Name: 糖尿病家兔欣德肢体缺血的临床前模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 了解在糖尿病和高脂血症家兔中诱导后肢缺血的手术方法，建立外周动脉疾病的临床前模型。该模型通过血管造影评估缺血程度和血流恢复，为测试新疗法提供有价值的工具。

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作者感谢美国国防部国会指定研究计划（DOD CDMRP；W81XWH-16-1-0582）向ABB和RS提供的资助。作者还感谢美国心脏协会（17IRG33410888）、国防部国会指定研究计划（DOD CDMRP；W81XWH-16-1-0580）以及美国国立卫生研究院（1R21EB023551-01；1R21EB024147-01A1；1R01HL141761-01）向ABB提供的资助。

涉及动物的研究已获得德克萨斯大学奥斯汀分校和休斯顿UTHealth科学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）、美国陆军医学研究与物资司令部研究保护办公室下属的动物护理和使用审查办公室（ACURO）的批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）的动物护理指南进行。
1. 诱导糖尿病和高脂血症
<ol>
	<li>在四天内将新西兰兔（4–6月龄）的饲料从一杯标准苜蓿颗粒饲料逐步过渡至含0.1%胆固醇的饲料。第1至第5天分别采用标准饲料与含胆固醇饲料的比例为1:0、3:1、1:1、1:3和0:1。在喂食0.1%胆固醇饲料两周后，通过注射阿脲（alloxan）诱导兔子产生糖尿病，具体步骤如下所述。</li>
	<li>通过皮下注射35–75 mg/mL的氯胺酮和1–2 mg/mL的乙酰丙嗪对兔子进行镇静，并使用22号导管插入左耳缘静脉建立静脉通路，为后续静脉注射做准备。</li>
	<li>通过耳缘静脉导管接头处采集一滴血液，用于测定基础血糖水平（BGL），可使用任何标准血糖仪进行检测。兔子的正常血糖水平通常在80至150 mg/dL之间。</li>
	<li>将阿脲以100 mg/kg的剂量用生理盐水重悬至8 mL体积，通过耳缘静脉导管在8分钟内使用注射泵缓慢注射。</li>
	<li>在接下来的12小时内，每小时使用标准血糖仪检测一次BGL，以监测是否出现低血糖。
	<ol>
		<li>将兔子放入&#160;固定装置中。</li>
		<li>使用2.5%利多卡因/2.5%丙胺卡因乳膏对耳朵进行局部麻醉。</li>
		<li>使用27&#160;G针头从耳缘静脉采血，并使用标准血糖仪测量BGL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在前7天内每天测量两次BGL。若BGL达到或超过350 mg/dL，则给予兔子胰岛素注射。</li>
	<li>在手术前一天，准备一个直径3 mm的不锈钢球，作为血管造影时的尺寸标记物。
	<ol>
		<li>使用皮肤活检打孔器从较大的硅胶片上切下一块直径10 mm的圆形硅胶片。</li>
		<li>使用透明硅酮密封剂将钢球固定在硅胶片中央。</li>
		<li>用密封剂完全覆盖钢球，并静置使其固化至少24小时。</li>
		<li>将钢球放入一个开口的2英寸×3英寸低密度聚乙烯袋中，再将其装入灭菌袋，使用环氧乙烷气体进行灭菌处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 手术用家兔的准备
<ol>
	<li>通过皮下注射给予兔20–40 mg/kg氯胺酮和2 mg/kg咪达唑仑进行麻醉。使用面罩在整个初始镇静期间给予1.5%–3%异氟烷（通常为2%）。通过肌肉注射给予3 mg/kg阿法沙龙以维持麻醉。</li>
	<li>麻醉成功后，移除面罩，插入带套囊的气管导管至气道，并连接呼吸机。继续以1.5%–3%浓度给予异氟烷。</li>
