Name: 检测，可视化和定量活性氧的生成在变形虫模型系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: 学习使用活细胞显微镜和荧光探针在变形虫模型中检测活性氧的方法。该技术结合OBG包被微珠、DHE和AUR探针，实现ROS的可视化与定量分析，为研究氧化应激机制提供可靠工具。

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我们感谢Karl-Heinz Krause博士和Vincent Jaquet博士在建立这些实验方案过程中提供的帮助和建议，同时感谢NCCR生物成像平台的Christoph Bauer和Jérôme Bosset以及Navin Gopaldass博士提供的技术支持。本研究得到了瑞士国家科学基金会ProDoc项目的资助。

1. 吞噬体中活性氧产生的可视化与定性测量
OBG 包被的珠子应预先制备。珠子包被步骤和琼脂覆盖技术改编自已发表的参考文献5,14。
<ol>
	<li>加入1 ml 3.0 μm羧基化二氧化硅微球悬浮液（约1.8 × 10⁸个微球）9 将珠子加入1.5 ml离心管中，用1 ml PBS洗涤珠子3次，每次通过快速离心和涡旋混合。</li>
	<li>将珠子重悬于1 ml含25 mg/ml氰胺的PBS中（用于活化羧基化硅胶珠，使其共价结合预先标记的BSA），在旋转仪上孵育15分钟。</li>
	<li>用1 ml偶联缓冲液（0.1 M硼酸钠，pH 8.0）洗涤3次，每次通过快速离心（在台式小型离心机中全速离心5秒，或 alternatively 在台式离心机中以2,000 × g离心1分钟）并涡旋振荡，以去除过量的氰胺。</li>
	<li>将洗涤后的磁珠与500 μl偶联缓冲液混合，缓冲液中含有1 mg OxyBurst Green (OBG) H2HFF（二氢-2',4,5,6,7,7'-六氟荧光素）-BSA，在封管前用标准气罐通入氮气，然后在避光条件下于室温在旋转仪上孵育14小时（过夜）。</li>
	<li>用1 ml淬灭缓冲液（PBS中含250 mM甘氨酸）洗涤磁珠2次，以去除未反应的OBG，再用偶联缓冲液洗涤2次，以去除残留的淬灭缓冲液&#160;通过快速离心和涡旋混合。</li>
	<li>向偶联缓冲液中加入1 ml含50 μg Alexa Fluor 594 琥珀酰亚胺酯的溶液，用于与BSA偶联。盖盖前用氮气充满离心管，并在室温避光条件下于旋转仪上孵育1.5小时。</li>
	<li>用1 ml淬灭缓冲液快速离心并涡旋振荡洗涤磁珠3次，以终止反应；随后用1 ml PBS同样通过快速离心并涡旋振荡洗涤磁珠3次。</li>
	<li>最后，将珠子重悬于含有2 μl 10%（w/v）叠氮化钠的1 ml PBS中，用于长期保存。使用血细胞计数板测定悬浮液中珠子的浓度（通常约为1-2 × 10⁶ 个/ml）。9 beads/ml），封管前用氮气填充，并在避光条件下于4 °C保存。</li>
	<li>可通过在500 nm激发下检测发射光谱来测试OBG荧光素的包被效率。当被H₂O₂氧化时2O2 在辣根过氧化物酶（HRP）存在下，氧化微球在发射峰（538 nm）处的荧光强度为11-12倍&#160;高于非氧化涂层珠。</li>
	<li>收获对数生长期 盘基网柄菌 从10 cm培养皿中收集细胞，将不同密度的细胞接种于带有光学透明塑料或玻璃底的3 cm培养皿中，过夜培养。选择约80%汇合度的培养皿用于实验。一种培养 盘基网柄菌 细胞的研究已发表15.</li>
	<li>将培养基更换为低荧光培养基（LF培养基），并在实验前孵育2小时，以降低HL5C培养基的胞外和胞内内体自荧光。</li>
	<li>同时，将10 ml含1.5% Bacto琼脂的LF培养基融化，倒入平坦表面即 将10 cm × 10 cm的玻璃板制成约1 mm厚的琼脂层，静置10–15分钟使其凝固。将琼脂层切成2 cm × 2 cm的方块，置于LF培养基中备用。</li>
	<li>同时，准备共聚焦显微镜或宽场显微镜，将环境培养室的温度设置为 22 °C，并调整本实验所需的各项参数。（详见讨论部分中的附加说明）。</li>
	<li>孵育2小时后，吸出3 cm培养皿中的LF培养基，但细胞单层应仍被一层薄薄的培养基覆盖。将包被的微珠稀释至1.5 × 107 每毫升珠子溶液中加入10 μl至细胞层。</li>
