用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

本方案采用高通量CRISPR基因编辑工作流程，对成簇排列的微小RNA（micro RNA）基因进行分子层面的解析，并研究这些非编码RNA网络如何协调癌症进展通路。该CRISPR基因编辑方法可使研究人员快速构建一系列携带不同微小RNA基因簇缺失组合的细胞系，同时避免耗时的DNA载体亚克隆步骤。

该方法将有助于更清晰地理解成簇的微小RNA如何协同作用，以调控肿瘤的生长、侵袭性及药物耐药性，从而为将微小RNA转化为临床治疗和诊断工具奠定基础。本实验操作将由本实验室研究助理Grace Yi进行演示。首先，使用DNA序列注释软件程序创建一个DNA文件，其中包含目标微小RNA基因簇区域及其周围至少一千个碱基对的完整基因组序列。

接下来，为每个靶向的微小 RNA 位点设计四种独特的 CRISPR RNA。其中两种设计的 CRISPR RNA 用于靶向微小 RNA 发夹结构簇上游紧邻的互补 DNA 序列，另外两种设计的 CRISPR RNA 用于靶向微小 RNA 发夹结构簇下游紧邻的互补 DNA 序列。在创建的 DNA 文件中使用特征编辑工具，标记每种设计的 CRISPR RNA 所对应的待合成 DNA 靶序列。

设计并合成了用于基因分型CRISPR细胞系的PCR引物，引物位于目标微小RNA基因簇区域的侧翼。对新构建的慢病毒诱导型Cas9细胞系进行多西环素浓度梯度实验，以确定Cas9蛋白诱导的最佳条件。将第四代细胞每孔5×10个接种于6孔板中，每组设五个复孔，在适宜培养基中于37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。

用含有终浓度分别为0、50、100、150、250和500纳克/毫升多西环素的培养基进行稀释。将每个六孔板的孔按1至6编号。吸去原有培养基，更换为相应浓度的多西环素培养基。

将1至4号培养板分别在加入多西环素诱导24小时、48小时、72小时以及撤除多西环素后120小时进行培养。在每个时间点收获培养板中的孔。处理细胞沉淀并使用RIPA缓冲液进行裂解液的提取。

使用40微克蛋白质进行蛋白质印迹分析，以检测Cas9蛋白的诱导情况并确定最佳Cas9浓度。在纸上设计将要转染至24孔板各孔中的5'端和3'端CRISPR RNA配对组合，靶向整个microRNA簇、不同的成簇microRNA基因组合以及各个microRNA簇成员。将含优化浓度多西环素的优选培养基中，以每孔5×10⁴个细胞的密度接种慢病毒诱导型Cas9细胞系至24孔板中。

在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养细胞 24 至 48 小时，以诱导 Cas9 蛋白表达。用预先制备的 5' 端和 3' 端向导 RNA 转染慢病毒诱导型 Cas9 细胞。为每个靶向的微小 RNA 位点标记四个 1.5 毫升微量离心管。

在每个离心管中，将示踪RNA与独特的CRISPR RNA按1:1的摩尔比混合，形成2 µM的向导RNA复合物。向一个1.5 mL离心管中加入2.5 µL示踪RNA、1.25 µL位于5'端的CRISPR RNA、1.25 µL位于3'端的CRISPR RNA，以及5 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液。在16,000 ×g条件下用微量离心机离心30秒以混匀。

室温孵育5分钟。向每管中加入40 µL低血清培养基至10 µL向导RNA复合物反应体系中。用移液器轻轻吹打混匀。

在洁净的 1.5 毫升离心管中，用移液器轻轻吹打混合 2 微升转染试剂与 48 微升低血清培养基。室温孵育 5 分钟。向每管含有 50 微升向导 RNA 混合物的离心管中加入 50 微升稀释后的转染试剂。

将混合物缓慢吹打混匀一次。室温孵育20分钟。向每根含有100 µL引导RNA转染混合物的离心管中加入400 µL不含抗生素、添加多西环素的培养基。

轻轻吹打混匀。移除诱导型慢病毒诱导型Cas9细胞中的培养基。根据24孔板实验设计图，加入500 µL含多西环素的培养基和引导RNA转染混合物。

将转染后的细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48小时。更换为新鲜配制的不含多西环素的培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续培养细胞24至48小时，使其恢复。

收集转染后的细胞，并进行基因分型和单细胞稀释的准备。将重悬的150微升细胞分为三份。取其中三分之一的转染细胞，加入培养基和10% DMSO，置于冻存管中冷冻，用于长期保存。

将三分之一的转染细胞转移至一个洁净的0.2毫升PCR管中用于基因分型。将剩余的三分之一转染细胞制备成适合计数和稀释的悬液，以96孔板形式进行单细胞克隆培养。使用12通道多通道移液器和无菌试剂槽，将稀释后的细胞悬液每孔100微升加入到每种稀释度对应的两行孔中。

单细胞克隆扩增时，让细胞生长 4 至 6 周，直至达到汇合状态。收集约 10 至 15 个单细胞克隆用于基因分型。针对每个靶向的微小 RNA 位点，鉴定至少三个独立的基因敲除单细胞克隆株系。

保留野生型单细胞系作为对照。将细胞沉淀重悬于4微升5× DNA聚合酶缓冲液、1微升蛋白酶K、1微升RNase A以及无核酸酶水，直至总体积达20微升。在PCR仪中56摄氏度孵育30分钟，随后96摄氏度孵育5分钟。

将细胞裂解液保存在零下20摄氏度，直至准备进行PCR基因分型。使用设计好的PCR引物进行PCR基因分型反应，这些引物位于向导RNA的5'端和3'端靶向位点的两侧。按照文本稿件中提到的程序，在热循环仪中运行PCR反应。

将PCR产物上样至1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。从预测分子大小的敲除基因型PCR片段中提取DNA。制备样品用于DNA测序。

验证CRISPR反应是否成功，并对分离的PCR片段进行DNA测序，以确定Cas9切割位点并确认微小RNA位点的删除。设计了特异性的CRISPR RNA，靶向整个35 kb的miR-888簇区域。同时针对miR-743家族或miR-891家族内的较小簇组合以及微小RNA的删除设计了相应的CRISPR RNA。

PCR反应的凝胶电泳分析表明，每次CRISPR转染均扩增出了代表敲除基因型的预测DNA片段大小。通过PCR对单细胞克隆进行基因分型并经序列验证。对这些分离出的敲除PCR片段进行DNA测序，结果证实转染的5'端和3'端向导RNA引导Cas9在PAM位点上游约三个核苷酸处发生切割连接，并验证了靶向微小RNA位点的基因组缺失。

通过WST-1增殖实验比较miR-891a基因敲除细胞与野生型细胞的结果证实，microRNA模拟物慢病毒载体的过表达可诱导前列腺细胞生长，因此推测miR-891a缺失将产生相反效应。除精心设计向导RNA外，快速获得每个microRNA敲除细胞系的单细胞克隆也至关重要。这一点尤为重要，因为若microRNA敲除细胞的生长能力或存活率降低，则在与野生型细胞共培养的混合群体中极易被竞争淘汰。

应采用其他方法，如定量实时 PCR、Northern 印迹和 RNA 测序，以确认 CRISPR 敲除细胞系不表达被删除位点的成熟 microRNA。