	<li>从任一侧耳中央动脉采集血液，用于基线生化检查。</li>
	<li>在对侧耳缘静脉置入22 G耳静脉导管，用于手术全程输注乳酸林格液。也可选用生理盐水（0.9%氯化钠溶液）。</li>
	<li>利用另一侧耳的耳缘静脉，置入导管并以6 mg/kg/h速率输注阿法沙龙。在准备阶段逐渐将阿法沙龙剂量增加至8 mg/kg/h，同时将异氟烷浓度降低至0.6%。</li>
	<li>为减轻疼痛并降低感染风险，使用25 G针头皮下注射布托啡诺（0.01 mg/kg）和恩诺沙星（5 mg/kg）。</li>
	<li>使用电推剪（#40刀头）剃除颈部、左右内侧大腿及背部的毛发。背部去毛是为了确保与接地垫保持良好接触。</li>
	<li>在每条后肢上安装血压袖带并测量初始血压。将袖带置于膝关节下方，探头置于踝关节上方外侧表面。</li>
	<li>将兔仰卧位固定于手术台上，对手术区域进行消毒和铺巾。手术区域包括用于颈动脉通路的颈部以及用于股动脉通路的右侧大腿内侧。使用2%氯己定与70%乙醇交替擦拭进行消毒，重复三次，最后喷洒2%氯己定溶液。</li>
	<li>将已灭菌的3-mm不锈钢球置于低密度聚乙烯袋内，放置于右侧（已消毒）腿部大腿上部附近，作为血管造影测量时的尺寸参照。手术前用无菌巾覆盖腿部。首次血管造影期间，保持钢球位于无菌塑料袋内。</li>
</ol>
3. 血管造影术
<ol>
	<li>暴露右侧颈总动脉
	<ol>
		<li>使用带有#15刀片的手术刀，在气管外侧做一条4–5 cm长的切口。</li>
		<li>采用钝性分离法暴露颈总动脉，并用小型Weitlaner拉钩撑开切口。仔细将颈总动脉与颈静脉和迷走神经分离。通常使用弯头Metzenbaum剪刀和弯头蚊式止血钳进行钝性分离。务必确保颈总动脉与神经及颈静脉完全分离，以便结扎时仅结扎动脉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在暴露的动脉近端和远端分别用4-0丝线结扎。远端颈总动脉采用外科结加四个方结进行结扎。近端使用可调节结扎环（ligaloop），以便根据需要收紧或松解。在暴露的动脉近端放置结扎环有助于固定导引器和导管。</li>
	<li>通过静脉注射给予500 IU肝素。沿暴露的颈总动脉局部应用约0.5 mL的1%利多卡因，以扩张血管。通常一次处理即可，但可根据需要重复使用。使用手术刀或虹膜剪在颈总动脉上做半横切，然后将&#160;4英寸导丝插入工具置入动脉内。</li>
	<li>通过插入工具将0.014英寸×185 cm的导丝送至降主动脉髂嵴处的主动脉分叉部位。移除插入工具，沿导丝置入3F猪尾血管造影导管。</li>
	<li>将猪尾导管推进至降主动脉髂嵴处主动脉分叉近端2 cm处。</li>
	<li>将导管尖端定位在第七腰椎与第一骶椎之间。通过手动注入2–4 mL造影剂，验证导管位置。</li>
	<li>通过导管向动脉内注射100 μg硝酸甘油，以增强血管扩张。</li>
	<li>通过导管向兔体内注射0.8&#160;mL的1%利多卡因，以辅助血管造影期间的血管扩张。将注射器管路连接至导管，并排除管路中的所有气泡。使用自动血管造影注射器通过导管注入8–9 mL造影剂。</li>
	<li>采用血管造影技术连续采集后肢影像。
	<ol>
		<li>设置动力注射器以3 mL/秒的速度注入造影剂，总量为8–9&#160;mL。以每秒6帧的速度进行数字减影血管造影。</li>
		<li>选择生成的连续图像，对每幅血管造影图像进行调整，使用约-40%的设置以减少骨骼显影，完整显示对比剂灌注下的血管情况。图1（图1）展示了股动脉结扎/切除后血管血流的典型血管造影图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 股动脉的分离
<ol>
	<li>使用手术刀（#15 刀片）在右侧股动脉上方的皮肤上做一纵行切口。确保切口从腹股沟韧带起始，向下延伸至髌骨近端附近（约 6 cm）。</li>