	<li>取一块方形琼脂片，沥去多余液体但保持湿润。将琼脂片轻轻覆盖在细胞层上。琼脂片一旦置于细胞上后，不得移动。琼脂覆盖层可增加珠子与细胞之间的接触，从而提高摄取效率；同时还能轻微压迫细胞，使其更稳定地处于物镜的焦平面内。</li>
	<li>将盖子盖在培养皿上，置于显微镜载物台上，自动每隔1分钟在红色、绿色和相差通道各拍摄图像一次，持续2小时或更长时间。</li>
	<li>选择并聚焦包含完整吞噬过程的细胞事件。使用专业的图像处理软件，将优化后的三个通道合并，并将图像合成为视频。定量分析每个选定微珠在红色和绿色通道中的荧光强度，绿色与红色荧光强度的比值可反映细胞吞噬体活性氧（ROS）产生的动态变化。</li>
</ol>
2. 细胞内超氧阴离子生成的定量与中通量检测
<ol>
	<li>收集一个80%融合度的培养皿 盘基网柄菌 在10 ml HL5C培养基中。离心 盘基网柄菌 850 × g 离心 5 分钟，小心且彻底地吸除上清培养基。用 SS6.4 缓冲液 [0.12 M 山梨醇溶于 Sorensen 缓冲液 (14.69 mM KH2PO4 和 6.27 mM Na2HPO4），pH 6.4]，计数细胞并稀释至终浓度为 6 x 106 细胞/毫升（详见讨论部分的附加说明）。</li>
	<li>向不透明白色96孔板的每个孔中加入50 μl细胞悬液（详见讨论部分中的附加说明）。</li>
	<li>将DHE储备液（DMSO中30 mM）用SS6.4稀释500倍，必要时使用多通道移液器将50 μl稀释后的DHE加入每孔中。DHE的终浓度为30 μM。反应立即开始。</li>
	<li>此时可根据具体需要加入刺激物或抑制剂，或其他时间点加入。</li>
	<li>使用终点 &#34;顶部读数&#34; 使用荧光酶标仪，激发/发射波长为522 nm/605 nm，22 °C条件下每2分钟读数一次，持续1小时，每分钟中速振荡5秒。</li>
</ol>
3. 细胞外 H2O2 生成的定量与高通量测定
<ol>
	<li>按照 2.1 和 2.2 中所述的相同步骤进行操作。</li>
	<li>将5 μl HRP储备液（100 U/ml，溶于蒸馏水中）加入10 ml SS6.4溶液中，配制稀释的HRP溶液，涡旋振荡或倒置混匀，置于冰上保存备用。稀释后HRP溶液浓度为0.05 U/ml。</li>
	<li>将AUR储备液（10 mM AUR溶于DMSO）和稀释的HRP溶液加入SS6.4缓冲液中，配制AUR反应混合液，使AUR和HRP的终浓度分别为6.25 μM和0.005 U/ml。例如，配制40个反应所需的混合液时，将1600 μl SS6.4缓冲液、400 μl稀释HRP溶液和2.5 μl AUR储备液混合。</li>
	<li>必要时使用多通道移液器向每孔加入50 μl AUR混合液。此时反应开始。</li>
	<li>此时可根据具体需要加入刺激物或抑制剂，或其他时间点加入。</li>
	<li>使用终点 &#34;顶部读数&#34; 使用荧光微孔板读数仪，激发/发射波长为530 nm/590 nm，每2分钟读数一次，持续1小时，22 °C条件下，每次读数前中速振荡5秒。</li>
</ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+2013%3A+integrating+multiple+Dictyostelid+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li>
<li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li>
<li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2(2008).</li>
<li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li>
<li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li>
<li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li>
<li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

