用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

本方案采用高通量CRISPR基因编辑工作流程，对成簇排列的微小RNA（micro RNA）基因进行分子层面的解析，并研究这些非编码RNA网络如何协调癌症进展通路。该CRISPR基因编辑技术可使研究人员快速构建一系列携带不同微小RNA基因簇缺失组合的细胞系，同时避免耗时的DNA载体亚克隆步骤。

该方法将有助于更清晰地理解成簇的微小RNA如何协同作用，调控肿瘤的生长、侵袭性及药物耐受性，从而为将微小RNA转化为临床治疗和诊断工具奠定基础。本实验操作将由本实验室研究助理Grace Yi进行示范。首先，使用DNA序列注释软件，创建一个包含目标微小RNA基因簇区域及其上下游至少一千个碱基对范围内完整基因组序列的DNA文件。

接下来，为每个靶向的微小 RNA 位点设计四种独特的 CRISPR RNA。其中两种设计的 CRISPR RNA 用于靶向微小 RNA 发夹结构簇上游紧邻的互补 DNA 序列，另外两种设计的 CRISPR RNA 用于靶向微小 RNA 发夹结构簇下游紧邻的互补 DNA 序列。在创建的 DNA 文件中使用特征编辑工具，标记每种设计的 CRISPR RNA 所对应的待合成 DNA 靶序列。

设计并合成了用于基因分型CRISPR细胞系的PCR引物，引物位于目标微小RNA簇区域的侧翼。对新构建的慢病毒诱导型Cas9细胞系进行多西环素浓度梯度实验，以确定Cas9蛋白诱导的最佳条件。将第四代细胞每孔5×10个接种于6孔板中，每组设五个重复孔，在适宜培养基中于37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。

用含有终浓度分别为0、50、100、150、250和500纳克/毫升多西环素的培养基进行稀释。将每个六孔板的孔按1至6编号。吸去原有培养基，更换为相应浓度的多西环素培养基。

将1至4号培养板分别在加入多西环素诱导24小时、48小时、72小时以及撤除多西环素后120小时进行培养。在每个时间点收集培养板中的孔内细胞。处理细胞沉淀并使用RIPA缓冲液进行裂解液的提取。

使用40微克蛋白质进行蛋白质印迹分析，以检测Cas9蛋白的诱导情况并确定最佳Cas9浓度。在纸上设计将要转染至24孔板各孔中的5'端和3'端CRISPR RNA配对组合，靶向整个microRNA簇、不同的成簇microRNA基因组合以及各个microRNA簇成员。将含优化浓度多西环素的优选培养基中培养的慢病毒诱导型Cas9细胞系以每孔5×10⁴个细胞的密度接种至24孔板中。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞24至48小时，以诱导Cas9蛋白表达。用预先制备的5'端和3'端向导RNA转染慢病毒诱导型Cas9细胞。为每个靶向的微小RNA位点标记四个1.5毫升微量离心管。

在每个离心管中，将示踪RNA与独特的CRISPR RNA按1:1的摩尔比混合，形成2 µM的向导RNA复合物。向一个1.5 mL离心管中加入2.5 µL示踪RNA、1.25 µL位于5'端的CRISPR RNA、1.25 µL位于3'端的CRISPR RNA，以及5 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液。在16,000 ×g条件下用微量离心机离心30秒以混匀。

室温孵育5分钟。向每管中加入40 µL含还原血清的培养基和10 µL引导RNA复合物反应液。用移液器轻轻吹打混匀。

在洁净的1.5毫升离心管中，用移液器轻轻吹打混合2微升转染试剂与48微升低血清培养基。室温孵育5分钟。向每管含有50微升向导RNA混合物的离心管中加入50微升稀释后的转染试剂。

用移液器将混合物缓慢吹打混匀一次。室温孵育20分钟。向每根含有100微升gRNA转染混合物的离心管中加入400微升添加了多西环素的无抗生素培养基。

轻轻吹打混匀。移除诱导型慢病毒诱导型Cas9细胞中的培养基。根据24孔板实验设计图，加入500 µL含多西环素的培养基和引导RNA转染混合物。

将转染的细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48小时。更换为新鲜配制的不含多西环素的培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续培养细胞24至48小时，使其恢复。

收集转染后的细胞，并进行基因分型和单细胞稀释。将重悬的150微升细胞分为三份。取其中三分之一的转染细胞，加入培养基和10% DMSO，置于冻存管中冷冻，用于长期保存。

将三分之一的转染细胞转移至一个洁净的0.2毫升PCR管中用于基因分型。将剩余的三分之一转染细胞制备成96孔板形式，进行计数和稀释，以生成单细胞克隆。使用12通道多通道移液器和无菌试剂储液槽，将稀释后的细胞每孔100微升加入到每排两个孔中，每个稀释度处理两排孔。

让细胞生长 4 到 6 周，直至达到共汇合状态，以进行单细胞克隆扩增。收集约 10 到 15 个单细胞克隆用于基因分型。针对每个靶向的微小 RNA 位点，鉴定至少三个独立的敲除单细胞克隆株系。

保留野生型单细胞系作为对照。将细胞沉淀重悬于4微升5 X DNA聚合酶缓冲液、1微升蛋白酶K、1微升RNase A以及无核酸酶水，直至总体积达20微升。在PCR仪中56摄氏度孵育30分钟，随后96摄氏度孵育5分钟。

将细胞裂解液保存在负20摄氏度，直至准备进行PCR基因分型。使用设计好的PCR引物进行PCR基因分型反应，这些引物位于向导RNA的5'端和3'端靶向位点的侧翼区域。按照文本稿件中提到的程序，在热循环仪中运行PCR反应。

将PCR产物上样至1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。从预测分子大小的敲除基因型PCR片段中提取DNA。制备样品用于DNA测序。

验证CRISPR反应是否成功，并对分离的PCR片段进行DNA测序，以确定Cas9切割位点并确认微小RNA位点的删除。设计了特异性的CRISPR RNA，靶向整个35 kb的miR-888簇区域。同时针对miR-743家族或miR-891家族内的较小簇组合以及微小RNA的删除设计了相应的CRISPR RNA。

PCR反应的凝胶电泳分析表明，每次CRISPR转染均扩增出了代表敲除基因型的预测DNA片段大小。通过PCR对单细胞克隆进行基因分型并经序列验证。对这些分离出的敲除PCR片段进行DNA测序，结果证实转染的5'端和3'端向导RNA引导Cas9在PAM位点上游约三个核苷酸处发生切割连接，并验证了靶向微小RNA位点的基因组缺失。

通过WST-1增殖实验比较miR-891a基因敲除细胞与野生型细胞，证实microRNA模拟物慢病毒载体的过表达可诱导前列腺细胞生长，因此推测miR-891a缺失将表现出相反效应。除精心设计向导RNA外，快速获得单细胞克隆以建立每条microRNA敲除细胞系也至关重要。这一点尤其重要，因为若microRNA敲除细胞的生长能力或存活率降低，则在与野生型细胞共存的混合群体中极易被竞争淘汰。

应采用其他方法，如定量实时 PCR、Northern 印迹和 RNA 测序，以确认 CRISPR 敲除细胞系不表达被删除位点的成熟 microRNA。