在阿米巴模型系统中检测、可视化与定量活性氧的生成

以下实验的总体目标是提供一种简便且多功能的方法，用于检测多种活性氧（ROS）及其在细胞内的定位，并进一步揭示与活性氧相关的细胞机制。该目标通过开展三种不同的检测方法来实现，其中第一种方法使用RST Green或OB G包被的微珠结合活细胞显微成像技术。OB G荧光素与Alexa Fluor 594通过BSA共价偶联至直径为三微米的二氧化硅微珠表面。

OBG 荧光素的荧光发射表明其被活性氧（ROS）氧化，而 Alexa Fluor 594 的信号有助于定位微珠，并作为荧光定量的对照。第二种方法利用对超氧阴离子敏感的探针二氢乙啶（DHE），在基于酶标仪的检测中进行分析。由于被超氧阴离子氧化，乙啶能够插入核DNA和线粒体DNA，并使其激发和发射波长峰值分别发生红移，达到522纳米和605纳米。

AUM 的荧光强度对应于超氧化物的生成量，从而可对细胞内超氧化物的产生进行定量测定。第三种方法也是一种基于酶标仪的检测方法。使用对过氧化氢敏感的探针 plex ultra red 或 a UR，定量测定细胞外过氧化氢的生成。

UR OX 的荧光强度对应于细胞外产生的过氧化氢的量。通过 O-B-G-D-H-E 和 UR 检测方法获得的结果可显示活性氧动态生成的定位情况。该技术相较于其他现有方法（如基于平板速率的 OB GSA）的主要优势在于，能够在单细胞水平上动态可视化 Al Roth 的生成。

而不是对细胞群体的Roth信号进行镜像和平均化处理。这类群体平均化方法往往会因吞噬作用的非同步性而掩盖关键信息。开始对珠子进行oxy、Burt Green或OBG编码的步骤时，将1毫升3.0微米羧基化二氧化硅珠悬浮液加入一个1.5毫升离心管中。

快速离心管子，吸除上清液。加入一毫升 PBS，涡旋混匀。用 PBS 洗涤磁珠三次。

第三次洗涤后，移除上清液并重悬微珠。加入1毫升含有25毫克/毫升氰化物的PBS溶液，氰化物溶液必须每次使用前新鲜配制，并在旋转仪上孵育15分钟。此步骤将活化羧基化二氧化硅微珠，使其能够共价结合预先标记的BSA。孵育15分钟后，离心管子，移除上清液。

加入1毫升偶联缓冲液，通过短暂离心并涡旋振荡，用偶联缓冲液洗涤三次以去除过量氰化物；将洗涤后的磁珠与含有1毫克OBGH2H-FF-BSA的500微升偶联缓冲液混合，然后用标准气罐向管中充入氮气。封盖后，于室温避光条件下在旋转仪上孵育14小时。次日，通过短暂离心并涡旋振荡，用1毫升淬灭缓冲液洗涤两次以淬灭未反应的OBG，随后再用偶联缓冲液洗涤两次以去除淬灭缓冲液。去除上清液后，加入含有50微克LOR 594琥珀酰亚胺酯的1毫升偶联缓冲液，用于与BSA偶联。

用氮气帽封住管子，并在避光条件下于室温下在旋转仪上孵育1.5小时。1.5小时孵育结束后，用1毫升淬灭缓冲液洗涤珠子三次，以终止反应。随后用1毫升PBS洗涤珠子三次。

最后，Ray，将珠子悬浮于1毫升PBS中，并加入2微升10%（质量/体积）的叠氮化钠，用于长期保存。使用血细胞计数板测定悬浮液中珠子的浓度，通常为每毫升1至2×10⁹个珠子。

用氮气帽封住试管，并在避光条件下于4°C保存。首先从10厘米的培养皿中收集处于指数生长期的葱属细胞，开始此实验步骤。将不同密度的细胞接种于带有光学透明塑料或玻璃底的3厘米培养皿中，于次日清晨过夜培养。

选择约80%汇合度的培养皿用于实验。为降低HL-5C培养基的细胞外和胞内内体自发荧光，在实验前用低流速（LF）培养基替换原培养基，并孵育两小时。将10毫升含1.5% BDO琼脂的LF培养基融化，倒入平坦表面，形成厚度约为1毫米的琼脂层。

等待 10 至 15 分钟，使琼脂凝固。将琼脂层切成 2×2 厘米的方块，放入 LF 培养基中备用。修复宽场显微镜。

将环境培养箱的温度设置为 22 摄氏度，并调整实验所需的各项参数。孵育两小时后，吸除三厘米培养皿中的 LF 培养基，但保留覆盖细胞单层的一薄层液体。将先前制备的 OBG 包被微珠稀释至每毫升 1.5 × 10⁷ 个微珠，取 10 µL 加入细胞层上。

取一块方形琼脂片，沥去多余液体，但保持琼脂湿润。将琼脂片轻轻放置在细胞层上方。琼脂覆盖层可增加磁珠与细胞之间的接触，从而提高摄取效率。

它还能轻微压缩细胞，使细胞更好地保持在物镜的焦平面上。将盖子盖到培养皿上，这对实验的成功至关重要。当AGA覆盖层覆盖在细胞上时，不要移动它，同时必须立即开始成像步骤。