与先前描述的方法相比，OBG 检测法能够在单细胞水平上动态可视化吞噬体活性氧（ROS）的生成过程，而不是测量来自细胞群体的平均 ROS 信号。这类基于群体平均值的方法往往会掩盖由于吞噬作用不同步所导致的关键信息。我们成功地将 DHE 和 AUR 检测法应用于Dictyostelium，并优化了实验方案。最重要的是，我们明确了这两种检测方法所测定的活性氧的类型及其亚细胞定位。综上所述，这一整套针对Dictyostelium的活性氧检测方法为研究与活性氧相关的细胞机制（如先天免疫、细胞分化和细胞内信号传导）提供了一个有用且强大的系统。
对于OBG实验，包被珠的制备是实验成功的关键。由于哺乳动物细胞中受体介导的吞噬作用过程复杂，颗粒需经过调理（opsonized）例如 通过IgG介导以触发吞噬作用。哺乳动物细胞中较低的摄取效率严重限制了对单个吞噬体ROS生成事件的观察。吞噬作用的速率在 盘基网柄菌 比巨噬细胞中的水平高出10至20倍17，采用本方案可在不将任何调理素连接到珠子上的情况下，获得稳定...

活性氧（ROS）参与多种生物学过程，如宿主防御、信号传导、组织发育、损伤反应以及高血压和癌症等。其中研究较为深入的吞噬体NADPH氧化酶复合物，其功能是快速产生活性氧，即所谓的氧化爆发，以杀灭中性粒细胞吞噬体中摄入的细菌1。此外，线粒体呼吸链过程中电子泄漏曾被认为仅仅是活性氧的一种非调控性来源；但最近研究发现，该机制在小鼠巨噬细胞的吞噬体内杀菌过程中也发挥着重要作用2。近年来，社会性变形虫Dictyostelium已成为研究固有免疫反应细胞内在机制的有力且广受欢迎的模型。事实上，Dictyostelium与人类吞噬细胞在负责细菌感知、吞噬和杀灭的分子机制方面表现出出人意料的高度保守性3,4。与活性氧生成或解毒相关的蛋白和酶的同源物，如NADPH氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶，在人类和Dictyostelium中均可找到。作为研究最为深入的变形虫，Dictyostelium相较于哺乳动物模型系统具有多个独特优势：它们可在室温下生长，无需CO2环境，倍增时间为8–10小时；可轻松以贴壁或悬浮培养方式维持。此外，得益于其已完全测序并注释的单倍体基因组以及易于进行遗传操作的特点，Dictyostelium已成为极具吸引力的实验模式生物。
在以往的研究中，多种荧光素的氯化和氟化衍生物（统称为 OxyBurst Green，OBG）被用作活性氧（ROS）的报告分子，这些衍生物可在被 ROS 氧化后发出荧光。其中，细胞膜通透性的酯化衍生物用于检测胞质内的 ROS，而细胞膜不通透的葡聚糖或蛋白偶联衍生物则用于检测细胞外的 ROS。特别是，OBG 标记的 BSA 包被微球已被用于检测哺乳动物细胞吞噬体内的 ROS 生成5。然而，基于微孔板读数仪的方法只能获得细胞群体的平均 ROS 生成曲线。本方案利用专性吞噬细胞——Dictyostelium，以及优化的实验条件，实现了稳定且高效的吞噬作用，且无需在微球上偶联任何调理素。二氢乙啶（DHE）已被广泛应用于多种模式系统（如哺乳动物中性粒细胞和巨噬细胞）中检测 ROS 的产生6-9。然而，该方法的特异性和灵敏度仍存在一些争议8,10。作为 Amplex Red 的改进版本，AUR 的荧光强度对 pH 的敏感性较低，因此更适合用于中性或弱酸性环境中的 ROS 检测。AUR 近期已在多个哺乳动物系统中得到应用11,12，但尚未见其在非哺乳动物模型（这些模型通常需要弱酸性培养基）中的使用报道。此外，目前尚无公开发表的实验方案可用于定量、动态地检测社会性变形虫 Dictyostelium 中 ROS 的生成及其定位。
