利用亚细胞区室特异性氧化还原敏感型绿色荧光蛋白评估细胞氧化状态

本方案可针对纺织品中的氧化还原状态变化，在细胞内特定区室层面进行评估。我们的方案有助于更深入地理解并监测氧化应激相关的所有生理或病理生理机制。该技术通过比率计量输出，可在完整细胞中非侵入性地定量检测硫化物比率，从而抵消信号表达水平差异、光漂白效应及检测灵敏度不同所带来的影响。

该方案可应用于多种生物体，包括植物中的细菌。实验第一天，用两毫升含0.25%胰蛋白酶的EDTA溶液处理融合的乳腺癌细胞系细胞，处理两分钟。当细胞开始脱落时，加入六毫升完全培养基终止反应，并通过离心沉淀细胞。

将沉淀重悬于5毫升新鲜的完全培养基中，计数细胞并稀释至每1毫升完全培养基含1.5 × 10⁵个细胞。然后每孔接种1.5 × 10⁵个细胞（每毫升细胞悬液）至6孔板中，在细胞培养箱中孵育过夜。或者进行无病毒GFP转导。

次日早晨，将12.5、25和50微升的病毒溶液加入完全培养基中，该病毒溶液为将滴度为每毫升6×10¹⁰空斑形成单位（plaque forming units/mL）的add no viral erode GFP溶液按1:100稀释而成。将上述溶液分别加入6孔板中的相应孔中，使细胞感染复数（multiplicities of infection）分别为50、100和200。所有样本孔完成病毒感染后，将细胞放回细胞培养箱中孵育16至24小时。

第二天，通过荧光显微镜观察细胞，并将上清液更换为不含病毒的培养基，使细胞继续恢复培养24小时。为确定最佳转导效率，通过流式细胞术评估细胞的荧光强度和形态。所有可能产生气溶胶或飞溅物而导致感染的实验操作，务必在二级生物安全柜内进行。

为了评估细胞的氧化还原状态，次日早晨，将细胞以及6孔板中相应的孔与10 µM过氧化氢共同孵育1小时，然后按照图示方法，每孔加入750 µL含0.25% EDTA的胰酶溶液消化细胞。每孔加入2 mL完全培养基终止反应，并将各条件下的上清液分别收集至15 mL锥形管中。通过离心沉淀细胞，并用每孔500 µL PBS洗涤沉淀物，共洗涤两次。

第二次洗涤后，将细胞悬液通过40微米滤网过滤至预冷的流式细胞术专用管中，置于冰上并避光。在流式细胞仪软件中，先运行零感染复数对照样品，随后分析过氧化氢处理组及未处理组细胞。

可根据所示公式计算氧化型与还原型 roGFP 的平均荧光强度比值。此处展示了通过流式细胞术筛选大量细胞的设门策略。流式细胞术还可用于确定 roGFP 分析的剂量反应曲线以及最有效的感染复数输入值。

根据此次代表性分析中的感染复数（MOI）剂量反应曲线，感染复数为200时可获得最高的GFP表达水平，但细胞形态受到影响，提示存在细胞毒性。因此，确定最佳转导效率对应的感染复数为100。在本项氧化还原状态分析中，通过流式细胞术检测了对照组及四种10 µM阳性对照过氧化氢处理组的氧化态与还原态roGFP的平均荧光强度。

叠加的直方图表示在10微摩尔过氧化氢和载体处理组或还原型与氧化型erode GFP中细胞数量的变化。本分析中氧化型与还原型row GFP比值的计算结果显示，与载体处理相比，10微摩尔过氧化氢导致row GFP的氧化程度增加了三倍。准确的细胞数量对于MRI计算和实验可重复性至关重要。

为了获得可重复的实验结果，研究人员应充分混匀抗病毒溶液，以得到均一的悬液。本方案可使研究人员实时研究快速的氧化还原变化，将其作为正常细胞活动及疾病进展过程中广泛生物学过程的重要组成部分。