	<li>使用弯头梅茨鲍姆剪刀或弯头蚊式止血钳进行钝性分离，以暴露股动脉。</li>
	<li>使用韦特兰牵开器保持切口开放。</li>
	<li>局部注射 0.5 mL 1% 利多卡因，以减少神经刺激并促进血管扩张。</li>
	<li>继续钝性分离组织，充分游离股动脉全长及其所有分支，包括腹壁下动脉、股深动脉、旋股外侧动脉和浅表腹壁动脉（图 2A）。</li>
	<li>进一步沿腘动脉和隐动脉以及髂外动脉进行分离（图 2A）。定期用生理盐水润湿操作区域，以防止组织损伤。若沿股动脉沟（肌肉之间）进行钝性分离，则无需切断肌肉。</li>
	<li>如 图 2B、C 所示，小心将动脉与静脉和神经分离。使用 4.0 丝线对图中所示动脉进行结扎，每处结扎放置两个结扎线，两线之间留有足够间距以便切断动脉。结扎时采用外科结，随后打四个方结。</li>
	<li>使用小型梅茨鲍姆剪刀在已结扎动脉的两个结扎线之间剪断。将股动脉从其作为髂外动脉分支的近端起始处，至远端分叉形成隐动脉和腘动脉的位置完整切除。</li>
</ol>
5. 重复血管造影
<ol>
	<li>使用4-0丝线将带有3毫米不锈钢球的硅胶片固定在股四头肌上部。将皮肤拉过钢球并覆盖其上。</li>
	<li>通过导管向动脉内注射100 μg硝酸甘油，以增强血管扩张。</li>
	<li>如有需要，通过导管向兔体内再注射0.8&#160;mL的1%利多卡因，以辅助血管造影期间的血管扩张。</li>
	<li>使用自动血管造影注射器注入8–9 mL造影剂。</li>
	<li>按照步骤3.9所述进行血管造影。</li>
</ol>
6. 伤口闭合与恢复
<ol>
	<li>移除右侧动脉的导管。使用已环绕在动脉周围的4-0丝线结扎该动脉。</li>
	<li>缝合两处伤口。使用带圆锥形针头的4-0聚二氧杂环己酮缝线或3-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物910缝线（见材料表），以连续缝合方式闭合肌肉层和皮下层。使用带反向切割针头的4-0聚二氧杂环己酮缝线或4-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物910缝线（见材料表），以埋入式连续皮下缝合方式闭合皮肤。 
	注意：如有条件，建议两种缝合均优先使用聚二氧杂环己酮缝线。</li>
	<li>使用带有25 G针头的注射器，在切口附近皮内注射0.25%布比卡因。进针后边退针边注射0.5 mL药液。颈部切口每侧伤口注射一次（共两次），腿部切口每侧伤口注射两次（共四次；总计六次注射）。总注射量为3 mL（0.5 mL × 6次注射）。</li>
	<li>皮下注射美洛昔康0.5 mg/kg和缓释型布伦诺啡0.12 mg/kg。</li>
	<li>密切监测兔子从麻醉中恢复的情况。兔子苏醒过程中会自动开始出现吞咽动作。一旦出现吞咽反射，即可拔除气管插管。持续密切观察并提供保温支持，直至兔子能够自主维持心血管功能和体温。当兔子能够自主行走时，将其送回饲养笼具。</li>
	<li>若术后兔子无法耐受普通饲料，应提供新鲜蔬菜和/或使用注射器饲喂重症护理营养饲料，并辅以皮下生理盐水注射。可选用卷心菜、西兰花、花椰菜、胡萝卜或其他应季蔬菜。将蔬菜切碎后混合，有助于促进兔子恢复进食。</li>
</ol>
7. 监测
<ol>
	<li>每两周对兔子进行一次麻醉，按照步骤 2.8 所述方法测量双侧后肢的血压。从耳中央动脉采集血液，用于血液生化检测。也可从隐静脉或头静脉采血。每个时间点采集约 2 mL 血液。使用标准血液生化检测项目进行分析。如有需要，可增加低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或糖化血红蛋白（HbA1c）的检测。</li>
	<li>采集少量血液用于血糖（BGL）测定。</li>
</ol>
8. 治疗
<ol>
