Name: 荧光显微镜方法测定细菌在协会的可行性与哺乳动物细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学习使用荧光显微镜技术评估宿主细胞内细菌的存活状态，通过荧光染料区分活菌与死菌，并确定其在不同亚细胞位置的分布情况。该方法为研究细菌感染机制提供了直接的个体细菌活力检测手段。

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感谢Asya Smirnov和Laura Gonyar对本文手稿的审阅。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为R00 TW008042和R01 AI097312（授予A.K.C.）。M.B.J.的部分研究工作由NIH T32 AI007046项目资助。

1. 使用碘化丙啶和SYTO9评估细菌活力
<ol>
	<li>在24孔板中，将目标细菌感染接种于直径为12 mm的圆形玻璃盖玻片上的贴壁细胞。 非 用醛类或有机溶剂固定细胞。</li>
	<li>用含 1 mM MgCl₂ 的 0.1 M 3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS) 缓冲液（pH 7.2）轻轻冲洗细胞一次2 (MOPS/MgCl₂)2).</li>
	<li>在黑暗条件下，室温孵育细胞10分钟，加入与目标细菌种类结合的Alexa Fluor 647标记抗体或凝集素，溶于MOPS/MgCl中2，用于检测外部细菌。</li>
</ol>
注意：在无宿主细胞的条件下，使用活菌和死菌进行对照实验，以证明目标凝集素或抗体可结合所有细菌，而不论其活性状态如何（图1）。
<ol start="4">
	<li>用 MOPS/MgCl2 溶液清洗细胞两次。</li>
	<li>吸除细胞培养基，加入 0.5 ml 活/死细胞染色液。活/死细胞染色液的终浓度为 5 μM SYTO9、30 μM 碘化丙啶（propidium iodide）和 0.1% 皂苷（saponin），溶于 MOPS/MgCl2 中。</li>
	<li>将细胞在室温避光条件下孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 MOPS/MgCl2 溶液再次清洗细胞两次。</li>
	<li>将盖玻片倒置在载玻片上，并用透明指甲油封片。请勿使用封片剂。</li>
	<li>在 30 分钟内使用配备适用于绿色、红色和远红荧光成像滤光片组的荧光显微镜采集图像。</li>
</ol>
注意：可使用常规荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜。30 分钟后，荧光染料开始从细菌中泄漏，所获取的数据将不再准确。本文所示图像采用 Nikon Eclipse E800 正置荧光显微镜，配备 Hamamatsu Orca-ER 数字相机及 Openlab 软件采集。Alexa Fluor 647 的荧光使用激发波长 590 - 650 nm、发射波长 663 - 735 nm 的滤光片检测，并伪染为蓝色。碘化丙啶的荧光使用激发波长 540 - 580 nm、发射波长 600 - 660 nm 的滤光片检测。SYTO9 的荧光使用激发波长 465 - 495 nm、发射波长 515 - 555 nm 的滤光片检测。
<ol start="10">
	<li>本方案将获得如下图像：外部无活力细菌呈蓝色+红色，内部无活力细菌仅呈红色，外部有活力细菌呈蓝色+绿色，内部有活力细菌仅呈绿色。通过肉眼计数分别统计外部无活力、内部无活力、外部有活力及内部有活力的细菌数量。</li>
	<li>通过将外部有活力细菌数量除以总外部细菌数量（有活力与无活力之和），计算外部有活力细菌的百分比。通过将内部有活力细菌数量除以总内部细菌数量（有活力与无活力之和），计算内部有活力细菌的百分比（图4）。</li>
