Name: 使用荧光显微镜可视化中的细菌线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 了解利用荧光显微镜观察线虫体内细菌共生体定位的方法。本研究通过荧光蛋白标记Xenorhabdus细菌，结合Steinernema线虫培养，揭示微生物与宿主共生关系的分布特征及生态机制。

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作者希望感谢 Eugenio Vivas、Kurt Heungens、Eric Martens、Charles Cowles、Darby Sugar、Eric Stabb 和 Todd Ciche 为本实验方案及相关工具的开发所做出的贡献。KEM 和 JMC 获得了美国国立卫生研究院（NIH）国家研究服务奖 T32（AI55397“健康与疾病中的微生物”）的支持。JMC 获得了美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金的支持。本研究得到了美国国家科学基金会（IOS-0920631 和 IOS-0950873）资助项目的支持。

1. 通过接合构建荧光标记细菌菌株
<ol>
	<li>将受体菌株（待检测的共生菌）和供体菌株在适宜条件下过夜培养。供体菌株通常为Escherichia coli，应具备通过接合转移传递DNA的能力，并已转化携带编码荧光蛋白基因的质粒（表2）。根据所用质粒的不同，可能还需使用接合辅助菌株。若需要，该辅助菌株也应进行过夜培养。供体菌株和辅助菌株应使用抗生素进行培养，以确保质粒的稳定维持。</li>
	<li>以1:100的接种比例，将供体、辅助及受体菌株转接到不含抗生素的营养丰富的培养基中进行二次培养。</li>
	<li>将各菌株在各自适宜的温度下培养至对数生长中期（OD600约0.6）。对于Xenorhabdus和E. coli，此阶段通常在二次接种后约3至4小时达到。具体时间可能因菌株或所用质粒不同而有所差异。</li>
	<li>将菌液在微量离心管中混合，于17,900 × g（大多数微量离心机中为13,000 rpm）离心2分钟。供体与受体菌株的最佳比例因组合不同而异，需通过实验确定。对于以Xenorhabdus为受体、E. coli为供体的情况，我们采用3:1或1:1的比例。若需要辅助菌株（例如E. coli），应以与供体菌株相同的比例加入。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>用30 μl新鲜培养基重悬菌体沉淀。</li>
	<li>将悬液点样于无抗生素的营养丰富的平板上，待液滴自然干燥。</li>
	<li>将平板倒置，在对受体细菌最适且供体（如有辅助菌株，则也包括辅助菌株）可耐受的温度下过夜培养。培养时间应至少为18小时。</li>
	<li>刮下菌斑，在含选择性抗生素的平板上划线以分离单菌落。所用抗生素应能抑制供体菌生长，同时允许携带质粒的受体菌生长。可能需要再进行一至两次划线分离，以获得纯培养物。</li>
	<li>通过检测受体菌特有的表型特征（如菌落形态）或通过聚合酶链式反应（PCR）检测受体特异性基因，确认所得菌落确为受体共生菌而非供体菌株。同时通过PCR扩增已知质粒序列以及检测荧光信号，验证菌落是否含有质粒。在对应荧光蛋白的激发波长下，阳性菌落应显示荧光。</li>
</ol>
2. 无菌线虫卵的制备
<ol>
	<li>将天然共生细菌接种于5 ml培养液中，过夜培养。起始培养时，可直接从冻存菌种或划线平板中将细菌接种至Lysogeny Broth（LB）或其他培养基中。</li>
	<li>取600 μl细菌培养物均匀涂布于10 mm Lipid Agar（LA）平板上29。对于大多数线虫种类，8至10个平板可提供足够的线虫数量。</li>
	<li>在25 °C黑暗条件下无湿培养两天。</li>
	<li>向细菌菌苔中加入5,000条感染期幼虫（IJs）或其他所需发育阶段的线虫，溶于500 μl培养液中。将平板置于25 °C培养3天。</li>
	<li>检查平板中是否存在成虫线虫和卵。取20 μl水滴加至显微镜载玻片上。使用无菌接种针从细菌菌苔上刮取少量线虫，将接种针放入水中，使线虫游离出来。在低倍镜下观察样本。有关形态特征的更多信息，请参见讨论部分及图2。</li>