	<li>准备十支含有治疗剂、载体和交联剂的注射器。在使用前立即向每支注射器中依次加入100 μL硫酸钙混悬液和100 μL含生长因子或其他治疗成分的2%海藻酸钠溶液，使海藻酸钠溶液位于注射器尖端一侧。</li>
	<li>每准备好一支注射器后立即进行一次注射，再准备下一支。此举可减少海藻酸钠在注射器内与硫酸钙接触的时间。注射部位应均匀分布在大腿股动脉两侧。为实现注射位置的均一性，可参照其他研究中所述方法19制作带有孔洞的硅胶片以引导注射定位。该硅胶片可使用皮肤活检打孔器在市售硅胶片上打孔制备。</li>
</ol>
9. 终点血管造影、安乐死、灌注固定及组织采集
<ol>
	<li>在实验终点日期，按照步骤3所述进行血管造影，但使用左侧颈动脉作为入路。</li>
	<li>血管造影完成后，将动物转移至解剖台，并进行灌注固定以保存后肢组织：
	<ol>
		<li>将异氟烷浓度提高至3%–4%，并进行足趾夹捏测试，确认麻醉深度足够。</li>
		<li>静脉注射1000–2000 IU肝素。</li>
		<li>使用带有#20刀片的手术刀，沿肋骨中线切开，切口延伸至横膈膜全长。</li>
		<li>暴露肋骨后，使用肋骨剪在中线左侧剪断肋骨。使用Weitlaner牵开器暴露心脏。</li>
		<li>准备灌注泵，连接内径为1/8英寸的输出管路，末端接18G针头。预先用生理盐水充满管路，并分别准备至少600 mL生理盐水和福尔马林溶液用于灌注。</li>
		<li>将连接至泵的18G针头经心尖插入左心室。另将一根18G针头（不连接任何装置）插入右心房，使血液流出并进入解剖台的负压排风系统。</li>
		<li>使用灌注泵控制约500 mL生理盐水以110 mL/min的流速灌注心脏。</li>
		<li>当从心脏流出的液体变澄清后，将管路从生理盐水储液瓶切换至盛有10%福尔马林溶液的容器。若灌注有效，四肢会出现抽搐反应。向左心室泵入约500 mL福尔马林溶液。</li>
		<li>关闭灌注泵，并从心脏移除针头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用带有#20刀片的手术刀围绕髋关节切割，将双侧后肢在髋部处离断。可使用小型肋骨剪辅助切除肢体。以非缺血侧肢体作为对照。</li>
	<li>将肢体置于福尔马林中4 °C固定24小时，随后转移至70%乙醇中4 °C保存。</li>
	<li>进行组织学分析时，从后肢多个部位取活检样本。我们曾在双侧后肢的大腿和小腿不同区域各取8个直径6 mm的活检组织。 
	注意：尽管踝部血压测量和血管造影是最常用的血流恢复评估方法，其他方法也可用于监测动物恢复情况，包括多普勒超声、激光多普勒成像、红外热成像62、微球法测定灌注量63,64、计算机断层扫描（CT）成像以及磁共振成像（MRI）65。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们提出了一种在患有糖尿病和高脂血症的家兔中诱导后肢缺血的临床前模型。在许多研究中，家兔后肢缺血模型的建立方法存在不明确之处。在小鼠中，后肢缺血的严重程度及恢复情况高度依赖于结扎部位以及诱导缺血所采用的技术。本研究中所介绍方法的意义在于，其能够在糖尿病动物中稳定地诱导出缺血，且在8周后仍无法完全恢复。值得注意的是，当动物被给予更高胆固醇和脂肪含量的饮食时，其肢体血压比可恢复至接近基线水平。此外，在高脂饮食条件下，动物的肝酶出现异常，提示存在肝损伤。因此，采用较低胆固醇/脂肪水平的糖尿病模型似乎是模拟肢体慢性缺血更为稳定且更具相关性的模型。
该模型包括四个关键步骤：糖尿病的诱导、血管造影、股动脉的手术结扎以及治疗干预的实施。其中，糖尿病的诱导是最关键的步骤之一，各实验室可能需要进一步优化该步骤。链脲佐菌素（alloxan）注射速率是影响其在兔体内诱导糖尿病毒性和有效性的主要因素。若注射过快，链脲佐菌素会导致血糖水平（BGL）不稳定，甚至引起兔子死亡。这种情况有时表现为无法通过右旋糖溶液注射缓解的低血糖，或在其他情况下出现极高的血糖水平。若注射过慢，则兔子往往无法成功诱导为糖尿病状态。...