	<li>本方案需进行两个关键对照实验。首先，需验证所有无活力细菌均为碘化丙啶阳性，所有活细菌均为SYTO9阳性。在无任何宿主细胞存在的情况下，处于对数中期的细菌培养物（mid-logarithmic culture）中，SYTO9阳性比例应 &#62;95%。图 2 显示的是淋病奈瑟菌（N. gonorrhoeae）对数中期培养物（浓度为每毫升108 个菌落形成单位）与活/死染色液孵育后的结果。其次，需验证碘化丙啶和SYTO9均可进入经透化处理的感染宿主细胞。
	<ol>
		<li>为制备死细菌群体，取2 × 108 个细菌菌落形成单位，置于1.5 ml 微离心管中，加入70%异丙醇，静置10分钟。在微量离心机中离心收集细菌沉淀，并用PBS洗涤两次以去除残留异丙醇。随后按本方案步骤1.5–1.7操作。取5 μl细菌悬液滴加于载玻片上，加盖盖玻片。按本方案步骤1.9的方法对样本进行成像。在此条件下，群体中100%细菌应为碘化丙啶阳性（图2）。在某些细菌种类中，碘化丙啶的荧光可能未能完全掩盖SYTO9染色，导致无活力细菌呈现黄色或橙色。</li>
		<li>对于中性粒细胞等吞噬性细胞，将其暴露于经异丙醇灭活的细菌中，并确保所有胞内细菌均为碘化丙啶阳性（图3）。对于可能无法内化死细菌的非吞噬性细胞，可在加入活/死染色液前，用叠氮化钠或其他细胞通透性抗菌剂处理感染细胞，以达到验证目的。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用SYTOX Green和DAPI评估细菌活力
<ol>
	<li>在 Morse's Defined 培养基中，用 10 μg/ml DAPI 标记目标细菌 25 在室温避光条件下孵育20分钟。</li>
	<li>在24孔板中，用DAPI标记的细菌感染贴壁于直径12 mm圆形玻璃盖玻片上的细胞。 NOT 使用醛类或有机溶剂固定细胞。</li>
	<li>用 MOPS/MgCl₂ 溶液洗涤细胞一次2.</li>
	<li>在黑暗条件下，于室温将细胞与偶联 Alexa Fluor 647 的抗体或凝集素（可结合目标细菌种类）在 MOPS/MgCl 溶液中孵育 10 分钟2，用于检测外部细菌。有关建议的对照，请参见方案步骤1.3中的注释。</li>
	<li>吸弃细胞培养液，加入 0.5 ml 含 0.4 μM SYTOX Green 的 MOPS/MgCl 溶液2.</li>
	<li>在室温避光条件下孵育细胞5分钟。</li>
	<li>用 MOPS/MgCl 溶液洗涤细胞两次2.</li>
	<li>用 MOPS/MgCl 洗涤细胞一次2 5 分钟。</li>
	<li>在30分钟内使用荧光显微镜采集图像。显微镜、数字相机及图像采集软件的详细说明见实验方案步骤1.9。</li>
</ol>
注意：使用激发波长为 590 - 650 nm、发射滤光片为 663 - 735 nm 的滤光系统检测 Alexa Fluor 647 的荧光信号，并以伪红色显示。使用激发波长为 465 - 495 nm、发射滤光片为 515 - 555 nm 的滤光系统检测 SYTOX Green 的荧光信号。使用激发波长为 355 - 375 nm、截止滤光片为 400 nm 的滤光系统检测 DAPI 的荧光信号。
<ol start="10">
	<li>本实验方案将获得如下图像：外部无活力细菌呈红色+绿色，内部无活力细菌呈绿色+蓝色，外部有活力细菌呈红色+蓝色，仅内部有活力细菌呈蓝色（图4）。按照方案步骤1.11所述方法，定量分析外部和内部细菌的百分比。</li>
	<li>应使用DAPI/SYTOX Green染料组合进行方案步骤1.12中所述的对照实验（图2和图3）。</li>
</ol>
3. 在亚细胞定位的同时评估细菌活力
<ol>
	<li>在避光条件下，于室温下用含10 μg/ml DAPI的Morse's Defined培养基标记目标细菌20分钟。</li>