	<li>若可见卵和雌虫，则继续操作；否则将平板在25 °C继续培养，并每隔6–12小时检查发育情况。当雌虫体内含有卵时，在平板表面加入数毫升水，轻轻旋转平板后将液体倒入50 ml锥形管中。线虫应从平板表面脱离，平板表面不再可见线虫。可能需要多次冲洗。</li>
	<li>让线虫在锥形管底部自然沉降。</li>
	<li>清洗线虫。用移液器吸除管顶多余液体，重新加入洁净水，待成虫线虫沉降后，再次吸除上清液。</li>
	<li>向锥形管中加满卵裂解液。一旦加入卵裂解液，后续所有步骤的时间必须严格按照描述进行，以获得最大卵产量。将锥形管置于轻微振荡条件下，准确孵育10分钟。大多数线虫应在孵育结束时被完全溶解。</li>
	<li>立即以1250 × g离心10分钟（包含加速至设定转速的时间，但不包含减速至0 × g的时间），使用离心机刹车功能。</li>
	<li>立即倾去上清液。</li>
	<li>立即用移液器将沉淀物重悬于卵裂解液中。</li>
	<li>立即用卵裂解液充满锥形管，颠倒混匀3–5次，随后立即按步骤2.10进行离心。</li>
	<li>立即倾去上清液。</li>
	<li>用移液器将沉淀物重悬于LB培养基中，并转移至15 ml锥形管中，以便在洗涤步骤中更有效地形成沉淀。LB为Steinernema spp.的标准培养基。根据所用线虫和细菌种类，也可选用其他缓冲液（例如最低盐培养基），但需确保缓冲液对线虫和共生细菌均无毒性。</li>
	<li>用LB充满锥形管，并按步骤2.10进行离心。</li>
	<li>吸除上清液后，用LB重悬沉淀物。</li>
	<li>重复步骤2.14和2.15，共清洗线虫3次。</li>
	<li>将重悬的线虫卵调整至适当体积，浓度应至少达到每微升10个卵。可在6 cm培养皿中加入5 ml含抗生素的LB培养基（抑制定植细菌生长），并将培养皿用Parafilm封口，使卵在其中保存至少4天。在接种至细菌菌苔前，需将卵在15 ml LB中清洗一次（如步骤2.13和2.14所述）。需注意，在此期间卵会逐渐孵化，用于定植实验时其发育阶段可能不同步。</li>
</ol>
3. 与荧光标记细菌的共培养实验
<ol>
	<li>如有必要，选择含质粒的荧光细菌过夜培养。</li>
	<li>用无菌涂布棒将 600 μl 细菌培养物均匀涂布于 10 mm 脂质琼脂平板上，在 25 °C 下孵育 2 天。</li>
	<li>将 500–5,000 个无菌线虫卵以总共 100 至 400 μl 的体积（最佳条件为 200 μl 中含 2,000 条线虫）接种至每个脂质琼脂平板上。</li>
	<li>在 25 °C 黑暗条件下孵育，不加湿，直至感染性幼虫（IJs）或其他目标发育阶段形成。IJs 会在平板边缘呈现为模糊的白色环状结构。如需观察其他生活史阶段，请参见方案 4。</li>
	<li>将平板置于改良的 White 捕虫装置30中。移去脂质琼脂平板的盖子，将底部置于一个空的 100 mm × 20 mm 培养皿底部内。向大培养皿中加入水或适用于您所用线虫的其他缓冲液，使小平板被液体包围，液面高度约为小平板高度的一半。</li>
	<li>继续孵育水捕装置，直至子代感染性幼虫完全进入缓冲液中。</li>
	<li>感染性幼虫线虫可保存于组织培养瓶的水中。</li>
</ol>
4. 筛选用早期生活阶段样本的采集
<ol>
	<li>使用步骤 3.1 至 3.4 设置实验。</li>
	<li>孵育培养板，直至出现所需的生活阶段。可能需要每日进行肉眼观察以确定时间。检查培养板时，采用方案 2.5 中描述的程序。对于在 LA 培养板上与 S. carpocapsae 共同培养的 X. nematophila 虫卵， gravid 雌虫将在 4–5 天内出现，幼虫将在 7 天内出现，而感染性幼虫将在 15–17 天开始产生。</li>
	<li>当所需的生活阶段出现后，收集样品。在 96 孔板的一个孔中加入 200 μl PBS 或其他适当的缓冲液。轻轻刮取含有线虫的细菌菌苔。约豌豆大小（~50 mg）的量在 F1 代子代产生后即可提供数百条以上的线虫，但若需更早时间点取样，可能需要更多材料。将刮取物放入含有缓冲液的孔中。</li>