外周动脉疾病（PAD）是一种常见的循环系统疾病，其特征是动脉粥样硬化斑块的进展导致肢体血管狭窄。近年来，糖尿病、肥胖和缺乏运动等动脉粥样硬化危险因素的增加，导致血管疾病的患病率不断上升1。目前估计，60岁以上普通人群中约有12%–20%患有外周动脉疾病2。外周动脉疾病的主要后果之一是外周缺血的发生，最常累及下肢。在严重情况下，患者可发展为危重型肢体缺血，表现为因血流严重不足而持续疼痛。诊断后一年内，危重型肢体缺血患者有50%的可能性接受单侧肢体截肢。此外，糖尿病患者发生外周动脉疾病的风险更高，且在接受血运重建治疗后预后更差3,4。目前治疗外周缺血的方法包括经皮介入治疗（如斑块旋切术和支架置入术）或外科旁路手术。然而，对于许多患者而言，这些治疗方法仅能提供短期疗效，且不少患者因全身状况不佳而无法耐受大型外科手术。在本研究中，我们描述了一种用于评估针对外周血管疾病新疗法的临床前动物模型，该模型通过在糖尿病病理背景下对兔子实施手术结扎，诱导其产生外周缺血。
兔后肢缺血模型已被用作阻塞性血管疾病的生理模型以及人类研究的临床前先导模型超过半个世纪5,6。由于兔踝部和小腿肌肉组织发达，与常见的有蹄类大型动物模型（具有蹄的动物）相比，兔常被优先选为外周缺血研究的物种。近年来多篇综述已探讨了该模型及其他模型在模拟人类外周血管疾病中的应用7,8。类似的兔后肢缺血模型已被用于生长因子9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20、基因治疗21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44以及干细胞45,46,47,48,49,50,51促进肢体治疗性血管新生的临床前研究中。然而，继这些成功的动物研究之后开展的临床试验并未显示出对患者具有显著益处52。
有研究提出的一种解释认为，人类患者外周缺血的病理状态本身就包含对促血管生成信号的抵抗性53,54,55,56,57,58,59。多项研究已证实，在糖尿病和高血糖状态下，促血管生成信号通路存在功能缺陷。糖尿病和高脂血症可导致硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的丢失，并增加降解硫酸乙酰肝素的酶活性，这可能是导致生长因子介导的治疗性血管生成/动脉生成产生抵抗的潜在机制60,61。因此，构建外周缺血模型的一个关键特征应包含治疗抵抗性，以便在与人类患者疾病状态相符的背景下评估治疗策略的有效性。
在本研究中，我们描述了一种通过手术结扎股动脉建立的兔外周缺血模型。该模型包含诱导糖尿病和高脂血症的前期阶段。我们将此模型与另一种采用高脂饮食但不诱导糖尿病的模型进行了比较，发现糖尿病合并轻度高脂血症的模型在抑制血管生成方面效果更显著。本模型整合了不同研究团队 previously 使用的技术改进，旨在为外周血管疾病研究提供一种实用且标准化的方法，以获得稳定一致的实验结果。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1537468 / 1531434</td><td>250 mL 袋装 / 1000 mL 冲洗瓶</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>VWR</td><td>BD309695</td><td></td></tr><tr><td>10% 福尔马林</td><td>Fisher-Scientific</td><td>23-245684</td><td></td></tr><tr><td>18G 针头</td><td>VWR</td><td>89219-294</td><td></td></tr><tr><td>20G 针头</td><td>VWR</td><td>89219-340</td><td></td></tr><tr><td>25G 针头</td><td>VWR</td><td>89219-290</td><td></td></tr><tr><td>27G 针头</td><td>VWR</td><td>89219-288</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>VWR</td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>5% 葡萄糖</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-800-9689</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙嗪</td><td>Patterson Veterinary</td><td>VEDC207</td><td></td></tr><tr><td>阿法沙龙</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-6051</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1471-1G</td><td></td></tr><tr><td>一水合阿脲</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7413</td><td></td></tr><tr><td>血管造影设备</td><td>Toshiba</td><td>Infinix-i</td><td></td></tr><tr><td>血管造影注射器</td><td>Medrad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠抗体 Alexa 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>免疫组化二抗</td></tr><tr><td>抗兔抗体 Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>免疫组化二抗</td></tr><tr><td>α-SMA 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>免疫组化一抗</td></tr><tr><td>拜耳灵</td><td>Bayer Animal Health</td><td>724089904201</td><td>恩诺沙星</td></tr><tr><td>血液生化检测面板</td><td>IDEXX</td><td>2616</td><td>兔用面板</td></tr><tr><td>血压袖带</td><td>WelchAllyn</td><td></td><td>Flexiport 