本系列实验方案旨在提供一种简便且多功能的方法，用于监测多种活性氧（ROS）及其在细胞内的定位，从而进一步揭示与ROS相关的细胞机制。对于OBG检测法，我们采用活细胞显微成像技术，实时观察Dictyostelium细胞吞噬OBG包被的微珠后吞噬体中ROS生成的全过程，并提出了一种研究吞噬体内细菌杀灭机制的新方法。我们已在Dictyostelium中优化了中等通量的DHE和AUR检测方法，分别用于检测细胞内超氧阴离子和细胞外H2O2的生成，实验中使用脂多糖（LPS）作为强效的ROS诱导剂。需注意的是，最近已有研究表明LPS可增强Dictyostelium对被吞噬细菌的杀菌活性13。此外，通过DEDTC和过氧化氢酶处理，明确验证了这两种方法可特异性地检测Dictyostelium中不同类型及亚细胞定位的ROS。最后，OBG检测法可通过将微珠进一步包被动物细胞吞噬受体的配体，从而适用于任何贴壁型吞噬细胞。理论上，DHE和AUR检测法也可在适当的实验条件下，针对任何贴壁或非贴壁细胞进行精细调整后应用。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>羧基化二氧化硅微球</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C 培养基</td><td>ForMedium</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo 培养基</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>细菌琼脂</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>二氢乙啶</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>二乙基二硫代氨基甲酸盐（DEDTC）</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>氰胺</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ibidi &amp;mu;-Dish 35 mm, high</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>底部由光学透明塑料制成</td></tr><tr><td>MatTek 35 mm 培养皿</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>底部由玻璃盖玻片制成</td></tr><tr><td>Scepter 细胞计数器</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>白色 96 孔板</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

在阿米巴模型系统中检测、可视化与定量活性氧的生成

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

活性氧（ROS）包含一系列具有反应性且寿命短暂的含氧分子，这些分子可通过催化或非催化方式动态地相互转化或被清除。由于大多数活性氧的寿命较短，且其来源和亚细胞定位具有多样性，因此只有通过结合多种实验方法进行精细测量，才能获得全面的认识。本文中，我们介绍了三种不同的实验方案，分别利用OxyBurst Green（OBG）包被的微珠、二氢乙啶（DHE）以及Amplex UltraRed（AUR），对Dictyostelium等专业吞噬细胞中的多种活性氧进行定性和定量监测。我们优化了微珠的包被流程，并结合OBG包被微珠与活细胞显微成像技术，在单细胞水平上动态可视化吞噬体内的活性氧生成过程。我们鉴定出来源于E. coli的脂多糖（LPS）是诱导Dictyostelium产生活性氧的强效刺激物。此外，我们还建立了基于DHE和AUR的实时、中通量检测方法，分别用于定量测定细胞内超氧阴离子和细胞外H2O2的生成水平。