	<li>孵育 30 秒至 1 分钟。取出接种棒并刮下残留物。用接种棒去除孔中的琼脂。线虫应在缓冲液中可见。将缓冲液混合物转移至干净的微量离心管中。</li>
	<li>使用左旋咪唑或其他麻痹剂处理线虫。将少量左旋咪唑晶体溶解于 30 μl 水中。每 50 μl 样品加入 1–2 μl 该溶液。经左旋咪唑处理后，线虫将失去活性。</li>
	<li>若样品需在后续时间观察，请按本步骤进行固定；否则跳至步骤 4.6。加入含 1X 缓冲液和 4% 多聚甲醛的固定液 200 μl。轻柔混匀，使用移液器吹打可能导致脆弱的生活阶段破裂。用铝箔包裹，在低速摇床上室温孵育至少 18 小时。</li>
	<li>将离心管置于试管架中，使线虫沉降到管底。</li>
	<li>清洗线虫以去除背景干扰。用移液器吸去上清液，加入 200–500 μl 缓冲液并轻柔混匀。重复该步骤。如需进一步降低背景，可重复数次。</li>
	<li>让线虫沉降到管底，然后重悬于所需体积的缓冲液中。</li>
	<li>若线虫未固定，应立即进行观察。固定的线虫可在冰箱中避光保存最多两周。</li>
</ol>
5. 通过显微镜筛选线虫与细菌的关联
<ol>
	<li>通过取少量混合液样本，在显微镜下观察部分线虫。</li>
	<li>为确保拍摄时线虫保持静止，需使用麻痹剂处理，具体操作见方案4.5。若不进行拍照或线虫已固定，则可跳过此步骤。</li>
	<li>取20–30 μl含线虫的水样滴加至显微镜载玻片上，盖上盖玻片。</li>
	<li>使用明场显微镜观察完整线虫，确保线虫位于视野范围内。</li>
	<li>使用显微镜的荧光模式观察线虫，所选荧光通道应与细菌表达的荧光相匹配。</li>
	<li>为确定细菌的定位，需在同一视野下分别拍摄荧光模式和明场模式的图像，然后将两幅图像叠加。可能需要尝试多种放大倍数和不同视野，以找到细菌的位置。</li>
	<li>可通过统计一群线虫中定植细菌的个体数量来量化线虫定植的分布情况，记录每条线虫是否存在细菌定植，并计算定植率百分比。建议每组（有或无定植）至少统计30条线虫，以获得可靠的数据。</li>
	<li>当群体中仅有少数线虫被定植时，可能需要统计数千条线虫才能观察到30条定植个体。对于高通量计数，请采用以下步骤。</li>
	<li>无需逐条计数，可将线虫群体分装至多孔板（e.g. 24孔板）中。待线虫沉降至孔底后，可在显微镜下逐孔扫描，并记录每孔中定植细菌的线虫数量。</li>
	<li>可通过孔内线虫的系列稀释法确定群体中的总线虫数。例如，向一孔中加入1 ml线虫悬液，用移液器枪头充分混匀，取出3 μl进行计数，以此推算该孔内线虫的总数。</li>
	<li>通过将定植线虫数除以孔内线虫总数，即可计算出定植线虫的百分比。</li>
</ol>
6. 典型结果
示例显微镜图像 斯氏线虫属 与线虫相关的 Xenorhabdus 细菌显示在 图3. 以生成所见的复合图像 图3A，相衬图像与荧光图像进行了叠加。箭头指示 图3A 表示感染性幼虫线虫体内的细菌（比例尺 = 100 μm). 图3B 以类似方式构建，显示一条幼年线虫，其肠道腔内分布有绿色荧光蛋白标记的细菌（绿色杆状物）（标尺 = 20 μm）。统计并记录来自两种培养基的线虫群体中被细菌共生体定殖的数量。表1）。为了获得可靠的统计结果，最好每样本计数至少100条线虫，且每个类别中至少包含30条。如图所示 表1这些线虫在脂质琼脂上培养时定植率约为14.6%，在肝肾琼脂上培养时定植率则为68.6%。其他线虫和细菌物种的定植水平也有所不同。例如 X. nematophila 定植于99%的 S. carpocapsae 感染性幼虫（Martens 2003），以及 P. luminescens 定植率为26% H. bacteriophora 感染性幼虫（Ciche 2003）。
<img alt="细菌-线虫相互作用示意图；实验装置；观察细菌对线虫的影响。" src="/files/ftp_upload/4298/4298fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 方法的示意图。A. 对细菌进行基因工程改造以表达荧光蛋白。B. 从成年线虫中分离线虫卵，以获得无菌线虫。C. 将无菌线虫与荧光细菌共培养。D. 在显微镜下观察所产生的各个发育阶段，以评估细菌在线虫体内的存在情况。
