检测，可视化和定量活性氧的生成在变形虫模型系统
November 5th, 2013
我们适于一组协议对活性氧簇（ROS）可以在不同的变形虫和哺乳动物细胞模型被应用于用于定性和定量研究的测量。
以下实验的总体目标是提供一种简单且通用的解决方案来监测各种活性氧或 ROS 及其定位，并进一步了解 ROS 相关的细胞机制。这是通过进行三种不同的检测来实现的，其中第一种使用 RST green 或 OB G 包被的微珠和实时显微镜、ob g 荧光素和 Alexa。Fluor 594 通过 BSA 共价偶联到三个微米 sica 珠的表面。
OBG 荧光素的荧光发射表明 ROS 氧化，而 Alexa Fluor 594 的信号有助于定位微珠并用作荧光定量的对照。第二种方法在基于读板器的分析中使用超氧化物敏感探针二氢乙锭或 DHE。由于超氧氧化，乙锭能够嵌入到细胞核和线粒体 DNA 中，并分别在 522 纳米和 605 纳米处移动激发峰和发射峰。
AUM 的荧光强度对应于超氧化物的产生量，允许定量测量细胞内超氧化物的产生。第三种方法也是基于读板器的测定。过氧化氢敏感探针 plex ultra red 或 UR 用于定量测量细胞外过氧化氢的产生。
UR OX 的荧光强度对应于细胞外产生的过氧化氢量。获得的结果表明，基于 O-B-G-D-H-E 和 a UR 测定的动态 ROS 生成的定位。与其他现有方法（例如基于板率的 OB GSA）相比，该技术的主要优点是它可以在单个细胞水平上动态可视化 Al Roth 生成。
而不是镜像和平均来自细胞群的 Roth 信号。由于非同步吞噬作用，这种群体平均方法往往会掩盖关键信息。要开始使用 oxy、Burt Green 或 OBG 对珠子进行编码，请将 1 毫升 3.0 微米羧化二氧化硅珠子的悬浮液添加到 1.5 毫升管中。
旋转试管，快速去除上清液。加入 1 毫升 PBS 并以这种方式涡旋。用 PBS 洗涤珠子 3 次。
第三次洗涤后，去除上清液并重悬珠子。在每毫升氰化物含 25 毫克的 1 毫升 PBS 中，每次使用前必须新鲜制备氰化物溶液，在轮子上孵育 15 分钟。这将在 15 分钟后激活羧化硅胶珠以共价结合预先标记的 BSA，离心管，去除上清液。
加入 1 毫升偶联缓冲液，用偶联缓冲液涡旋洗涤 3 次，快速旋转和涡旋以去除多余的氰化物，将洗涤后的珠子与 500 微升含有 1 毫克 OBGH 2 H-F-F-B-S-A 的偶联缓冲液混合，然后用标准气罐中的氮气填充试管。加盖第二天在室温下在轮子上避光孵育 14 小时的试管后，用 1 毫升淬灭缓冲液洗涤珠子两次，快速旋转并涡旋，然后用偶联缓冲液洗涤两次以去除淬灭缓冲液，以去除淬灭缓冲液，从而淬灭未反应的 OBG。去除上清液后，加入 1 毫升偶联缓冲液，其中含有 50 μg LOR 594 cin a 中间酯，以与 BSA 偶联。
用氮气盖填充试管，并在室温下避光在轮子上孵育 1.5 小时。在 1.5 小时孵育结束时，用 1 mL 淬灭缓冲液洗涤磁珠 3 次以终止反应。然后用 1 毫升 PBS 洗涤珠子 3 次。
最后，Ray 将珠子悬浮在每体积 2 微升重量为 10% 的 PBS 中。用于长期储存的叠氮化物。用血细胞仪测量悬浮液中珠子的浓度，通常为每毫升珠子的 1 到 2 乘以 10 到第 9 个珠子。
用氮气帽填充试管，并在黑暗中储存 4 摄氏度。通过从 10 厘米培养皿板中收获指数增长的 alium 细胞来开始此过程。在具有光学透明塑料或玻璃底部的 3 厘米培养皿上放置不同密度的细胞，并在第二天早上培养过夜。
选择汇合度约为 80% 的菜肴以用于实验。用低流量或 LF 培养基更换培养基，并在实验前孵育 2 小时，以减少 HL 5 C 培养基的细胞外和内体内自发荧光。在 LF 培养基中熔化 10 毫升 1.5%BDO 琼脂，然后将琼脂倒在平坦的表面上，以形成约 1 毫米厚的琼脂层。
等待 10 到 15 分钟，让琼脂凝固。将琼脂层切成两半 x 2 厘米的正方形，然后放入 LF 培养基中以备后用。用。修理宽视场显微镜。
将环境室的温度设置为 22 摄氏度，并调整实验所需的设置。孵育 2 小时后，从 3 cm 培养皿中吸出 LF 培养基，但让细胞单层覆盖一层薄膜。将先前制备的 OBG 包被珠子稀释至每毫升 10 至第 7 个珠子的 1.5 倍，并在细胞层上添加 10 微升。
取一张方形琼脂片，沥干多余的液体，但保持琼脂湿润。轻轻地将琼脂方块放在细胞层的顶部。琼脂覆盖层增加了磁珠和细胞之间的接触，从而提高了摄取率。
它还会略微压缩细胞，使它们在物镜的焦平面上保持更好。将盖子放在培养皿上 为了实验的成功。当 AGA 覆盖在细胞上时，不要移动 AGA 叠加层，立即开始成像步骤也很重要。
接下来，将培养皿放在显微镜载物台上，每分钟在红色、绿色和相位通道中自动拍照，持续两个小时或更长时间。为了测量 ROS 的产生，选择并关注包含吞噬作用整个过程的细胞事件。使用专业的图像处理软件，合并优化的三个通道，并将图片组装成电影。
定量红色和绿色通道中每个选定微珠的荧光强度。红色与绿色的比率将反映电池的动态 FOMO R os 产生。为了首先测量细胞内超氧化物的产生，在 10 毫升 HL 5 C 培养基中收集 180% 融合的铝培养皿，然后以 850 倍 G 离心铝细胞 5 分钟，然后小心并完全吸出培养基复苏，将细胞重悬于 SS 6.4 缓冲液计数细胞中，并稀释至最终密度为 6 乘以 10 至每毫升 6 个细胞。
将 50 微升细胞悬液加入白色不透明 96 孔板稀释的二氢乙锭或 DHE 原液的每个孔中，用 SS 6.4 缓冲液稀释 500 倍。然后使用多通道移液器将 50 微升稀释的 DHE 分配到 96 孔板的每个孔中。DHE 的最终浓度为 30 微摩尔。
反应将立即开始。可根据具体需要，此时或其他时间点添加刺激物或抑制剂。在 22 摄氏度下用培养基振荡孵育细胞。
使用荧光酶标仪每 2 分钟读取一次荧光，持续 1 小时。使用终点顶部读数模式，荧光激发波长为 522 纳米，发射波长为 605 纳米。如上一部分所示，通过制备带有 dium 细胞的 96 孔板来开始此过程。
将5 微升 HRP 原液加入 10 毫升 SS 6.4 缓冲液中，制备稀释的辣根过氧化物酶或 HRP。倒置试管以充分混合并保持在冰上。稀释的 HRP 溶液为 0.05 单位/毫升。
通过将 UR 储备液和稀释的 HRP 溶液混合到 SS 6.4 缓冲液中至最终浓度为 6.25，制备 plex ultra red 或 UR 反应混合物。微摩尔 a UR 和 0.005 单位/毫升。HRP 向每个孔中加入 50 微升 UR 混合物。
反应将立即开始。可根据具体需要，此时或其他时间点添加刺激物或抑制剂。在 22 摄氏度下用培养基振荡孵育细胞。
使用荧光酶标仪每 2 分钟读取一次荧光，持续 1 小时。使用终点顶部读数模式，荧光激发波长为 530 纳米，发射波长为 590 纳米。通过使用过氧化氢和 HRP 在体外氧化包被的珠子，并使用 500 纳米激发检查发射光谱来测试 OB g 荧光素的包被效率。