吞噬体中活性氧（ROS）的生成可通过显微镜进行定性和动态可视化观察（文件 S1）。Alexa Fluor 594 发出的红色荧光对 pH 不敏感，在吞噬体环境中保持稳定，而 OBG 被氧化后其绿色荧光通道的荧光增强。发射光谱 体外 氧化与非氧化的OBG包被珠的比较 图1B，显示氧化后荧光强度显著增强。为便于观察动态过程，将两个通道合并显示，野生型AX2细胞在吞噬后1分钟内，荧光颜色由红色转变为橙色。绿色荧光的增强表明可能在吞噬体内直接产生了活性氧（ROS）。通过使用微孔板读数仪，可实现对细胞内超氧阴离子和细胞外H₂O₂的中通量定量检测。2O2 生产情况如图所示 图2C 和 图3B，分别。AX2 细胞的基础活性氧（ROS）产生可能源于常规的氧化还原代谢，可通过实验测定。当细胞经 LPS 刺激后，在两种检测中 ROS 产生的信号均显著增强。此外，在 DHE 检测中，蓝色荧光（二氢乙啶）信号的减少与红色荧光（乙啶）信号的增强呈预期的负相关关系。通过...

我们改进了一套可用于多种阿米巴和哺乳动物细胞模型中活性氧（ROS）检测的方案，适用于定性和定量研究。

活性氧（ROS）包含一系列动态相互转化的、具有反应活性且寿命短暂的含氧分子，……

以下实验的总体目标是提供一种简便且多功能的方法，用于检测多种活性氧（ROS）及其定位，并进一步揭示与ROS相关的细胞机制。该目标通过进行三种不同的检测来实现，其中第一种检测使用RST Green或OB G包被的微珠以及活细胞显微成像技术。OB G荧光素和Alexa Fluor 594通过BSA共价偶联至直径为三微米的二氧化硅微珠表面。OBG 荧光素的荧光发射表明其被活性氧（ROS）氧化，而 Alexa Fluor 594 的信号有助于定位微珠，并作为荧光定量的对照。第二种方法利用基于酶标仪检测的超氧阴离子敏感探针二氢乙啶（DHE）。由于超氧阴离子的氧化作用，乙啶能够嵌入细胞核和线粒体 DNA 中，并使其激发峰和发射峰分别转移至 522 纳米和 605 纳米。AUM 的荧光强度对应于超氧化物的生成量，从而可对细胞内超氧化物的产生进行定量测定。第三种方法也是一种基于酶标仪的检测方法。使用对过氧化氢敏感的探针 plex ultra red 或 a UR，定量测定细胞外过氧化氢的产生。UR OX 的荧光强度对应于细胞外产生的过氧化氢的量。通过 O-B-G-D-H-E 和 UR 检测方法获得的结果可显示动态活性氧生成的定位情况。该技术相较于其他现有方法（如基于平板速率的 OB GSA）的主要优势在于，能够在单细胞水平上动态可视化 Al Roth 的生成。而不是通过细胞群体的镜像和平均Roth信号进行分析。这种群体平均方法往往会因吞噬作用的非同步性而掩盖关键信息。开始对珠子进行oxy、Burt Green或OBG编码操作时，将1毫升3.0微米羧基化二氧化硅珠悬浮液加入一个1.5毫升离心管中。快速离心管子，去除上清液。加入一毫升 PBS，涡旋混匀。用 PBS 洗涤磁珠三次。第三次洗涤后，弃去上清液并重悬磁珠。加入1毫升含有25毫克/毫升氰化物的PBS溶液，氰化物溶液必须每次使用前新鲜配制，并在旋转仪上孵育15分钟。此步骤将活化羧基化二氧化硅磁珠，使其能够与预先标记的BSA共价结合。孵育15分钟后，离心管子，弃去上清液。加入1毫升偶联缓冲液，通过短暂离心并涡旋振荡，用偶联缓冲液洗涤三次以去除过量氰化物。将洗涤后的磁珠与含有1毫克OBGH2H-FF-BSA的500微升偶联缓冲液混合，然后用标准气罐向管中充入氮气。