<img alt="线虫解剖示意图；标注了阴门、卵；细胞结构显微图像；生殖研究。" src="/files/ftp_upload/4298/4298fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 含卵成年雌虫的图示。A. 示意图显示了Steinernema雌虫的一般形态。插图：S. feltiae怀卵雌虫的微分干涉差显微（DIC）图像。黑色箭头指示阴门位置，白色箭头显示可见的卵。图像放大倍数为20倍，比例尺为100 μm。B. 发育完全但未孵化的S. feltiae线虫卵的DIC图像。图像放大倍数为40倍，比例尺为50 μm。C. 从S. feltiae线虫中分离出的卵在10倍放大下的DIC图像。比例尺为100 μm。
<img alt="显示神经活动荧光的秀丽隐杆线虫显微图像，神经系统功能示意图。" src="/files/ftp_upload/4298/4298fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3.线虫-细菌共生关系的显微镜图像示例。A.S. puntauvense 线虫与其表达绿色荧光蛋白（GFP）的共生细菌X. bovienii 相关联。该图像通过将同一视野下的相差图像与荧光图像叠加而成。箭头指示线虫宿主体内的荧光共生细菌。比例尺为 100 μm。B. 本图像显示一株幼年期的S. carpocapsae 线虫，其肠道内定植有表达GFP的X. nematophila 细菌。该图像是通过将荧光图像叠加在微分干涉相差（DIC）图像上构建而成。比例尺为 20 μm。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>菌株</td>
			<td>携带细菌的线虫数量</td>
			<td>计数的总线虫数</td>
			<td>定植线虫百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. puntauvense 脂质琼脂</td>
			<td>30</td>
			<td>205</td>
			<td>14.60%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. puntauvense 肝肾琼脂</td>
			<td>72</td>
			<td>105</td>
			<td>68.60%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 线虫群体中细菌定植情况的示例评分。 在本实验中，将无菌的 S. puntauvense 线虫与其表达GFP的共生菌分别在不同培养基（脂质琼脂和肝肾琼脂 32）上共同培养，以检测定植缺陷。每份样本至少统计并评分一百条线虫的细菌定植情况。为保证统计效力，应进行三次实验重复，且每个类别中至少包含30条线虫。
<img alt="质粒数据表，详细列出荧光蛋白、抗生素抗性盒、插入位点及复制相关说明。" src="/files/ftp_upload/4298/4298table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 2"> 
表 2. 含荧光蛋白的质粒。 以下按质粒名称列出可用于将荧光蛋白插入细菌共生体的潜在质粒。其他信息包括所编码的荧光蛋白、用于质粒维持的抗生素抗性盒、使用说明以及质粒来源。括号中注明的浓度为用于 X. nematophila 的抗生素浓度。这些质粒均已成功应用于 Xenorhabdus 或 Photorhabdus 中。更多详细信息可从所列参考文献中获取。根据待测细菌的不同，某些质粒可能因荧光蛋白类型、抗生素筛选方式、插入位点或复制起点的不同而无法发挥作用。上述所列质粒具有不同的特性，可能使其适用于目标细菌。例如，mini-Tn7-KSGFP 通过插入染色体上的 attTn7 位点实现整合，而 pECM20 则通过同源重组插入 X. nematophila 染色体。相比之下，pPROBE 系列质粒可在染色体外稳定维持，每种 pPROBE 质粒具有相同的骨架和荧光蛋白，但带有不同的筛选标记或复制起点，从而可在多种分类学背景或突变株中使用。