	<li>在24孔板中，用DAPI标记的细菌感染贴壁于直径12 mm圆形玻璃盖玻片上的细胞。 NOT 使用醛类或有机溶剂固定细胞。</li>
	<li>用 MOPS/MgCl 洗涤细胞一次2.</li>
	<li>在 MOPS/MgCl 溶液中，避光、室温孵育 10 分钟，加入与目标细菌物种结合的 Alexa Fluor 647 偶联抗体或凝集素2，以检测外源细菌。有关建议的对照，请参见实验方案步骤1.3中的注释。</li>
	<li>吸弃细胞培养基，用 MOPS/MgCl 溶液冲洗细胞两次2.</li>
	<li>将细胞与Alexa Fluor 555标记的针对目标亚细胞标志物的抗体在MOPS/MgCl中于室温孵育20分钟2 含 0.2% 皂苷</li>
	<li>用 MOPS/MgCl 溶液洗涤细胞两次2.</li>
	<li>用 MOPS/MgCl 洗涤细胞一次2 5分钟。</li>
	<li>吸去细胞培养液，加入含 0.4 μM SYTOX Green 的 MOPS/MgCl₂ 溶液2.</li>
	<li>在室温避光条件下孵育细胞5分钟。</li>
	<li>用 MOPS/MgCl 溶液洗涤细胞两次2.</li>
	<li>用 MOPS/MgCl 洗涤细胞一次2 5 分钟。</li>
	<li>在荧光显微镜下于30分钟内获取载玻片的图像。显微镜、数字相机及图像采集软件的说明详见方案步骤1.9。</li>
</ol>
注意：使用激发波长为 590 - 650 nm、发射滤光片为 663 - 735 nm 的滤光系统检测 Alexa Fluor 647 的荧光信号，并以伪色紫色显示。使用激发波长为 540 - 580 nm、发射滤光片为 600 - 660 nm 的滤光系统检测 Alexa Fluor 555 的荧光信号。使用激发波长为 465 - 495 nm、发射滤光片为 515 - 555 nm 的滤光系统检测 SYTOX Green 的荧光信号。使用激发波长为 355 - 375 nm、截止滤光片为 400 nm 的滤光系统检测 DAPI 的荧光信号。
<ol start="14">
	<li>本方案将获得如下图像：外部非活菌呈紫色+绿色，内部非活菌呈绿色+蓝色，外部活菌呈紫色+蓝色，内部活菌仅呈蓝色，亚细胞蛋白呈红色（图4）。按照方案步骤1.11所述，定量分析外部和内部活菌的百分比。</li>
	<li>应使用DAPI/SYTOX Green染料组合进行方案步骤1.12中所述的对照实验（图2和图3）。</li>
	<li>除计数活菌和非活菌外，还需将每个细菌分类为与目标亚细胞标记物共定位阳性或阴性。</li>
	<li>通过将共定位的活菌数量除以活菌总数，计算与亚细胞标记物共定位的活菌百分比；通过将共定位的非活菌数量除以非活菌总数，计算与亚细胞标记物共定位的非活菌百分比。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了两种利用DNA结合染料和活力染料，并结合荧光凝集素来鉴定附着于和位于人类细胞内活菌与死菌的实验方案。由于这两种方案均能有效区分活菌与死菌，因此选择哪种方案取决于实验目的。第一种方案使用碘化丙啶（propidium iodide）检测无活力细菌，使用SYTO9染料检测完整细菌。图4A展示了将方案1应用于感染了N. gonorrhoeae的人类中性粒细胞的代表性图像。这些染料与一种凝集素——大豆凝集素（soybean agglutinin）联合使用，以识别细胞外的N. gonorrhoeae，但也可用荧光标记的细菌特异性抗体作为替代。方案1能够清晰显示单个细菌的活力状态，因为碘化丙啶会排斥SYTO9，从而使无活力细菌呈现红色荧光，而有活力细菌呈现绿色荧光。然而，由于碘化丙啶在常规荧光显微镜可用的四个通道中的两个通道内具有荧光信号，该方案无法与宿主蛋白的免疫荧光染色联用。因此开发了方案2，该方案使用SYTOX Green识别无活力细菌，DAPI检测总细菌群体。在图4B中展示了利用SYTOX Green和DAPI处理与人类中性粒细胞...