接下来，将培养皿置于显微镜载物台上，自动每隔一分钟在红色、绿色和相差通道中拍摄图像，持续两小时或更长时间。为测量活性氧（ROS）的产生，选择并聚焦包含完整吞噬过程的细胞事件。使用专业的图像处理软件，合并优化后的三个通道，并将图像合成为一段视频。

定量分析所选微球在红色和绿色通道中的荧光强度。红绿荧光强度的比值将反映细胞内动态 FOMO R 活性氧的生成情况。为检测细胞内超氧阴离子的产生，首先收集 180% 汇合度的 HL-5C 培养基中的 alium 细胞 10 毫升，随后以 850 × g 离心 alium 细胞 5 分钟，小心并彻底吸除培养基，用 SS 6.4 缓冲液重悬细胞，计数后将细胞稀释至最终浓度为 6 × 10⁶ 个细胞/毫升。

向一个白色不透明的96孔板的每个孔中加入50微升细胞悬液。用SS 6.4缓冲液将二氢乙啶（DHE）储备液稀释500倍。然后使用多通道移液器将50微升稀释后的DHE加入96孔板的每个孔中。DHE的终浓度为30微摩尔。

反应将立即开始。可根据具体需要在此时或其他时间点加入刺激物或抑制剂。在22摄氏度下，将细胞置于培养基中并轻轻摇动孵育。

使用荧光酶标仪每两分钟读取一次荧光值，持续一小时。采用终点顶读模式，荧光激发波长为 522 纳米，发射波长为 605 纳米。本步骤开始前，需按照前一片段所示方法，用二钠细胞制备一块 96 孔板。

将5微升辣根过氧化物酶（HRP）储备液加入10毫升SS 6.4缓冲液中，配制稀释的辣根过氧化物酶（HRP）溶液。轻轻颠倒混匀试管，置于冰上保存。稀释后的HRP溶液浓度为0.05单位/毫升。

通过将a UR储备液和稀释的HRP溶液加入SS 6.4缓冲液中，配制plex ultra red或a UR反应混合液，终浓度为6.25 µM a UR和0.005单位/毫升HRP。每孔加入50 µL a UR混合液。

反应将立即开始。可根据具体需要在此时或其他时间点加入刺激物或抑制剂。在22摄氏度条件下，将细胞置于培养基中并轻轻摇动孵育。

使用荧光酶标仪每两分钟读取一次荧光值，持续一小时。采用终点顶读模式，荧光激发波长为 530 纳米，发射波长为 590 纳米。通过过氧化氢和辣根过氧化物酶（HRP）在体外氧化包被的微珠，并在 500 纳米激发波长下检测发射光谱，以测试 OB g 荧光素的包被效率。

如图所示，与未氧化的微珠相比，氧化后的微珠在538纳米处显示出显著的发射峰，其强度比至少高出11至12倍。通过显微镜可以对嗜中性粒细胞吞噬体中活性氧（ROS）的生成进行定性和动态可视化观察，如这段代表性延时录像所示，该录像记录时长为40分钟，在吞噬发生后的第一分钟内使用6倍物镜进行拍摄。通过吞噬作用，OBG荧光素包被微珠的荧光颜色由红色变为亮橙色，表明ROS很可能在吞噬体内直接产生。

细胞内超氧阴离子和细胞外过氧化氢的生成分别通过 DHE 和 UR 法进行定量检测。图中显示了与这两种检测方法相关的生化反应概要。在 DHE 检测中，超氧阴离子通过超氧化物歧化酶（SOD）转化为过氧化氢，而过氧化氢则通过过氧化氢酶转化为水和氧气。

微孔板读数仪用于细胞内超氧阴离子的中通量定量检测。一个代表性实验表明，当用大肠杆菌来源的脂多糖（LPSA）刺激时，AX2细胞产生的动态超氧阴离子显著高于未刺激的AX2细胞的基础水平以及缓冲液反应体系的背景值，蓝色荧光的降低与红色荧光的升高呈负相关，符合预期。

通过DHE检测法测定的活性氧（R os）定位结果由以下实验结果证实。添加膜通透性的超氧化物歧化酶抑制剂D-E-D-T-C-A后，DHE信号以剂量依赖方式增强，表明D-E-D-T-C-A导致了超氧化物歧化酶底物的积累。相反，在A UR检测法中加入膜通透性的过氧化氢清除剂，则不影响超氧化物的产生。

酶标仪用于中等通量的细胞外过氧化氢生成的定量检测。一个代表性实验显示，当用LPS刺激时，AX two细胞产生的动态过氧化氢水平显著高于未刺激的AX two细胞的基础水平；当分别用不同浓度的D-E-D-T-C或过氧化氢酶处理时，由于抑制了细胞内超氧阴离子来源的过氧化氢生成以及清除了细胞外的过氧化氢，A UR信号呈剂量依赖性下降。使用D-E-D-T-C和过氧化氢酶的处理明确证实，DHE和A UR检测方法分别特异性地测量了不同类型和亚细胞定位的活性氧（ROS Indicum）。按照本实验流程可实现上述结果。

其他方法，例如在感染致病性或非致病性细菌期间监测罗斯体生成，可用于回答更多问题，例如盘基网柄菌在不同细菌感染条件下在子代生成方面的响应情况。此外，请务必注意，操作微小杆菌（Microbacterium marum）等致病性细菌可能具有极高危险性，在进行此类实验时，应始终采取适当的生物安全二级（BSL-2）防护措施。