，Pierre B&amp;eacute;法国南特 Cedex&lt;br/&gt; 电话：33 (0)4 72 67 87 85&lt;br/&gt; 电子邮件：francois.mallet@biomerieux.com</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;HERV-V2 设计构思&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;em&gt;专用数据库与注释&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 已通过以下步骤构建了一个专用数据库，该数据库整合了属于6个内源性逆转录病毒（HERV）家族的基因组HERV序列：（i）从文献中选取每个HERV家族最完整且具代表性的序列，并将其定义为原型序列（&lt;strong&gt;图2&lt;/strong&gt;）。(ii) 参照长末端重复序列（U3/R/U5）和内部区域（gag/pol/env），对6个原型进行了功能注释。(iii) RepeatMasker &lt;sup&gt;44&lt;/sup&gt; 随后将这些功能序列作为输入文库进行应用。基于至少80%的同源性标准（NCBI 36/hg18），在人类基因组范围内对所有相关序列进行了全基因组搜索。（iv）最后，根据基因组位置将该过程获得的功能序列整合为不同的基因座，并最终构建至一个专门的HERV数据库中。该数据库名为HERV-gDB3，包含10,035个独立的HERV基因座&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;em&gt;位点特异性探针设计&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; 从 HERV-gDB3 出发，首先生成长度为 25-mer 的候选探针重叠序列。随后，使用 KASH 45 将每个候选探针与人类基因组进行比对，以评估其交叉杂交潜力。该评估由专为此目的开发的 EDA+ 模型完成。简而言之，EDA+ 的原理是考虑错配和缺口在 25-mer 目标序列/探针杂交复合物中引起的不稳定性。筛选出具有低交叉杂交风险的候选探针（&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;选择非特异性基因组靶标数量较少的探针，并最终组装成探针组。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;em&gt;定制 HERV GeneChip 芯片微阵列&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; 定制的 HERV GeneChip 芯片整合了 23,583 个 HERV 探针组，可区分 5,573 个不同的 HERV 元件，这些元件包括单独的 LTR、完整的前病毒和部分前病毒&lt;strong&gt;图2&lt;/strong&gt;微阵列中还包含了Affymetrix标准对照探针，用于无偏扩增和杂交。</td></tr></tbody></table>

基于微阵列的单个内源性逆转录病毒位点表达鉴定：在前列腺癌生物标志物发现中的应用

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

前列腺特异性抗原（PSA）是临床应用中前列腺癌的主要诊断生物标志物，但其特异性和敏感性不足，尤其是在低浓度水平时。1“如何使用PSA”目前仍是一个有争议的问题，尤其是在诊断方面，存在一个灰色区间，即血清PSA浓度在2.5–10 ng/ml之间，此范围内难以明确区分癌症与非癌症情况。2 或用于患者随访，因为术后PSA动力学参数的分析在实际应用中可能带来较大挑战3,4. 或者，非编码RNA（ncRNAs）正逐渐成为人类癌症中的关键分子，有望作为疾病的新标志物， 例如 PCA3在前列腺癌中的应用5,6 并揭示肿瘤生物学中尚未表征的方面。此外，2012年发表的ENCODE项目数据显示，不同类型的RNA覆盖了约62%的人类基因组。转录调控基序的数量似乎至少是蛋白编码外显子对应数量的4.5倍。因此，人类内源性逆转录病毒（HERVs）的长末端重复序列（LTRs）构成了大量潜在的/候选的转录调控序列，因为这是它们在感染性逆转录病毒中的主要功能。HERVs广泛分布于人类基因组中，起源于生殖系中的祖先性且独立的感染事件，随后通过“复制-粘贴”机制扩增，形成多拷贝家族，占据人类基因组的8%（需注意，外显子仅占我们基因组的2%）。某些HERV位点仍可表达蛋白，这些蛋白已被关联到包括癌症在内的多种病理状态。7-10我们设计了一款高密度微阵列（Affymetrix 格式），旨在对单个 HERV 位点的表达进行最优表征，以更好地理解这些位点是否具有活性，是否驱动非编码 RNA 转录或调控编码基因的表达。该工具已应用于前列腺癌研究领域。图1).

