应用生物标志物发现在前列腺癌:个别赫尔维位点表达微阵列鉴定

人内源性反转录病毒（HERV），它占据了人类基因组中的8％，保留稀缺编码能力，但一十万长末端重复序列（LTRs）。一个自定义的Affymetrix基因芯片的目的是找出个人赫尔维基因的表达，并用在前列腺癌组织的概念，为今后的临床研究证明。

这种人前列腺癌组织的转录组学分析确定了个体人内源性逆转录病毒表达位点，以评估定制的高密度微阵列作为生物标志物发现的筛选工具。外科医生从患者身上切除前列腺器官后，病理学家在实验室中分别准备肿瘤和邻近的正常组织，提取、纯化和鉴定 MR。来自正常组织和肿瘤组织的 NA 使用全转录组 ovation 试剂盒扩增 mRNA，然后切割并标记所得的扩增产物。然后通过填充杂交、洗涤和扫描依次处理 H-E-R-V-V 两个微阵列。

最终，使用生物计算方法探针集，可以追踪表现出显著信号和差异表达的探针集，从而鉴定具有转录活性的单个基因座。许多年前，我们探索了 IRV W 家族在各种情况下的行为，包括多发性硬化症样本。睾丸胎盘。

当我们开始了解表示一个族中 IRV 元素的重叠或不重叠的子组时，我第一次想到了它的方法。取决于上下文。使用飞船技术可以协调探索她的几个家庭，并同时分析每个基因座的不同区域。

例如，LTR 的 US three 和 UF 结构域，这可能支持在病理学中的直接作用。这种方法可以帮助回答癌症领域的关键问题，例如前列腺癌的诊断，其中现有的蛋白质生物标志物（如 PSA）缺乏特异性和敏感性。同时，像 PCA three 这样的非编码 RNA 似乎更有前途，演示前列腺处理程序将向米歇尔出售病理科的技术人员。

Philippe per 将演示 RNA 提取靶标的制备和分析，而 John Unit 实验室的技术人员将演示船舶程序。将冷冻组织层垂直安装在低温恒温器上的一小堆 OCT 上。取一个 5 微米的切片，用 Blu udine 染色，然后进行快速组织学检查，以检查肿瘤组织的组织性质。

估计 tural 细胞的数量，并仅选择肿瘤细胞超过 80% 的核心。再切下 5 微米的切片，用血红素、eoin 和藏红花染色。现在切下 15 个 30 微米厚的切片，并将它们转移到无 RNA 的 eend orph 管中。

然后取最后 5 微米切片，用血红素、eoin 和 saffron 染色，以控制肿瘤细胞的数量。在程序结束时，将干冰上的样品反式转移到分子生物学实验室。使用手持式研磨机在冰上的 Triol 溶液中匀浆组织，直到组织完全溶解。

将样品在室温下孵育 5 分钟。然后加入 300 微升氯仿并涡旋 15 秒。在室温下 2 分钟后，在 2 至 8 摄氏度下以 12， 000 G 离心 15 分钟。

对于 RNA，小心地将顶部水相转移到新试管中。加入 750 μL 异丙醇，倒置混匀，并在室温下孵育 10 分钟。离心样品以沉淀 RNA，用 1 毫升 80% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。

然后将样品在 4 摄氏度下以 7， 500 G 离心 10 分钟。使用 P 1000 和 P 10 吸头去除上清液。让剩余的乙醇风干。

接下来，加入 100 微升不含 RNA 的水。将样品转移到 70 摄氏度的加热块中。要溶解沉淀，请根据制造商的说明使用生物分析仪和 NanoDrop 检查 RNA 的质量和 RNA 完整性。

在理想的 RNA 提取中，RNA 完整性值通常为 7 或更大。按照供应商的说明继续使用全转录组 ovation，RNA 扩增试剂盒。然后纯化得到的单链 CD NA 产物。