如图所示，与未氧化磁珠相比，氧化磁珠在 538 纳米处显示出显著的发射峰，强度比至少为 11 至 12 倍。通过显微镜可以定性和动态地可视化二细胞中吞噬体中 ROS 的产生，如这部具有代表性的延时电影所示，该电影在上升后的第一分钟内使用 6 倍放大倍率录制了 40 分钟。通过吞噬作用，OBG 荧光包被珠子的荧光从红色变为亮橙色，表明 ROS 可能直接在吞噬体内部产生。
细胞内超氧化物和细胞外过氧化氢的产生分别通过 DHE 和 UR 测定定量测量。显示了与这两种分析相关的生化反应的摘要。在 DHE 检测中，超氧化物通过超氧化物歧化酶或 SOD 转化为过氧化氢，过氧化氢通过过氧化氢酶转化为水和氧气。
酶标仪用于细胞内超氧化物的中等通量定量测量。一项代表性实验表明，当用来自大肠杆菌的 LPSA 脂多糖刺激时，AX 两个细胞的动态超氧化物产生显著高于未刺激的 AX 两个细胞的基础水平，并且缓冲液中反应的背景、蓝色荧光的降低和红色荧光的增加呈负相关。不出所料。
以下结果证实了 DHE 测定法测量的 R os 产生的定位。添加 D-E-D-T-C-A 膜通透性超氧化物歧化酶抑制剂以剂量依赖性方式增加 DHE 信号，表明 D-E-D-T-C 导致超氧化物歧化酶底物的积累。或者，添加膜 IMP 过氧化氢淬灭剂不会影响 A UR 测定中超氧化物的产生。
酶标仪用于细胞外过氧化氢产生的中等通量定量测量。一项具有代表性的实验表明，当用 LPS 刺激时，AX 两个细胞的动态过氧化氢产生显着高于未刺激的 AX 两个细胞的基础水平，并且当用不同浓度的 D-E-D-T-C 或过氧化氢酶处理时，A UR 信号以剂量依赖性方式降低，这是由于抑制细胞内超氧化物产生的过氧化氢和细胞外过氧化氢的消耗。用 D-E-D-T-C 和过氧化氢酶处理明确证实，DHE 和 A UR 测定在此程序之后专门测量 ROS Indicum 的不同类型和亚细胞定位。
可以执行其他方法，例如在感染病原菌或非病原菌期间镜像 Ross 生成，以回答其他问题，例如 Dictal stallion 将如何在损失产生方面应对不同的细菌感染。并且不要忘记，与病原菌（如微细菌）一起工作可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取适当的 BSL 两项措施等预防措施。
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概述
本研究提出了一种多功能方法来监测各种细胞模型中的活性氧（ROS）。这些方法允许对ROS的定位及其在细胞机制中的影响进行定性和定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 氧化应激研究
背景
- 活性氧（ROS）在细胞信号传导中扮演着关键角色。
- 监测ROS对于理解细胞中的氧化应激至关重要。
- 可以使用各种检测方法来研究不同细胞环境中的ROS。
- 活体显微镜和荧光技术增强了ROS的检测。
研究目的
- 开发用于测量变形虫和哺乳动物细胞中ROS的协议。
- 提供对ROS相关细胞机制的见解。
- 促进ROS的定性和定量研究。
使用的方法
- 使用RST绿色或OB G包被珠的活体显微镜。
- 氧化OBG荧光素的荧光发射分析。
- 使用超氧化物敏感探针二氢乙锭（DHE）。
- 基于板式读数仪的ROS水平定量检测。
主要结果
- OBG荧光素的荧光指示ROS氧化。
- DHE在超氧化物氧化时插入DNA中。
- 不同的检测方法提供了关于ROS定位的互补数据。
- 这些方法可以适应各种细胞模型。
结论
- 开发的协议对于研究ROS是有效的。
- 获得的见解可以为氧化应激研究提供信息。
- 这些方法增强了对细胞过程中ROS的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Monitoring reactive oxygen species (ROS) is critical for target validation in drug discovery, particularly in inflammatory and infectious disease models where ROS signaling modulates pathway activity. The ability to visualize and quantify ROS at subcellular resolution supports mechanistic de-risking by linking target engagement to functional oxidative responses. This approach enhances predictive confidence in early discovery by providing orthogonal readouts that reduce false positives in phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving ROS-mediated signaling pathways in immune cell models.
- Operational Value: Provides qualitative visualization of phagosomal ROS dynamics to confirm target-dependent cellular responses.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by correlating ligand stimulation (e.g., LPS) with quantifiable ROS bursts in phagocytes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, medium-throughput measurement of intracellular superoxide and extracellular H₂O₂ using DHE and AUR probes.
- Operational Value: Establishes standardized, reproducible fluorescence readouts compatible with 96-well plate formats for assay scalability.