封盖后，于室温避光条件下在旋转仪上孵育14小时。次日，用1毫升淬灭缓冲液通过短暂离心并涡旋振荡洗涤两次，以淬灭未反应的OBG，随后再用偶联缓冲液洗涤两次以去除淬灭缓冲液。去除上清液后，加入含有50微克LOR 594琥珀酰亚胺酯的1毫升偶联缓冲液，用于与BSA偶联。用氮气帽盖住管子，并在避光条件下于室温下在旋转仪上孵育1.5小时。1.5小时孵育结束后，用1毫升淬灭缓冲液洗涤珠子三次，以终止反应。随后用1毫升PBS缓冲液洗涤珠子三次。最后，Ray，将珠子悬浮于1 mL PBS中，并加入2 µL 10%（质量/体积）的叠氮化钠，用于长期保存。使用血细胞计数板测定悬浮液中珠子的浓度，通常为每毫升1至2 × 10⁹个珠子。用氮气盖填充试管，并在避光条件下于 4°C 保存。首先从 10 厘米的培养皿中收集对数生长期的葱属细胞。将不同密度的细胞接种于底部为光学透明塑料或玻璃的 3 厘米培养皿中，并在次日早晨开始过夜培养。选择约80%汇合度的培养皿用于实验。为降低HL-5C培养基中外源性和内体内的自发荧光，实验前用低流速（LF）培养基替换原培养基，并在实验前孵育两小时。将10毫升含1.5% BDO琼脂的LF培养基融化，倒入平坦表面，形成厚度约为1毫米的琼脂层。等待 10 至 15 分钟，使琼脂凝固。将琼脂层切成 2×2 厘米的方块，放入 LF 培养基中备用。修复宽场显微镜。将环境培养箱的温度设置为 22 摄氏度，并调整实验所需的各项参数。孵育两小时后，吸除三厘米培养皿中的 LF 培养基，但保留细胞单层上覆盖的一层薄薄的培养基液体。将先前制备的 OBG 包被微珠稀释至每毫升含 1.5 × 10⁷ 个微珠，取 10 µL 加入细胞层上。取一块方形琼脂片，沥去多余液体，但保持琼脂湿润。将琼脂片轻轻放置在细胞层上方。琼脂覆盖层可增加珠子与细胞之间的接触，从而提高摄取效率。它还能轻微压缩细胞，使细胞更好地保持在物镜的焦平面上。将盖子盖到培养皿上，这对实验的成功至关重要。当AGA覆盖层覆盖在细胞上时，不要移动它，同时必须立即开始成像步骤。接下来，将培养皿置于显微镜载物台上，自动每隔一分钟在红色、绿色和相差通道中拍摄图像，持续两小时或更长时间。为测量活性氧（ROS）的产生，选择并聚焦包含完整吞噬过程的细胞事件。使用专业的图像处理软件，合并优化后的三个通道，并将图像组装成视频。定量分析所选微球在红色和绿色通道中的荧光强度。红绿荧光强度的比值可反映细胞内动态FOMO R活性氧的产生情况。为检测细胞内超氧阴离子的生成，首先收集180%汇合度的培养皿中的alium细胞，加入10毫升HL五C培养基，随后在850 × g条件下离心alium细胞5分钟，小心且彻底吸除上清液，用SS 6.4缓冲液重悬细胞，计数后调整细胞浓度至6 × 10⁶ 个细胞/毫升。向一个白色不透明的96孔板的每个孔中加入50微升细胞悬液。用SS 6.4缓冲液将二氢乙啶（DHE）储备液稀释500倍。然后使用多通道移液器将50微升稀释后的DHE加入96孔板的每个孔中。DHE的终浓度为30微摩尔。反应将立即开始。可根据具体需要在此时或其他时间点加入刺激物或抑制剂。在22摄氏度条件下，将细胞置于摇动的培养基中孵育。使用荧光酶标仪每两分钟读取一次荧光值，持续一小时。采用终点顶读模式，荧光激发波长为 522 纳米，发射波长为 605 纳米。开始此操作前，需按照前一片段所示方法，准备含有二钠细胞的 96 孔板。将5微升辣根过氧化物酶（HRP）储备液加入10毫升SS 6.4缓冲液中，配制稀释的辣根过氧化物酶（HRP）溶液。轻轻颠倒混匀试管，并置于冰上保存。