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未声明任何利益冲突。

本文所述方案提供了一种在线虫宿主内对细菌进行光学检测的方法图1）。该方法利用了线虫的光学透明性以及对细菌进行荧光标记的能力，从而实现 体内 线虫宿主内细菌的分析图3）。具体而言，该方法可确定细菌在其宿主内的定位。通过统计线虫群体数量并检测细菌的存在情况，可确定细菌在线虫群体中的定植频率（表1）。该方法是可用于研究线虫宿主与细菌共生体之间相互作用的多种潜在技术之一。此前已有相关方法被报道，用于分离细菌共生体、无菌培养线虫，以及对双方共生伙伴进行操作。 25-27.
本方案最初是在 Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae 模型系统中开发的14，类似的方法也已应用于其他昆虫病原性线虫-细菌共生体系9,15,17,18。若要将该方法推广至其他线虫-细菌系统，需满足若干条件。首先，细菌共生体必须能够从宿主中分离，并可在体外独立培养。其次...

<table><tbody><tr><td>脂质琼脂&lt;br/&gt; （无菌）</td><td></td><td></td><td>8克营养肉汤，15克琼脂，5克酵母提取物，890毫升水，10毫升0.2克/毫升氯化镁&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0、96 ml 玉米糖浆溶液*、4 ml 玉米油*&lt;br/&gt; 倒平板时搅拌培养基&lt;br/&gt; *高压灭菌后加入无菌成分 </td></tr><tr><td>玉米糖浆溶液&lt;br/&gt; （无菌）</td><td></td><td></td><td>7 ml 玉米糖浆，89 ml 水&lt;br/&gt; 混合并高压灭菌</td></tr><tr><td>卵液</td><td></td><td></td><td>16.6 ml 12% 次氯酸钠，5 ml 5M KOH，80 ml 水</td></tr><tr><td>溶菌肉汤&lt;br/&gt; （无菌）</td><td></td><td></td><td>5克酵母提取物，10克胰蛋白胨，5克盐，1升水&lt;br/&gt; 混合并高压灭菌</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Fisher</td><td>13-100-675</td><td>任何能够容纳微量离心管的微型离心机均可使用</td></tr><tr><td>离心</td><td>Beckman</td><td>366802</td><td>可容纳15 ml和50 ml离心管的大型台式离心机</td></tr><tr><td>无菌 60 mm X 15 mm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>0875713</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Fisher</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Fisher</td><td>05-531-6</td><td></td></tr><tr><td>无菌 100 mm × 20 mm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>0875711Z</td><td>比标准培养皿更深</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662000-06</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td></td><td></td><td>显微镜需要具备与所用荧光染料相匹配的荧光功能 </td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS&lt;br/&gt; （无菌）</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl&lt;br/&gt; 0.2 g 氯化钾&lt;br/&gt; 1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;高倍光学显微镜&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &lt;br/&gt; 0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &lt;br/&gt; 1 L 水 &lt;br/&gt;&lt;br/&gt; 调节pH至7.4，加水至1 L，高压灭菌</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-138</td><td>2 ml 或 1.5 ml 离心管</td></tr><tr><td>Shaker</td><td></td><td></td><td>任何能使液体轻柔晃动的摇床均可使用</td></tr><tr><td>二氨基庚二酸</td><td>Sigma</td><td>D-1377</td><td>如有需要，将培养基补充至浓度为 1 mM</td></tr></tbody></table>