- Assay Readiness: Generates dose-dependent signal changes in response to modulators, enabling inhibitor profiling and pathway validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses disease-relevant stimuli like LPS to model inflammatory activation in phagocytic systems.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes superoxide vs. hydrogen peroxide sources via compartment-specific probes, clarifying redox biology.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement by confirming target modulation through functional ROS output in native cellular contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying functional validation data after target engagement but before lead optimization, helping triage compounds based on pathway-specific oxidative responses.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of immunomodulatory targets through real-time ROS kinetics in live phagocytes.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for superoxide and H₂O₂ detection in plate-based formats.
- Analytics: Supplies quantitative fluorescence ratios and intensity metrics that allow comparison across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects in vitro ROS measurements to inflammatory disease models via LPS stimulation in Dictyostelium as a surrogate phagocyte system.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular ROS detection platform adaptable across cell types and stimuli for repeated use in target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in ROS-linked signaling pathways.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible protocols for qualitative and quantitative ROS detection across microscopy and plate reader platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional, mechanism-based readouts that complement binding or transcriptional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that modulate defined ROS responses in physiologically relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, probe handling, and phagocytosis assays.
- Depends on access to live-cell imaging systems and fluorescence microplate readers with appropriate filter sets.
- Necessitates standardization of bead coating, cell preparation, and stimulus timing across users and labs.
- Involves adaptation considerations when translating from Dictyostelium to mammalian phagocyte models.
- Limited by the short half-life of ROS, requiring immediate detection and optimized probe kinetics for accurate signal capture.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:42
OxyBurst Green (OBG)-Coating of Beads
5:43
Visualization and Qualitative Measurement of ROS Production in Phagosomes
8:48
Quantitative and Medium-throughput Measurement of Intracellular Superoxide Production
10:30
Quantitative and Medium-throughput Measurement of Extracellular H2O2 Production
12:04
Results: OxyBurst Green (OBG), Dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR) Assays can Detect and Measure ROS in Dictyostelium
15:54
Conclusion