转录组学研究的价值主要取决于起始生物材料的质量。若在最佳条件下进行RNA提取，RNA完整性数值（RIN）通常为7或更高（图4A）。由于Affymetrix HERV-V2芯片需要杂交2 µg的cDNA，因此必须采用扩增步骤。成功的扩增应产生钟形分布曲线（图4B）。随后进行DNA酶I片段化处理，使cDNA片段大小在杂交前均匀分布在约100个核苷酸左右（图4C）。杂交与扫描完成后（图4D），通过图像的目视检查可判断网格是否与信号点良好对齐（图4E），以及杂交对照信号是否一致（图4F）。该步骤还有助于排除实验过程中出现气泡或操作错误的微阵列芯片。
在芯片通过质控（图5）并完成标准化后，对来自里昂-南医院的5对匹配的肿瘤与正常前列腺RNA样本进行统计分析，共鉴定出207个差异表达的HERV探针集（p值 &lt;0.05）（图6A）。为验证这些结果并获得前列腺特异性信息，研究进一步纳入了35对其他组织的匹配样本（包括结肠、卵巢、睾丸、乳腺、肺和前列腺）进行分析，最终通过SAM-FDR方法（FDR = 20%）鉴定出44个前列腺特异性的HERV探针集。其中，最具代表性的10个HERV结构被详细描述（图6B）。未来还需开展进一步的临床研究，以评估这些候选生物标志物的敏感性和特异性。 
<img alt="RNA提取与分析工作流程；WT-Ovation RNA扩增；HERV位点热图；SAM-FDR分析。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 从临床到实验室的整体流程示意图（1：临床医生进行前列腺切除术，病理学家进行组织制备）至实验操作阶段（2-6：样本制备、靶标制备、微阵列处理），最终实现候选生物标志物的鉴定（7：HERV微阵列的生物信息学分析）。来自正常组织的核酸以橙色表示；来自肿瘤区域的核酸则由正常成分（橙色）和肿瘤特异性成分（黑色）混合组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="HERV 鉴定流程图、基因组分析、数据库构建、探针筛选方法。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. HERV-V2 芯片的设计理念与内容：从人类基因组中获取的 HERV 序列被存储在一个名为 HERV-gDB3 的数据库中，随后 25-mer 候选探针需经过专门的杂交建模流程（EDA+）筛选，最终在芯片上合成（图中展示了每个家族对应的靶向亚区域）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像</a>。
<img alt="组织保存阶段；图A-G，使用手术刀、注射器的活检；医学研究研究。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 病理学家对前列腺的处理。 （A）新鲜的根治性前列腺切除标本被转移至实验室。（B-C）前列腺被染色（右侧为绿色，左侧为黑色）。（D）在腺体后侧进行大范围的横向切面。（E）在保留切缘完整的前提下，从前列腺的不同区域分离出组织块。（F）将组织芯放入Eppendorf管中。（G）使用缝合线闭合前列腺，以防止腺体变形并对手术切缘造成最小程度的干扰。随后，根治性前列腺切除标本即可按照常规程序用福尔马林固定，用于组织学分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig3highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="DNA片段化分析；电泳图谱、散点图；微阵列杂交研究。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 核酸制备质量控制与杂交效率评估。（A）RNA完整性，（B）扩增后的cDNA靶标，以及（C）杂交阶段所用的片段化靶标。上述三项质量控制通过Bioanalyzer仪器结合RNA nano芯片及真核生物Nano II系列检测试剂盒完成。（D）HERV-V2微阵列杂交区域扫描后的整体图像，（E）左上角区域放大图，显示网格对齐质控点，（F）中心区域放大图，显示点样杂交质控点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="显示质控指标和频率分布的基因表达分析图。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 信号处理。（A）Affymetrix polyA 加入型扩增对照。将来自 B. subtilis 基因的 polyA 对照 Dap、Thr、Phe 和 Lys 转录本加入RNA样本中，用于评估靶标制备步骤的整体成功率。这些加入型对照的信号强度应呈现递减趋势，以确保在 WT-Ovation 扩增过程中，高表达与低表达基因之间无偏倚。（B）Affymetrix 加入型杂交对照。这些来自 E. coli 和 P1 噬菌体的目标物在标记前被加入。BioB、BioC、BioD 和 Cre 的信号值依次升高，表明杂交过程整体成功。（C）RMA 标准化后芯片信号的强度分布。大多数探针组的信号值低于 26（背景水平），表明整体表达主要局限于某些特定的 HERV 位点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig5highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="HERV 表达热图及前 10 个前病毒结构的表格；基因差异表达分析。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig6.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图 6. 数据分析。（A）正常样本与肿瘤样本的层次聚类分析。采用欧氏距离函数算法对标准化表达值进行划分聚类，将探针集在正常与肿瘤样本间分为上调（红色）和下调（蓝色）两组。（B）筛选出的 10 个最有可能作为前列腺癌候选生物标志物的 HERV 结构。针对每个 HERV 元件，列出了其所属 HERV 家族、基因组坐标（NCBI 36/hg18）以及对该 HERV 结构的简要描述。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig6highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="基因组DNA组成饼图；非编码、转录部分百分比；遗传分析结果。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig7.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 内源性逆转录病毒（HERV）的组成谱系。 （A）人类基因组测序结果显示，共有25,000个编码蛋白质的基因（外显子，占2%），以及大量可移动遗传元件，其中包括约200,000个长末端重复序列（LTR）逆转座子（HERV，占8%）。（B）基于HERV-V2芯片内容及其相关表达数据（来自8种正常与肿瘤组织类型的79个样本）的推断表明，约三分之一的HERV组成成分具有转录活性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig7highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img alt="ERVWE1 locus diagram; epigenetic control, splicing strategy; Affymetrix probes; testis analysis." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig8.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
图8. 芯片信号的功能解读. (A启动子鉴定与表观遗传调控：U3阴性信号（红色探针，5'LTR） 与 R-U5阳性信号（蓝色探针，5'LTR）提示由U3驱动的转录，这得到肿瘤周围正常组织中U3区域不同CpG甲基化（实心黑色圆圈）水平的支持 与 肿瘤组织。B剪接策略：使用覆盖SD1/SA2剪接位点的探针鉴定在肿瘤中特异性表达的、推测为3.1 kb的包膜编码mRNA。*通过与其他非胎盘组织比较推断得出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig8highres.jpg" target="_blank">单击此处以查看大图</a>.