使用荧光显微镜观察线虫中的细菌

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

共生是指两种或多种生物共同生活的关系，在生命的所有界中广泛存在。作为地球上最普遍的两类生物，线虫和细菌形成了多种多样的共生关系，这些关系从互利到致病不等1-3。其中一种典型的共生关系是Xenorhabdus细菌与Steinernema线虫之间的互利共生，这一系统已成为研究共生的模式体系4。Steinernema线虫具有昆虫病原性，依赖其细菌共生体来杀死昆虫5。为了在不同昆虫宿主之间传播，这些细菌会定植于线虫感染性幼虫阶段的肠道中6-8。最近的研究发现，其他几种线虫物种也被证实利用细菌来杀死昆虫9-13，并已开始探讨这些系统中线虫与细菌之间的相互作用9。
我们介绍一种利用线虫在显微镜下具有光学透明性的特点，来可视化其体内或体表细菌共生体的方法。通过基因工程使细菌表达荧光蛋白，从而可通过荧光显微镜对其进行观察。目前已有多种质粒可供使用，这些质粒携带编码在不同波长下发出荧光的蛋白质（例如绿色或红色）的基因，且将质粒从供体质粒Escherichia coli菌株接合转入受体细菌共生体在多种细菌中均能成功实现。本文所述方法最初用于研究Steinernema carpocapsae与Xenorhabdus nematophila14之间的共生关系。类似方法也已被用于研究其他线虫-细菌间的互作关系9,15-18，因此该策略具有广泛的适用性。
该方法可用于表征线虫在不同发育阶段体内细菌的存在及其定位，从而揭示共生关系的性质及定植过程14,16,19。显微分析可同时提供群体内定植频率以及细菌在宿主组织中的定位信息14,16,19-21。相较于其他监测线虫群体内细菌的方法（如超声处理22或研磨23），该方法具有优势，因为后者仅能提供平均定植水平，却可能无法区分高频率低共生菌载量的群体与低频率高共生菌载量的群体。在筛选或鉴定具有定植表型的细菌突变体时，区分定植细菌的频率与载量尤为重要21,24。事实上，荧光显微镜已被用于对细菌突变体进行高通量筛选，以发现其定植缺陷17,18，且相比超声处理22,25-27和单个线虫解剖28,29等其他方法更为省力。

为了研究Xenorhabdus细菌与Steinernema线虫之间的共生关系，研究人员开发了用于监测细菌在线虫体内存在情况及定位的方法。该实验方法可应用于其他系统，其核心步骤是通过基因工程使细菌表达绿色荧光蛋白，并利用荧光显微镜观察透明线虫体内的荧光标记细菌。