细菌与其宿主之间存在着动态的相互作用和共同进化关系。细菌已进化出黏附器官、分泌系统和/或产生毒素的能力，使其能够有效感染宿主的吞噬细胞和非吞噬细胞。同时，细菌还必须应对宿主免疫系统的识别以及其抗菌活性。宿主免疫系统由先天性和适应性免疫组分构成，包括物理和化学屏障、免疫细胞、补体系统以及其他体液免疫成分。尽管许多细菌易被宿主多层次的免疫反应杀灭并清除，但一些致病性和机会性细菌已进化出感染多种宿主细胞并逃避宿主免疫清除的机制1。Neisseria gonorrhoeae（淋病奈瑟菌）便是一种高度适应在人类宿主体内持续存在的细菌病原体。N. gonorrhoeae 易于定植于泌尿生殖道、咽部、结膜和直肠黏膜上皮细胞的管腔表面。定植过程会引发黏膜部位大量中性粒细胞的募集。中性粒细胞是专职吞噬细胞，具备多种抗菌机制以杀灭微生物；然而，N. gonorrhoeae 能够在中性粒细胞存在的情况下存活2-5。深入了解N. gonorrhoeae等细菌病原体如何逃避、抑制并劫持免疫反应，从而最终在通常具有杀伤性的宿主环境中存活，对于开发防治感染性疾病的新疗法至关重要。
常用于研究细菌在宿主细胞内存活的实验方案包括菌落计数法、庆大霉素保护法以及电子显微镜技术。在菌落计数法中，通过裂解被感染的细胞群体（例如使用细菌具有抗性的去污剂）释放出细菌。将裂解液进行稀释后接种于琼脂培养基上，对各时间点和/或实验条件下裂解液中的菌落形成单位进行计数。该方法可反映整个细菌群体的存活能力，但无法区分细胞内与细胞外的存活情况。作为菌落计数法的一种变体，庆大霉素保护法专门用于检测细胞内细菌的存活，其原理基于庆大霉素无法穿透真核细胞质膜6。然而，该方法依赖于细菌对庆大霉素（或具有类似真核膜不通透性的其他抗生素）敏感，且抗生素无法接触到细胞内部的细菌。因此，在研究某些细菌种类或在高度吞噬活性的细胞（如中性粒细胞）中评估细菌存活时，庆大霉素保护法可能不适用。上述两种方法均不能揭示单个细菌的亚细胞定位或其他行为（e.g. 细菌是否形成聚集体或微菌落，其行为是否与单个细菌细胞不同）。另一种常用于检测单个胞外和胞内细菌存活状态的方法是超薄切片透射电子显微镜（TEM）。该方法的优势在于可提供细菌在宿主细胞内位置的信息（e.g. 吞噬体、细胞质、自噬体），并通过针对亚细胞标志物的胶体金标记抗体进行免疫电镜进一步验证。然而，电子显微镜在评估细菌存活能力方面并不特别敏感。当包埋切片经醋酸铀、柠檬酸铅或其他电子致密试剂染色并进行电镜成像时，电子致密的细菌被视为存活，而电子透明的细菌则被视为非存活7,8。但这一判断标准会高估细菌的存活率，因为只有那些细胞膜严重破裂且胞质缺失的死亡细菌才会呈现电子透明。此外，某些细菌种类在其不同生长阶段可能表现出不同的电子密度，从而难以准确判断其存活状态。
作为这些广泛应用方法的替代或补充，本文提供了利用可指示细菌活性的荧光染料来评估附着于宿主细胞及被宿主细胞内吞的细菌存活情况的实验方案及其理论依据。为识别胞外细菌，首先将感染的细胞暴露于一种荧光试剂，例如凝集素或细菌特异性抗体。随后对感染细胞进行透化处理，并加入特异性结合DNA的染料，这些染料对细胞膜完整与膜已受损的细菌具有不同的通透性，从而作为细菌活性的替代指标。在第一种方案中，膜通透性染料SYTO9用于标记全部细菌群体，而碘化丙啶仅能进入细胞膜受损、因而被视为无活性的细菌。碘化丙啶与SYTO9已被用于评估生物膜中细菌的活性，区分致病性与非致病性细菌，并计数水传播的活菌9-12。在第二种方案中，4',6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记全部细菌，而SYTOX Green仅能进入无活性的细菌群体。这些活性染料组合可与免疫荧光技术联用，以确定每个细菌相对于特定目标蛋白的位置，例如用于界定细菌的亚细胞定位。采用这些检测方法可深入揭示感染过程中导致细菌被杀灭或存活的相互作用机制。本文所述方案曾用于评估附着于及存在于原代人中性粒细胞内部的N. gonorrhoeae的活性，包括存在于中性粒细胞不同群体吞噬体中的细菌5,13,14。然而，这些方案亦可广泛应用于评估革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在专职吞噬细胞、非专职吞噬细胞以及原生动物中的活性15-24。