稀释后的HRP溶液浓度为0.05单位/毫升。通过将a UR储备液和稀释的HRP溶液加入SS 6.4缓冲液中，配制plex ultra red或a UR反应混合液，终浓度为6.25 µM a UR和0.005单位/毫升HRP。每孔加入50 µL a UR混合液。反应将立即开始。可根据具体需要在此时或其他时间点加入刺激物或抑制剂。在22摄氏度条件下，将细胞置于培养液中并轻轻摇动孵育。使用荧光酶标仪每两分钟读取一次荧光值，持续一小时。采用终点顶读模式，荧光激发波长为 530 纳米，发射波长为 590 纳米。通过过氧化氢和辣根过氧化物酶（HRP）在体外氧化包被的微珠，并在激发波长 500 纳米下检测发射光谱，以测试 OB g 荧光素的包被效率。如本图所示，与未氧化的微珠相比，氧化后的微珠在538纳米处显示出显著的发射峰，其强度比至少高出11至12倍。通过显微镜可以对嗜中性粒细胞吞噬体中活性氧（ROS）的生成进行定性且动态的观察，如本代表性延时录像所示，该录像记录时长为40分钟，在吞噬发生后的第一分钟内使用6倍放大倍数进行拍摄。通过吞噬作用，OBG荧光素包被微珠的荧光颜色由红色变为亮橙色，表明ROS很可能直接在吞噬体内产生。细胞内超氧阴离子和细胞外过氧化氢的生成分别通过 DHE 和 UR 法进行定量检测。图中显示了与这两种检测方法相关的生化反应概要。在 DHE 检测中，超氧阴离子通过超氧化物歧化酶（SOD）转化为过氧化氢，过氧化氢再通过过氧化氢酶转化为水和氧气。微孔板读数仪用于细胞内超氧阴离子的中通量定量检测。一个代表性实验显示，当用大肠杆菌来源的脂多糖（LPSA）刺激时，AX2细胞产生的动态超氧阴离子显著高于未刺激的AX2细胞的基础水平以及缓冲液反应体系的背景值，蓝色荧光的降低与红色荧光的增强呈负相关，符合预期。通过DHE检测法测定的活性氧（R os）定位结果由以下实验结果证实。添加膜通透性的超氧化物歧化酶抑制剂D-E-D-T-C-A后，DHE信号以剂量依赖方式增强，表明D-E-D-T-C-A导致了超氧化物歧化酶底物的积累。相反，在A UR检测法中加入膜通透性的过氧化氢清除剂，则不影响超氧化物的产生。微孔板读数仪用于中等通量的细胞外过氧化氢生成量的定量检测。一个代表性实验显示，当使用LPS刺激时，AX two细胞产生的动态过氧化氢水平显著高于未刺激的AX two细胞的基础水平；而当分别用不同浓度的D-E-D-T-C或过氧化氢酶处理时，由于抑制了细胞内超氧阴离子来源的过氧化氢生成以及清除了细胞外的过氧化氢，A UR信号呈剂量依赖性下降。使用D-E-D-T-C和过氧化氢酶的处理明确证实，DHE和A UR检测方法分别特异性地测量了不同类型和亚细胞定位的活性氧（ROS Indicum）。按照本实验流程可实现上述结果。其他方法，例如在感染致病性或非致病性细菌期间监测罗斯体生成，可用于回答更多问题，例如盘基网柄菌在不同细菌感染条件下在子代生成方面的响应情况。此外，请注意，操作微小杆菌（Microbacterium marum）等致病性细菌可能具有极高危险性，进行此类实验时必须始终采取适当的生物安全二级（BSL-2）防护措施。

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科研

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生物学

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