共生关系，即两种或多种生物共同生活的关系，在所有生命界中广泛存在。作为地球上最普遍的两类生物，……

本实验的总体目标是观察荧光标记的细菌共生体在其线虫宿主内的分布情况。该目标的实现首先通过接合方式将荧光蛋白标记到细菌上；第二步是通过收集卵来分离AIC线虫。接下来，将AIC线虫与其荧光标记的共生细菌共同培养，以实现两者的自然结合，最终确定共生细菌在线虫宿主体内的定位情况。通过荧光显微镜可确定线虫群体中发生此类共生关系的频率。该方法有助于回答共生研究领域中的关键问题，例如：细菌在宿主体内的定位于何处？宿主群体中细菌携带情况的分布如何？细菌菌株过夜培养后，按1比100的接种比例，将供体菌、受体菌和辅助菌分别转接至不含抗生素的营养丰富的培养基中，于各菌株适宜的温度下培养，直至菌液达到对数生长中期。随后，将上述菌液混合于同一微量离心管中，于17,900 ×g条件下离心2分钟，弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于30 µL新鲜培养基中。接着，将菌液悬液点样至无抗生素的营养丰富的平板培养基上，待悬液完全干燥后进行后续操作。将平板倒置，在对受体细菌最适且在适用情况下对供体和辅助细菌也允许的温度下过夜培养。然后，刮取菌斑并在选择性抗生素平板上划线以获得单菌落，从而得到纯培养的细菌划线，用于分离单个菌落。最后，确保所获得的菌落为受体共生菌，而非供体菌株。通过筛选受体特异性表型的存在。例如，可通过过氧化氢酶试验将锡诺阿比德氏菌（cino abdi bacteria）与大肠杆菌（e coli）区分开，并通过在对应于荧光质粒蛋白的波长下观察荧光来确认质粒的存在。将天然细菌共生体培养过夜后，取600微升菌液均匀涂布于8至10个直径为10毫米的脂质琼脂平板上，随后将平板置于25摄氏度、避光且无湿气的环境中孵育。两天后，向细菌菌苔中加入500微升含有5,000条感染性幼虫线虫的培养基。将培养板在25摄氏度下继续孵育三天后，取20微升水滴加到显微镜载玻片上。然后用无菌接种棒从细菌菌苔上刮取少量线虫。将线虫棒放入水中，使线虫游离出来。在低倍镜下观察此玻片。若可见卵和雌虫，当雌虫体内含有卵时，继续操作：在培养皿表面加入几毫升水，轻轻晃动培养皿，然后将水倒入50毫升锥形管中。线虫应从培养皿上脱落，且不再在培养皿表面可见。让线虫沉降到管底，然后用移液管吸去管顶部的过量水分，并用干净的水重新填充管子。待成年线虫沉降后，再次用移液管吸去多余水分，随后用卵液填充锥形管。然后在室温下轻轻倒置混匀各管，精确混匀10分钟。振荡后立即以1,250 ×g在室温下离心锥形管，离心时间精确为10分钟，并开启刹车。随后迅速倒掉上清液，用卵溶液通过移液吹打重悬沉淀，并用新鲜的卵溶液补满锥形管。通过倒置离心管三到五次充分混匀卵悬浮液，然后立即离心收集卵并倾去上清液，操作方法如前所示。使用移液器将沉淀重悬于misogyny、肉汤或LB培养基中，随后将卵悬浮液转移至15毫升锥形管中。现在用LB培养基加满15毫升管，采用与之前相同的快速步骤技术在肉汤中洗涤卵三次，最后将重悬的P线虫卵稀释至每微升至少含有10个卵。将卵转移至含有5毫升LB培养基和抗定植细菌抗生素的六厘米培养皿中。该培养皿在经过过夜培养并筛选出荧光细菌后，可用perfil包裹保存最多四天。使用无菌接种棒将600微升细菌培养物涂布于10毫米脂质小孔板上，并在25摄氏度下培养。两天后，将500至5,000个线虫卵接种到每个脂质平板上。如果平板 previously prepared bacterial lawns。然后将线虫与细菌的共培养物在25摄氏度、避光且无湿气的条件下培养，直至感染性幼虫在平板边缘形成一圈模糊的白色环状物。当观察到感染性幼虫后，取下脂质琼脂平板的盖子，将该平板底部放入一个空的 100 毫米 × 20 毫米培养皿的底部中。然后向该培养皿中加入足够的水，使水位达到较小平板高度的一半左右，随后继续培养，直至子代感染性幼虫进入水中为止。从水中或从合适细菌菌苔上收集目标生活阶段的线虫后，将少量ole颗粒溶于30微升水中，每50微升线虫样品加入一到两微升该麻痹剂。然后取约20至30微升已麻痹的线虫样品转移到显微镜载玻片上，并在样品上加盖盖玻片。使用光学显微镜观察线虫，确保线虫位于视野范围内。为了确定细菌的定位，需在荧光显微镜下对线虫进行拍照，同时结合明场显微镜成像，然后将两幅图像叠加。可能需要尝试多种放大倍数和线虫的不同视野，以找到细菌的位置。从两种培养基中分别收集线虫群体，并对其细菌共生体的定植情况进行计数和评分。为了获得可靠的统计结果，每个样本最好至少计数100条线虫，且每个类别中至少有30条线虫，如表中所示。这些线虫在脂质琼脂上培养时的定植率约为14.6%，在肝脏、肾脏琼脂上培养时则为68.6%。其他线虫和细菌物种已被证明具有不同的定植水平。该示意图展示了斯泰纳线虫（Steiner NEMA）雌虫的一般形态。插图显示了20倍放大下S fot graphic雌虫的微分干涉相差图像。插图中的黑箭头指示外阴，而白箭头指示可见的卵。该图像显示了一个发育完全但尚未孵化的伏特线虫卵，放大倍数为40倍；从伏特线虫中分离出的这些卵在10倍放大倍数下成像。此处第一张图像展示了与泽诺阿普图斯菌相关的施泰纳线虫的代表性显微图像。Alvin 的线虫与其表达 GFP 的细菌共生体相关联，从而生成了这幅复合图像。该图像是将相差图像与荧光图像叠加而成。箭头指示的是存在于感染性幼虫线虫体内的细菌。此图像显示了一条表达 GFP 的 X nla 细菌感染的 S carpa capsi 幼虫线虫。该图像的构建方式与前一幅图像类似，展示了幼虫线虫肠道腔内分布的绿色荧光蛋白标记细菌，表现为遍布线虫肠道腔的绿色杆状结构。除了上述描述的实验步骤外，还可结合其他方法，例如在线虫宿主与共生细菌建立关联之前对细菌进行遗传操作，以回答更多科学问题，例如：宿主与微生物关联所必需的分子机制是什么？