<table><tbody><tr><td>用于采血的21 G 3/4蝶形针</td><td>Becton Dickinson</td><td>367251</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>含10 ml肝素钠的采血管</td><td>Becton Dickinson</td><td>366480</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌冲洗用水</td><td>Baxter</td><td>07-09-64-070</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>右旋糖酐500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S641</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>RDCD0200</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;或Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的Dulbecco磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3002802</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll溶液</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>12 mm圆形玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>人混合血清</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI培养基</td><td>Mediatech</td><td>15-040-CV</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>人白细胞介素-8</td><td>R&amp;D Systems</td><td>208-IL/CF</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 或 L7012</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 或 L7012</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Fluka Analytical</td><td>47036</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647标记的大豆凝集素</td><td>Life Technologies</td><td>L-32463</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠抗CD63单克隆抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>H5C6</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555抗体标记试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>A20187</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>镊子</td><td>EMS</td><td>78320</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT + 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

用于测定与哺乳动物细胞相关的细菌活力的荧光显微镜方法

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

细菌致病性研究的核心在于确定微生物在暴露于真核细胞后是否以及如何存活。目前用于回答这些问题的实验方法包括菌落计数法、庆大霉素保护法和电子显微镜法。菌落计数法和庆大霉素保护法仅能评估整个细菌群体的存活能力，无法判断单个细菌的活力状态。电子显微镜可用于评估单个细菌的存活情况，并提供其在宿主细胞内定位的信息。然而，细菌通常表现出不同的电子密度，使得活力判断较为困难。本文介绍了一系列使用荧光染料的实验方案，可揭示宿主细胞内及与宿主细胞相关的单个细菌的活力状态。这些方法最初用于评估淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）在原代人中性粒细胞中的存活情况，但应适用于任何细菌与宿主细胞相互作用的研究。这些实验方案结合使用膜通透性荧光染料（SYTO9 和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]），可对所有细菌进行染色，以及膜不通透性荧光染料（碘化丙啶和 SYTOX Green），后者仅能进入无活力的细菌。在对真核细胞进行膜通透化处理之前，加入抗体或荧光试剂以识别细胞外细菌。因此，这些方法能够区分黏附于真核细胞表面以及位于其内部的细菌的活力状态。本文还提供了一种将活力染料与针对真核细胞标记物的荧光抗体联合使用的方案，以确定单个细菌在细胞内的亚细胞定位。本文所讨论的细菌活力染料是对传统微生物学技术的灵敏补充或替代方法，可用于评估单个细菌的活力，并提供细菌在宿主细胞内存活位置的相关信息。

所概述的方案用于检测存活率 N. gonorrhoeae 暴露于原代人中性粒细胞后 5,26中性粒细胞被感染 N. gonorrhoeae 并采用方案1进行处理，使用绿色荧光活力染料SYTO9和红色荧光碘化丙啶（图 4A）。染料在皂苷存在下加入，皂苷可螯合胆固醇，从而优先通透宿主细胞质膜，而非 N. gonorrhoeae 膜。如果目标细菌的膜含有大量胆固醇，则可能需要测试其他去垢剂。所有 N. gonorrhoeae 用SYTO9染色，但只有膜受损的细菌才会被碘化丙啶染色。碘化丙啶的荧光会掩盖SYTO9的荧光，因此活细菌呈绿色，死细菌呈红色 27在某些细菌种类中，碘化丙啶可能无法完全抑制SYTO9的染色，导致死亡细菌呈现黄色或橙色。碘化丙啶与SYTO9的比例可能需要根据不同细菌种类进行优化。在对细胞进行透化处理并加入SYTO9和碘化丙啶之前，向感染的细胞中添加了偶联Alexa Fluor 647的豆粕凝集素，以检测细胞外的结构 N. gonorrhoeae 远红荧光信号...

