用于微RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

该协议描述了用于microRNA聚类网络分析的高通量簇规则间隔短回文重复（CRISPR）基因编辑工作流程，允许在单个实验中快速生成一组携带独特miRNA簇成员缺失组合的转基因细胞系。

该协议使用高通量CRISPR基因编辑工作流程来分子剖析组织和聚集单位的micro RNA基因。并确定这些非编码RNA网络如何协调癌症进展途径。这种CRISPR基因编辑程序允许研究人员快速生成携带独特micro RNA簇缺失组合的整个细胞系组合，同时避免耗时的DNA载体亚克隆。

在将微RNA作为治疗和诊断工具翻译成临床之前，该方法将更清楚地了解簇状微RNA如何协同功能以调节肿瘤生长，侵袭性和耐药性。演示该程序的将是我实验室的研究助理Grace Yi。首先，使用 DNA 序列注释软件程序创建一个 DNA 文件，其中包含至少一千字节周围基因组区域中感兴趣的微 RNA 簇区域的完整基因组序列。

接下来，为每个靶向微RNA位点设计四个独特的CRISPR RNA。两个设计的CRISPR RNA立即靶向互补DNA序列的微RNA发夹簇的五个素数，两个设计的CRISPR RNA立即靶向互补DNA序列的微RNA发夹簇的三个素数。使用创建的DNA文件中的特征编辑工具来标记要合成的每个设计的CRISPR RNA的DNA靶序列。

设计并合成了靶向微RNA簇区域两侧的PCR引物，用于对CRISPR细胞系进行基因分型。对新生成的 lenti 诱导型 Cas9 细胞系进行多西环素浓度曲线，以确定 Cas9 蛋白诱导的最佳条件。每孔板每孔板4个细胞的10个板5次，并在37摄氏度，5%二氧化碳下在优选培养基中生长24小时。

在优选培养基中稀释dox，最终dox浓度曲线范围为0 5100，150，250至500纳克/毫升。将每个坐式六孔板的孔从一到六标记。取出培养基并用适当的人肉搜索量浓度替换。

将培养板生长 1 至 4 小时，直到 24 小时、48 小时和 72 小时人肉诱导以及人肉停止后 120 小时。在每个时间点收获板的孔。处理细胞沉淀和RIPA缓冲液以进行裂解物分离。

用40微克蛋白质进行蛋白质免疫印迹分析，以测量Cas9蛋白诱导并确定最佳Cas9浓度。在纸上，绘制出五个素数和三个素数CRISPR RNA对组合，这些组合将被截断到针对整个micro RNA簇，各种簇状micro RNA基因组合以及单个micro RNA簇成员的24孔板的每个孔中。在含有优化Dox浓度的优选培养基中，将lenti诱导型铸造九个细胞系以每孔24孔板的5乘以10至第四个细胞系。

在37摄氏度，5%二氧化碳下培养细胞24至48小时，以诱导Cas9蛋白表达。用制备的五个初代和三个原代引导RNA转染雀斑诱导的Cas9细胞。标记每个靶向微RNA位点的四个1.5毫升微量离心管。

在每个试管中，将示踪RNA和独特的CRISPR RNA的摩尔比一比混合在一起，形成两个微摩尔引导RNA复合物。将 2.5 微升示踪剂 RNA、1.25 微升五种原质定位 CRISPR RNA、1.25 微升三种原质定位 CRISPR RNA 和 5 微升 10 毫摩尔三盐酸 pH 7.5 缓冲液加入 1.5 毫升离心管中。微量离心机30秒，以16， 000倍G混合。

在室温下孵育五分钟。向每管40微升还原血清培养基向10微升引导RNA复合物反应。通过上下移液轻轻混合。

在干净的1.5毫升离心管中，上下移液轻轻混合2微升转染试剂和48微升还原血清培养基。在室温下孵育五分钟。向每个含有50微升引导RNA混合物的试管中，加入50微升稀释的转染试剂。

缓慢上下移取混合物一次以混合。在室温下孵育20分钟。向含有100微升引导RNA转染混合物的每个试管中加入400微升补充有强力西环素的无抗生素培养基。

轻轻移液混合。从多西环素诱导的雀斑诱导的Cas9细胞中取出培养基。根据24孔板实验图加入500微升培养基多西环素引导RNA转化混合物。

将转染的细胞在37摄氏度下在5%二氧化碳中孵育48小时。用不含多西环素的新鲜制备培养基替换培养基。让细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下再恢复 24 到 48 小时。

收获转染的细胞，为基因分型和单细胞妄想做准备。将150微升重悬的细胞分成三部分。将三分之一的转染细胞冷冻在培养基中，并在冷冻瓶中冷冻10%DMSO，以便长期储存。

将三分之一的转染细胞转移到干净的0.2毫升PCR管中进行基因分型。准备最后三分之一的转染细胞，以 96 孔板形式进行计数和稀释，以产生单细胞菌落。使用12通道多移液器和无菌试剂储液槽，每次稀释时，每孔向两排板中加入100微升稀释细胞。

等待四到六周，让细胞生长到单细胞集落扩增的汇合。收集大约 10 至 15 个单细胞菌落进行基因分型。为每个靶向微RNA位点鉴定至少三个独立的敲除单细胞集落系。

保留野生型单细胞系作为对照。将细胞沉淀重悬于四微升五 X DNA 聚合酶缓冲液、一微升蛋白酶 K、一微升 RNase A 和无核酸酶水中，总体积可达 20 微升。在热循环仪中将细胞在56摄氏度下虱30分钟，在96摄氏度下虱子5分钟。

将细胞裂解物储存在零下20摄氏度，直到准备好进行PCR基因分型。使用设计的PCR引物进行PCR基因分型反应，该引物位于引导RNA的五原基和三原导RNA靶位点的两侧。使用文本手稿中提到的程序在热循环仪中运行PCR反应。

将PCR产物加载到1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。从敲除基因型的预测分子大小的分离PCR片段中提取DNA。准备用于DNA测序的样品。

验证CRISPR反应是否成功，并对分离的PCR片段进行DNA测序，以鉴定Cas9切割位点并确认微RNA位点缺失。设计了独特的CRISPR RNA，靶向整个35公斤碱基miR-888簇区域。miR-743 家族或 miR-891 家族中较小的簇组合以及微 RNA 缺失。

PCR反应的凝胶电泳分析表明，代表敲除基因型的预测DNA片段大小在每次CRISPR转染中扩增。通过PCR对单细胞菌落进行基因分型，并按顺序验证。这些分离的敲除PCR片段的DNA测序证实，转染的5个初代和3个原代引导RNA在PAM位点上游的大约三个核苷酸上定向Cas9切割连接，并验证了靶向微RNA位点的基因组丢失。

比较miR-891a敲除和野生型细胞的WST-1增殖测定证实，micro RNA模拟慢病毒载体的过表达诱导前列腺细胞生长，因此预测miR-891损失将显示相互效应。除了仔细的RNA引导设计外，通过每个微RNA敲除系快速产生单细胞集落也很重要。如果micro RNA敲除细胞的活力生长降低，并且在具有野生型细胞的混合群体中很容易被竞争，则尤其重要。

应执行其他方法，例如定量实时PCR，北方印迹和RNA测序，以确认CRISPR敲除细胞系不表达已删除位点的成熟微RNA。