visualizing-bacteria-in-nematodes-using-fluorescent-microscopy

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用荧光显微镜可视化中的细菌线虫

我们介绍一种利用红色荧光脂溶性染料DiI（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）在活体C. elegans中可视化角质层的方法，该染料通常用于C.

可视化 秀丽隐杆线虫 使用亲脂性活体染料DiI观察角质层结构

来源： Chetrit, D., 等结合活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统 视频实验杂志.

荧光标记细菌的样品制备与成像

本视频展示了利用荧光标记神经元评估测试化学品对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

研究农药对Caenorhabditis elegans神经元的影响

透明的 C. elegans 肠道可作为“在体内 用于在多细胞管状结构形成过程中，在单细胞和亚细胞水平上研究顶-基底膜及管腔生物发生的组织腔室。本方案描述了如何结合标准标记、基因功能缺失/RNAi以及显微镜技术，在分子水平上解析这些过程。...

TheC. elegans肠道作为细胞间管腔形态发生的模型体内极化膜在单细胞水平上的生物发生：抗体标记、RNAi功能缺失分析与成像

荧光寿命成像可监测、量化并区分活体、衰老及应激状态下的秀丽隐杆线虫（C.

使用荧光寿命成像对衰老期间 C. Elegans 中的淀粉样蛋白结构进行表征

本文介绍了一种监测与光转换荧光蛋白Dendra2融合的亨廷顿蛋白降解的实验方案。...

利用光转化蛋白 Dendra2 在活体中定量分析衰老期间 C. Elegans 的蛋白质周转

动态微管成像方案 体内 使用荧光标记的末端结合蛋白对秀丽隐杆线虫后侧微管（PLM）神经元中动态微管进行标记、成像和分析的方法已得到描述。 秀丽隐杆线虫.

秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

将年轻的成年秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

检测杀虫剂对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）神经元的影响

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C.

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

本方案描述了一种在低温麻痹和表面漂白 以去除外部细菌后，对单个细菌定植的Caenorhabditis...

利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

本文描述了优化荧光显微镜成像参数的方法，以在活体线虫中以单神经元分辨率观察内源性标记货物的轴突运输过程。...

在活体Caenorhabditis elegans中通过荧光显微镜优化内源性货物轴突运输的可视化

了解利用荧光显微镜观察线虫体内细菌共生体定位的方法。本研究通过荧光蛋白标记Xenorhabdus细菌，结合Steinernema线虫培养，揭示微生物与宿主共生关系的分布特征及生态机制。

使用荧光显微镜观察线虫中的细菌

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