细菌致病性研究的核心在于确定微生物在接触真核细胞后是否能够存活以及其存活机制。本文概述了使用荧光染料检测单个细菌在宿主细胞内及与宿主细胞相关时活力状态的实验方案。

细菌致病性研究领域的一个核心问题是确定微生物在接触真核细胞后是否能够存活以及其存活机制。目前的实验方案……

该荧光显微镜实验用于评估与宿主细胞相关的单个细菌的活力，并确定细菌在不同亚细胞位置中的存活状态。首先，为了识别外部细菌，将感染的细胞暴露于一种针对细菌通透酶的荧光试剂中，同时在存在可区分活菌与非活菌的荧光染料的条件下培养感染的宿主细胞，该染料依据细菌膜的完整性进行判断。随后，为了指示细菌在宿主细胞内的定位，将感染的细胞与一种荧光标记的抗体共同孵育，该抗体针对特定的目标标志物。获得的免疫荧光图像可用于确定宿主细胞内和细胞外活菌的比例，以及活菌与非活菌在亚细胞结构中的定位。与菌落计数法、庆大霉素保护法和电子显微镜技术不同，该方法可直接评估单个细菌的活性状态，还可揭示位于不同亚细胞区室中的细菌是否存在活性差异。接下来由我实验室的研究生 Brittany Johnson 演示该实验步骤：将感兴趣的细菌加入培养于24孔板中圆形玻璃盖玻片上的细胞，孵育所需时间。轻柔冲洗感染的细胞一次。然后加入 Alexa Fluor 647 标记的抗体或细菌特异性凝集素以检测胞外细菌，在室温避光条件下孵育10分钟。经过两次洗涤后，吸去培养基，加入含有细胞九和碘化丙啶的0.5毫升活死染色溶液。将细胞在室温避光条件下孵育15分钟，然后在MOPS氯化镁溶液中洗涤两次。将盖玻片朝下倒置在载玻片上。用透明指甲油封片。使用荧光显微镜及文本方案中所述的滤光片组，在30分钟内获取图像以标记细菌。在mors定义培养基中加入10微克/毫升的DPI，避光室温孵育20分钟。现在用DPI标记的细菌感染贴壁细胞。不要使用醛类或有机溶剂固定细胞。用缓冲液冲洗细胞一次。然后加入 Alexa Fluor 647 偶联的抗体或凝集素，在室温避光条件下孵育 10 分钟。用 mops 缓冲液冲洗两次后，加入 Alexa Fluor 555 偶联的针对目标亚细胞标志物的抗体，在室温避光条件下孵育 20 分钟。再次用 mops 缓冲液冲洗两次后，用含氯化镁的 mops 缓冲液洗涤细胞一次。随后吸去培养基，加入 0.4 微摩尔的 cyt green，于室温避光孵育细胞 5 分钟，然后用含氯化镁的 mops 缓冲液冲洗细胞两次。然后洗涤细胞，再用 MOPS 氯化镁溶液洗涤一次，持续五分钟。将盖玻片倒置在载玻片上，用透明指甲油封片，并在荧光显微镜下于30分钟内获取玻片的图像。在本实验中，人类中性粒细胞被淋球菌感染。Alexa Fluor 647 标记的大豆凝集素用于检测细胞外的淋球菌。随后在含有皂素的条件下加入绿色荧光活力染料以及红色荧光碘化丙啶，皂素可螯合胆固醇，优先穿透宿主细胞的细胞膜，但不会穿透感染细胞中淋球菌的膜结构，因此真核细胞核可同时被细胞质染料和碘化丙啶染色。这些淋病奈瑟菌感染的中性粒细胞图像使用活力染料 Cyt Talk Screen 和 Dpi 生成。未使用碘化丙啶染料，因为它在荧光显微镜的红色和紫外通道均会产生荧光。所有淋病奈瑟菌均可被 Dpi 染色，但仅细胞膜受损的细菌可被 Ox Green 染色。非活性的胞内细菌周围可见CD63的环状染色，该环状结构表明初级颗粒在该吞噬体处富集。而活性的胞内细菌则无CD63染色，表明其吞噬体处未发生初级颗粒的富集。已采集。综合来看，这些数据表明淋球菌的存活性与其在初级颗粒阴性吞噬体中的宿主细胞之间存在相关性。观看本视频后，您应能充分理解如何评估细菌在宿主细胞内的存活性。此外，您还将能够通过使用针对这些亚细胞区室的特异性抗体，确定定位于宿主细胞不同区室中细菌的存活性。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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