根据制造商的说明，使用生物分析仪和 NanoDrop 检查单链 CDNA 的产量和尺寸分布。扩增的 CD NA 的尺寸分布通常应在 101 到 500 个碱基之间，峰值约为 600 个碱基，并且总体呈钟形分布。接下来，将 CDNA 碎裂，将 6.6 微升碎裂混合物加入 2 微克 CD NA 中，离心 30 微升，并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。

然后在 95 摄氏度下灭活 DNA 10 分钟并保持在冰上。分装 1 μL 片段化 CDNA，用于基于安捷伦的分子量分布验证。DNA 的一种处理在杂交前将 CD NA 大小分布匀浆至约 100 个核苷酸。

使用生物分析仪 Pfizer 预湿检查单链 CD NA 尺寸分布。具有 200 μL 预杂交的 HERV 基因芯片。混合并在 50 摄氏度、60 RPM 下孵育 10 分钟。

将 131 微升杂交混合物添加到 69 微升片段化和标记的 CD NA 中，在室温下混合，并在 95 摄氏度下在自然界中反应 2 分钟。然后在 50 摄氏度下孵育 5 分钟，并以最大速度离心 5 分钟。现在清空预润湿的 HERV 基因芯片并加载 200 μL 靶标制剂。

在 50 摄氏度、60 RPM 的温度下在两个 SEPTA 杂交上涂抹坚硬的斑点，持续 18 小时。清空 HERV 基因芯片并填充探针。用 250 微升洗涤缓冲液阵列，在 1 号和 2 号位置放置 600 微升 SAPE 溶液混合物和 600 微升抗体溶液混合物，在位置放置 800 微升阵列保持缓冲液。

第三，按下针头。为每个模块分配正确的芯片。选择 FS 4 5 0 0 0 0 4 协议，并按照软件的提示运行每个模块。

在 SEPTA 上贴上坚硬的地方以防止泄漏。然后将芯片装入自动装载机或直接装入扫描仪。开始扫描。

扫描芯片点 CEL 文件后，检查图像并将网格与点对齐以识别探针单元。还要对芯片进行多次质量控制测量。现在对芯片进行归一化并应用分层聚类方法来探索数据集，归一化后，进行显着分析以从微阵列程序中搜索差异表达基因，然后对五个匹配对肿瘤和正常前列腺 RNA 样本进行错误发现率校正。

这导致鉴定出 207 个具有差异表达值的 HERV 探针组。对来自其他癌组织的 35 个额外匹配对样本的进一步分析确定了 44 个前列腺特异性 HERV 探针组。这些是 10 个最相关的 HERV 结构。

最后，功能分析可以在专用界面中进行，该界面由感兴趣的注释序列说明，该元件在前 10 个已识别的前病毒结构中选择一个 H-E-R-V-W 元件，顶部标记，其专用特异性探针存在于 H-E-R-V-V 两个阵列上，并用功能逆转录病毒区域 LTR gag POLE N 标记，重点关注五个主要 LTRU 3 和 U 5 个子结构域， 以及随后设计用于 RT PCR 验证的 PCR 引物的设计。观看本视频后，您应该对如何掌握样品和靶标制备所涉及的关键步骤有很好的了解，这些步骤是成功使用 Microray for Earth 以及常规生物标志物发现的质量先决条件。我们设计了一种 ametri 格式的高密度微阵列，旨在最佳地表征基因座表达的个体，以便更好地了解它们在干燥的非锥区 NA 转录或调节编码基因表达时是否可以活跃。

这项技术为慢性病和传染病领域的研究人员铺平了道路，因为主动 voci 的系统识别可能会将遗传、病毒和环境假说统一为各种病理学的触发因素。在技术概念验证实验中使用有限数量的样品可能很棘手，要成功发现生物标志物，采取预防措施，例如遵守经过统计验证的工作流程，包括方法的稳健性，以及目标患者群体的代表性样本。