荧光显微镜方法测定细菌在协会的可行性与哺乳动物细胞
September 5th, 2013
中央细菌发病机理的字段是定义是否以及如何暴露于真核细胞中后微生物生存的能力。本文概述了使用，揭示内部以及与宿主细胞相关的各个细菌的生存能力荧光染料的协议。
该荧光显微镜实验评估与宿主细胞相关的单个细菌的活力，并确定细菌在不同亚细胞位置的活力。首先，为了识别外部细菌，将感染细胞暴露于细菌通透酶特异性的荧光试剂中，感染宿主在荧光染料存在下，根据细菌膜的完整性区分活细菌和非活细菌。然后，为了指示在宿主细胞内发现细菌的位置，将感染的细胞与目标标记物的荧光偶联抗体一起孵育。
所得免疫荧光图像可以确定宿主细胞内外活细菌的百分比，以及活菌与非活细胞内细菌的亚细胞定位。与菌落计数测定、庆大霉素保护测定和电子显微镜检查不同，该方法允许直接评估单个细菌的活力。它还可以揭示不同亚细胞区室中的细菌是否在活力上存在差异。
演示此程序的是我实验室的研究生 Brittany Johnson，他对在 24 孔板中的圆形玻璃盖玻片上培养的细胞感兴趣，添加感兴趣的细菌并孵育所需的时间。轻轻冲洗感染的细胞一次。然后加入 Alexa Fluor 6 4 7 偶联抗体或细菌特异性凝集素检测外部细菌，并在室温下避光孵育 10 分钟。
两次冲洗后，吸出培养基并加入 0.5 毫升含有细胞 9 和碘丙啶的活死细胞染色溶液。将细胞在室温下避光孵育 15 分钟，然后在氯化镁中冲洗两次。将盖玻片面朝下倒置在载玻片上。
用透明指甲油密封。使用荧光显微镜在 30 分钟内获取图像，并在文本方案中详细说明了滤光片组以标记细菌。在 mors 成分确定的培养基中加入每毫升 10 μg DPI，并在室温下避光孵育 20 分钟。
现在用 DPI 标记的细菌感染贴壁细胞。不要用醛或有机溶剂固定细胞。冲洗细胞一次。
然后加入 Alexa Fluor 6、4、7 偶联抗体或凝集素，在室温下避光孵育 10 分钟。用 mops 缓冲液冲洗两次后，添加针对目标亚细胞标志物的 Alexa Fluor 5 5， 5 偶联抗体，并孵育 20 分钟。两次后，用 mops 缓冲液冲洗 RIN，用 mops 氯化镁洗涤细胞一次。然后吸出培养基并加入 0.4 微摩尔 cyt green，在室温下避光孵育细胞 5 分钟，在拖把、氯化镁中洗涤细胞两次。
然后洗涤细胞。再在拖把氯化镁中浸泡 5 分钟。将盖玻片面朝下倒置在用透明指甲油密封的载玻片上，在 30 分钟内在荧光显微镜上获取载玻片的图像。
在这个实验中，人类中性粒细胞感染了淋病。Alexa Fluor 6 4 7 偶联大豆凝集素可检测细胞外淋病。然后绿色荧光活力死亡，并在皂苷存在下加入红色荧光碘化丙啶，皂苷螯合胆固醇优先渗透宿主细胞质膜，但不渗透感染细胞中的淋病膜，真核细胞核用细胞 9 和碘化丙啶染色。
这些淋病感染的中性粒细胞图像是使用活力染料 cyt talk 筛选和 dpi 生成的。未使用碘化丙啶染料，因为它在荧光显微镜上的红色和紫外线通道中都会发出荧光。所有淋病都用 dpi 染色，但只有膜受损的细菌用牛绿染色。
无活力的细胞内细菌在细菌周围有一圈 CD 63 染色。该环表示初级颗粒在该吞噬体中富集。活的细胞内细菌缺乏 CD 63 染色，表明初级颗粒未在其吞噬体中富集。采取。
总之，数据显示了淋病的活力与原代颗粒阴性吞噬体中的居民之间的相关性。看完这个视频后，您应该对如何评估宿主细胞中细菌的活力有了很好的了解。此外，您将能够通过使用针对这些亚细胞区室的抗体来确定定位于宿主细胞中不同区室的细菌的活力。
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概述
本文概述了使用荧光显微镜评估与宿主细胞相关的单个细菌生存能力的协议。详述的方法允许确定细菌在各种亚细胞位置的生存能力。
关键研究组成部分
科学领域
- 细菌致病机制
- 荧光显微镜
- 细胞相互作用
背景
- 了解细菌在宿主细胞中的存活对于研究感染至关重要。
- 荧光染料可以区分活性和非活性细菌。
- 传统方法可能无法直接评估单个细菌的生存能力。
- 本研究旨在改进对细菌在宿主细胞中行为的理解。
研究目的
- 开发一种评估宿主细胞中细菌生存能力的方法。
- 探索活性和非活性细菌的定位。
- 提供比现有的生存能力评估方法更准确的替代方案。
使用的方法
- 将感染的细胞暴露于特定于细菌通透酶的荧光试剂。
- 使用荧光染料区分活性和非活性细菌。
- 用荧光标记的抗体孵育以识别细菌位置。
- 分析免疫荧光图像以确定细菌生存能力。
主要结果
- 该方法允许直接评估单个细菌的生存能力。
- 结果表明，基于亚细胞定位的生存能力存在差异。
- 免疫荧光成像提供了细菌的清晰可视化。
- 这种方法在评估细菌生存能力方面超越了传统方法。
结论
- 开发的方法对研究宿主细胞中的细菌生存能力有效。
- 荧光显微镜可以揭示细菌致病机制的重要见解。
- 本研究增强了对微生物生存策略的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct quantification of individual bacterial viability within mammalian cells addresses a critical gap in infectious disease research and host-pathogen interaction studies. This fluorescence microscopy workflow enables precise mapping of viable versus non-viable bacteria at the subcellular level, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The approach enhances predictive confidence for translational research and informs risk-adjusted portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of bacterial survival mechanisms within host cell compartments.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable intracellular bacteria.
- Improves predictive confidence for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative imaging assays for downstream screening workflows.
- Standardizes viability assessment at the single-bacterium level for reproducibility.
- Enables robust comparison of compound effects on bacterial viability in host contexts.
- Supports scalable adaptation to diverse bacterial and host cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viability readouts with disease-relevant host-pathogen systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective strategies.
- Enables risk-adjusted advancement based on subcellular localization and survival data.
- Supports translational biomarker development for infection outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence microscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for infectious disease programs, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on bacterial survival and host defense mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible viability outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content imaging data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple bacterial species and host cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes viability assessment and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidate interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and validated fluorescent reagents.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various bacterial and mammalian cell models with protocol optimization.
- Dependent on careful timing and handling to preserve viability readouts.
