使用荧光显微镜可视化中的细菌线虫

该程序的总体目标是观察其线虫宿主内荧光标记的细菌共性。这是通过首先通过偶联用荧光蛋白标记细菌来实现的。第二步是通过收获卵来分离 AIC 线虫。

接下来，AIC 线虫与其荧光标记的细菌共体结合生长，以允许细菌共体最终在线虫宿主内的定位自然结合。线虫种群中这种关联的频率可以通过荧光显微镜来确定。这种方法可以帮助回答共生领域中的关键问题，例如细菌在宿主体内的什么位置，以及细菌携带在宿主种群中的分布如何？

细菌菌株过夜生长后，传代培养、供体受体和辅助菌株以培养物与培养基的 1 比 100 比例放入缺乏抗生素的营养丰富的生长培养基中，然后在适合每个菌株的温度下培养培养物，直到它们达到中期对数生长。接下来，将菌株混合到单个微量离心管中，并将混合培养物离心 2 分钟，以 17， 900 Gs 的速度倒出上清液，并将沉淀喷入 30 μL 新鲜培养基中。然后将悬浮液点在不含任何抗生素的营养丰富的培养基板上，并在悬浮液干燥后让斑点干燥。

将板倒置孵育过夜，温度最适合受体细菌，并且允许供体和帮助者（如果适用）。现在，在选择性抗生素平板上刮起斑点并划线寻找单个菌落，以获得纯细菌条纹培养物，即用于分离的单个菌落。最后，确保得到的菌落是受体 symbiant 而不是供体菌株。

通过筛选受体特异性表型的存在。例如，可以通过进行催化剂测试来区分 cino abdi 细菌与大肠杆菌，该催化剂测试通过确认与荧光质粒蛋白相对应的波长下的荧光来筛选质粒的存在。天然细菌 symbiant 生长过夜后，将 600 微升细菌培养物涂抹在 8 到 10 到 10 毫米的脂质曝气物上，然后在 25 摄氏度下在没有水分的黑暗中孵育板。

两天后，将 5， 000 个感染性幼年线虫添加到 500 微升培养基中到细菌草坪中。将板在 25 摄氏度下再孵育 3 天后，将 20 微升水放在显微镜载玻片上。然后用无菌棒从细菌草坪上刮出少量线虫。

将棍子放入水中，让线虫游走。在低倍率下查看此幻灯片。如果可以看到鸡蛋和雌性，当雌性含有鸡蛋时继续，在板表面放几毫升水，轻轻旋转板，然后将水倒入 50 毫升锥形管中。

线虫应该从板上脱落，在板表面不再可见。让线虫沉降到管子的底部，然后从管子顶部吸走多余的水，然后用清水重新填充管子。让成年线虫沉淀并再次吸走多余的水后，用鸡蛋溶液填充锥形管。

然后在室温下轻轻倒置混合试管 10 分钟。摇晃后，立即将锥形管在 1， 250 Gs 和室温下离心 10 分钟，并打开裂口。然后快速倒出上清液，通过移液用鸡蛋溶液重悬沉淀，并用新鲜的鸡蛋溶液填充锥形管。

试管倒置 3 到 5 次，然后立即沉淀鸡蛋并倾析上清液，如图所示，将鸡蛋悬浮液充分混合。通过移液将沉淀重悬于厌女症、肉汤或 LB 中，然后将鸡蛋悬液转移到 15 毫升锥形管中。现在用 lb 填充 15 毫升试管，使用与刚才演示的相同的快速步骤技术在肉汤中清洗鸡蛋 3 次，然后将重悬的 P 线虫卵稀释至每微升至少 10 个鸡蛋。

将鸡蛋转移到一个 6 厘米的培养皿中，该培养皿含有 5 毫升 LB 和抗定植细菌的抗生素。该板可以包裹在 perfil 中储存长达 4 天，用于过夜生长和荧光细菌选择。使用无菌棒将 600 微升细菌培养物涂布到 10 毫米脂质曝气物上，并在 25 摄氏度下孵育培养物。

两天后，将 500 至 5， 000 个线虫卵分配到每个脂质板上。如果板已储存，则在将鸡蛋接种到先前准备好的细菌草坪上之前，至少用 15 毫升 LB 清洗鸡蛋一次。然后将线虫菌在 25 摄氏度的黑暗中无水分共培养，直到感染性幼虫在板的边缘出现一个模糊的白色环。

当观察到传染性幼年时。取下脂质琼脂板的盖子，将板的底部放入 100 毫米 x 20 毫米的空培养皿的底部。然后在培养皿中装满足够的水，使其达到较小板高度的一半左右，并孵育水陷阱，直到后代感染的幼鱼出现在水中。

从水中或从适当的细菌草坪中收集处于所需生命阶段的线虫后，将几粒 ole 溶解在 30 微升水中，每 50 微升线虫样本加入 1 至 2 微升这种麻痹剂。然后将大约 20 至 30 微升的麻痹线虫样品转移到显微镜载玻片上，并在样品顶部放置盖玻片。使用光学显微镜观察线虫，以确保线虫在视野内。

确定细菌定位。除了光学显微镜设置外，还在荧光显微镜下拍摄线虫，然后叠加图像。可能需要尝试多次放大和观察线虫才能找到细菌。

对来自两种培养基的线虫种群进行计数，并通过细菌同源体进行定植评分。为了获得可靠的统计数据，最好每个样品至少计数 100 个线虫，其中至少 30 个属于表中所示的每个类别。这些线虫在脂质琼脂上生长时定植水平约为 14.6%，在肝脏、肾脏琼脂上生长时定植水平约为 68.6%。

其他线虫和细菌物种已被证明具有不同程度的定植。此示意图说明了 Steiner NEMA 母猪的一般外观。插图显示了 S fot 图形女性在 20 倍放大倍率下的微分干涉对比图像。

插图中的黑色箭头表示外阴，而白色箭头表示可见的卵。这张图片在 40 倍放大镜下显示了一个发育但未孵化的伏特线虫卵，这些从 S Volta 线虫中分离出来的卵在 10 倍放大镜下成像。在这里，第一张图像显示了与 Xeno aptus 细菌相关的 Steiner Nima 线虫的代表性显微镜图像。

Alvin 的线虫与表达 GFP 的细菌 symbiant expo 相关联，以创建此合成图像。相差图像与荧光图像重叠。箭头表示感染性幼年线虫中存在的细菌。

这张图显示了 GFP 表达 X nla 的 S carpa capsi 幼年线虫。该图像的构建方式与上一张图像类似，描绘了幼年线虫与绿色荧光蛋白标记的细菌，可视化为位于线虫肠腔中的绿色杆状物。除了所描述的程序之外，还可以结合其他方法，例如在与线虫宿主结合之前对细菌共生体进行遗传作，以回答其他问题，例如宿主微生物结合所需的分子机制是什么。