人类内源性逆转录病毒（HERV）占据了人类基因组的8%，虽然其编码能力极为有限，但却含有约十万个长末端重复序列（LTRs）。为此，研究人员设计了一种定制的Affymetrix微阵列，用于鉴定单个HERV位点的表达情况，并以前列腺癌组织作为概念验证，为未来的临床研究奠定基础。

前列腺特异性抗原（PSA）是临床上用于前列腺癌诊断的主要生物标志物，但其特异性和敏感性不足，……

本项人类前列腺癌组织的转录组分析鉴定了个体人类内源性逆转录病毒表达位点，以评估一种定制的高密度微阵列作为生物标志物发现的筛选工具。在医生从患者体内切除前列腺器官后，病理学家在实验室中分别制备肿瘤组织及相邻的正常组织，从中提取、纯化并鉴定正常与肿瘤组织的MR.NA，使用全转录组扩增试剂盒扩增mRNA，然后切割并标记扩增产物。随后依次对H-E-R-V-V2微阵列进行加样、杂交、洗涤和扫描处理。最终，利用生物计算方法，可以追踪表现出显著信号和差异表达的探针集，从而鉴定出转录活跃的单个基因座。多年前，我们在多种背景下研究了IRV W家族的行为，包括多发性硬化症样本、胎盘和睾丸。当我们开始了解到，在一个家族中，IRV元件的重叠或非重叠亚群会被表达时，我首次产生了该方法的构想。具体表达情况取决于所处的生物学背景。利用SHIP技术，可以协调地探索多个HER家族，并对每个位点的不同区域进行同步分析。例如，LTR中的US三和UF结构域可能在病理过程中发挥直接作用。该方法有助于回答癌症研究领域的一些关键问题，例如在前列腺癌诊断中，现有的蛋白质生物标志物（如PSA）缺乏特异性和敏感性。与此同时，非编码RNA（如PCA三）则显示出更大的应用前景。接下来将由病理科技术人员米歇尔演示前列腺组织处理的操作流程。Philippe Per 将演示 RNA 提取、靶标制备与分析，而来自 John Unit 实验室的一名技术员将演示切片操作。将冷冻组织样本垂直固定于冷冻切片机中 OCT 包埋剂的小丘上。切取单张 5 µm 厚的切片，用苏木精（Blu udine）染色，然后进行快速组织学检查，以评估组织中是否存在肿瘤组织。评估肿瘤细胞的数量，并仅选择肿瘤细胞比例超过80%的组织芯。再切五微米厚切片，用苏木精、伊红和番红染色。随后切15张30微米厚的切片，转移至无RNA酶的离心管中。然后取最后一张5 µm厚的切片，用苏木精、伊红和番红染色，以控制肿瘤细胞的数量。操作结束后，将样本置于干冰上转移至分子生物学实验室。将组织置于冰上的Triol溶液中，使用手持匀浆器研磨，直至组织完全溶解。将样品在室温下孵育5分钟。然后加入300 µL氯仿，涡旋振荡15秒。室温放置2分钟后，在2至8°C下于12,000 ×g离心15分钟。对于RNA，小心地将上层水相转移至新的离心管中。加入750微升异丙醇，颠倒混匀后于室温孵育10分钟。离心样品以沉淀RNA，再用1毫升80%乙醇洗涤RNA沉淀。然后在4 °C条件下以7,500 ×g离心10分钟。使用P1000和P10枪头去除上清液。让残留的乙醇自然风干。接下来，加入 100 微升无 RNAs 水。将样品转移至 70 摄氏度的加热块中。为溶解沉淀，根据制造商说明书，使用生物分析仪和 NanoDrop 检测 RNA 质量及 RNA 完整性。理想的RNA提取中，RNA完整性数值通常为7或更高。随后按照供应商提供的说明，使用全转录组扩增RNA扩增试剂盒进行操作，然后纯化所得的单链cDNA产物。根据制造商说明书，使用生物分析仪和NanoDrop检测单链cDNA的产量和片段大小分布。扩增后cDNA的片段大小通常应在101至500个碱基之间，峰值约在600个碱基处，整体呈钟形分布。接下来，向30 µL旋涡中的2 µg cDNA中加入6.6 µL片段化混合液，在37 °C下孵育10分钟以进行cDNA片段化。然后在95摄氏度下将DNA变性10分钟，随后置于冰上。取1微升片段化的cDNA用于Agilent平台的片段大小分布验证。DNA变性处理可使杂交前cDNA的片段大小分布均一化至约100个核苷酸。使用生物分析仪Pfizer预润湿试剂检测单链CD NA的片段大小分布。将HERV基因芯片与200微升预杂交液混合，在50摄氏度、60转/分钟条件下孵育10分钟。在室温下，将131微升杂交混合液加入69微升已片段化并标记的CD NA中，混匀，置于95摄氏度孵育2分钟。随后在50摄氏度孵育5分钟，并以最大转速离心5分钟。现在取出已预湿的HERV基因芯片，加入200微升目标样品进行杂交。将两个SEPTA上的难处理位点在50摄氏度、60转/分钟条件下杂交18小时。清空HERV基因芯片并加入探针。用250微升洗涤缓冲液处理芯片，在位置一和位置二分别加入600微升SAPE溶液混合物和600微升抗体溶液混合物，在指定位置加入800微升芯片保存缓冲液。第三步，压下针头。为每个模块分配正确的芯片。选择 FS 4 5 0 0 0 4 协议，并按照软件指示运行每个模块。在SEPTA上涂抹防漏胶点以防止泄漏。然后将芯片装入自动加载器，或直接装入扫描仪。开始扫描。扫描芯片后生成点阵CEL文件，检查图像并将网格与斑点对齐，以识别探针细胞。同时对芯片进行多项质量控制检测。随后对芯片数据进行标准化处理，并在标准化后采用层次聚类方法分析数据集。通过显著性分析寻找微阵列实验中差异表达的基因，并对五对匹配的肿瘤与正常前列腺RNA样本进行错误发现率校正。这导致鉴定出207个具有差异表达值的HERV探针组。对来自其他癌组织的35个额外匹配对样本的进一步分析鉴定出44个前列腺特异性HERV探针组。以下是10个最相关的HERV结构。最后，可以在一个专用界面中进行功能分析，该界面包含感兴趣的注释序列，以在顶部标识的前10个鉴定出的前病毒结构中选择的一个H-E-R-V-W元件为例，其上方标注了H-E-R-V-V双阵列上存在的特异性探针，并标注了功能性的逆转录病毒区域LTR、gag、POLE N，重点关注五端LTR的U3和U5亚结构域，并据此设计PCR引物用于RT-PCR验证。观看本视频后，您应能充分理解如何掌握样本与靶标制备中的关键步骤，这些步骤是成功应用微阵列进行地球研究以及常规生物标志物发现的质量先决条件。我们设计了一种高密度微阵列，采用ametri格式，旨在最优地表征个体位点的表达情况，以更深入地理解这些位点是否可能具有活性，即在干燥非编码区域NA转录过程中是否活跃，或是否可调控编码基因的表达。该技术为慢性病和传染病领域的研究人员提供了新的研究方向，因为对活性病毒位点的系统性鉴定可能将遗传、病毒和环境假说统一起来，作为多种病理过程的触发因素。在技术概念验证实验中，若样本数量有限，则成功发现生物标志物可能存在困难，因此需采取预防措施，例如遵循经过统计学验证的工作流程，确保方法的稳健性，并对目标患者人群进行具有代表性的取样。

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应用生物标志物发现在前列腺癌：个别赫尔维位点表达微阵列鉴定

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本文介绍了一种基于对来自多种公开数据库的合并临床数据集进行综合分析，以逐步开展表达、相关性及生存分析策略，探索乳腺癌生物标志物和生存预测因子的实验方案。...

利用多个公开数据库对乳腺癌生物标志物进行数据挖掘与整合分析

本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35...

用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

我们提出一种新方法，利用禽类胚胎模型中的动态实时活体成像，定量分析纳米颗粒在人源异种移植肿瘤血管系统中的定位。...

利用活体成像实时评估肿瘤中纳米颗粒的摄取

了解如何使用定制高密度微阵列技术检测前列腺癌组织中人类内源性逆转录病毒（HERV）的特异性表达位点，从而发现新型生物标志物并改善诊断特异性。

基于微阵列的单个内源性逆转录病毒位点表达鉴定：在前列腺癌生物标志物发现中的应用

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