一次性血压袖带 - 婴儿尺寸 7</td></tr><tr><td>血压监测仪</td><td>Vmed Technology</td><td></td><td>Vmed Vet-Dop2</td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>Henry Schein Medical</td><td>6023287</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Patterson Veterinary</td><td>42023017905</td><td></td></tr><tr><td>缓释丁丙诺啡（Buprenorphine SR）</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸钙</td><td>CB Minerals</td><td></td><td>食品级和药用级 USP 与 FCC</td></tr><tr><td>洗必泰擦洗液</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-4598</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher-Scientific</td><td>C298-4</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8503</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>耳静脉导管</td><td>Patterson Veterinary</td><td>SR-OX165</td><td>Surflo 静脉导管</td></tr><tr><td>气管内插管</td><td>Patterson Veterinary</td><td></td><td>Sheridan 品牌，根据兔体型选择</td></tr><tr><td>血糖仪</td><td>Amazon</td><td>B001A67WH2</td><td>Accu-Chek Aviva</td></tr><tr><td>血糖试纸</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>788222</td><td>Accu-Chek Aviva Plus</td></tr><tr><td>导丝</td><td>Boston Scientific</td><td>39122-01</td><td></td></tr><tr><td>毛发剪刀</td><td>Amazon</td><td>B000CQZI3Q</td><td>Oster #40 刀头</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Cincinnati Subzero</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>加热垫泵</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Gaymar T/Pump</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td>弯头蚊式止血钳</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Patterson Veterinary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>插入工具</td><td>Merit Medical Systems</td><td>MAP550</td><td>金属丝插入工具</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>HPB Pharmacy</td><td></td><td>Novalin R &amp; Novalin N</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>942674</td><td></td></tr><tr><td>导引器</td><td>Cook Medical</td><td>G28954</td><td>3F Check Flo Performer 导引器</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1100734</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Patterson Veterinary</td><td>856440301</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格氏液</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>186662</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>239936</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因/丙胺卡因乳膏</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>761240</td><td></td></tr><tr><td>Ligaloop</td><td>V. Mueller</td><td>CH117 / CH116</td><td>白色迷你 / 黄色迷你</td></tr><tr><td>Mazola 玉米油</td><td>Amazon</td><td>B0049IIVCI</td><td></td></tr><tr><td>Medrad 注射器</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>346920</td><td>150 mL</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Patterson Veterinary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金属球缝线</td><td>Ethicon-Johnson &amp; Johnson</td><td>K891H</td><td>4-0 丝线 C-1 30&quot;</td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14019-13</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1215470</td><td></td></tr><tr><td>硝酸甘油</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>927528</td><td></td></tr><tr><td>PECAM 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-562</td><td>免疫组化一抗</td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>猪尾导管</td><td>Merit Medical Systems</td><td>1310-21-0053</td><td>3F 猪尾导管</td></tr><tr><td>聚对二氧环己酮（PDS II）缝线</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>129271</td><td>4-0 圆锥形 RB-1（针附于缝线上）</td></tr><tr><td>聚对二氧环己酮（PDS II）缝线</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>129031</td><td>4-0 反向切割 FS-2</td></tr><tr><td>聚乳酸-910（Vicryl）缝线</td><td>Butler</td><td>7233-41</td><td>3-0 圆锥形 RB-1</td></tr><tr><td>聚乳酸-910（Vicryl）缝线</td><td>McKesson</td><td>104373</td><td>4-0 反向切割 FS-2</td></tr><tr><td>兔粮（苜蓿）</td><td>LabDiet</td><td>5321</td><td></td></tr><tr><td>兔固定器</td><td>VWR</td><td>10718-000</td><td></td></tr><tr><td>肋骨剪</td><td>V. Mueller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td>#15 刀片</td></tr><tr><td>丝线缝线</td><td>Ethicon-Johnson &amp; Johnson</td><td>A183H</td><td>4-0 丝线结扎 18&quot;</td></tr><tr><td>不锈钢球</td><td>McMaster-Carr</td><td>1598K23</td><td>直径 3 mm</td></tr><tr><td>手术铺巾</td><td>Gepco</td><td>8204S</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>DRE Veterinary</td><td></td><td>Versaflow VF-300</td></tr><tr><td>Visipaque 对比剂</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>509055</td><td></td></tr><tr><td>Weitlaner 牵开器</td><td>Fine Science Tools</td><td>17012-13</td><td></td></tr></tbody></table>

糖尿病兔后肢缺血的临床前模型

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

外周血管疾病是一种影响全球数百万患者的常见临床问题。外周血管疾病的主要后果之一是缺血的发生。在严重情况下，患者可能发展为肢体严重缺血，表现为持续性疼痛，并面临更高的截肢风险。目前针对外周缺血的治疗方法包括旁路手术或经皮介入治疗，例如支架植入术下的血管成形术或斑块切除术，以恢复血流。然而，这些治疗常因血管疾病持续进展或再狭窄而失败，或由于患者整体健康状况较差而存在禁忌证。一种有前景的治疗外周缺血的潜在方法是诱导治疗性新生血管形成，使患者能够发展出侧支血管系统。这一新形成的血管网络可通过恢复受累区域的灌注来缓解外周缺血。目前最常用的外周缺血临床前模型是在健康兔中通过股动脉结扎建立后肢缺血模型。然而，过去在治疗外周缺血的临床前研究成功与临床试验失败之间存在显著脱节。健康动物在手术诱导的缺血后通常表现出较强的血管再生能力，而慢性外周缺血患者则表现为血管生成能力减弱和再生能力下降。本文介绍了一种在兔中外周缺血的优化动物模型，该模型结合了高脂血症和糖尿病。与高胆固醇饮食模型相比，该模型的侧支血管形成减少，血压恢复能力下降。因此，该模型可能更贴近伴有常见合并症导致血管生成受损的人类外周血管疾病患者，具有更好的临床相关性。

在诱导糖尿病并开始0.1%胆固醇饮食后，糖尿病联合胆固醇饮食兔的总胆固醇水平在所有时间点和个体中平均为123.3 ± 35.1 mg/dL（n = 6只雄性兔）。这些兔的血糖水平（BGL）为248.3 ± 50.4 mg/dL（n = 6只雄性兔）。典型兔的血液生化指标及下肢血压比值的时间进程如图3所示，并与接受高胆固醇饮食（1%胆固醇）的兔进行了比较。在非糖尿病动物中，即使胆固醇水平较高，我们在最终时间点仍发现缺血肢体的血压恢复能力增强，血管造影显示血管密度增加（图3）。接受高胆固醇/高脂肪饮食的动物还表现出脂蛋白A水平升高，提示肝脏承受压力。因此，在研究终点，糖尿病联合较低胆固醇水平导致更严重的灌注受损。组织学上，在某些部位可见与水肿和缺血性损伤一致的肌肉结构改变（图4）。在某些情况下，可观察到因缺血引起的肌纤维改变或损伤。这在组织学分析中表现为肌纤维的缺失或破坏，类似于在某些小鼠后肢缺血模型中所观察到的现象。然而，需谨慎区分这些改变与组织处理过程中可能产生的组织学假...

我们描述了一种用于在高脂血症和糖尿病兔模型中诱导外周缺血的外科手术方法。该手术可作为外周动脉疾病患者临床前研究的模型。同时介绍了血管造影术，用于评估所诱导缺血的程度以及灌注恢复情况。

外周血管疾病是一种影响全球数百万患者的常见临床问题。外周血管疾病的主要后果之一是……

外周动脉疾病的一种再生治疗方法将极为有益，而此动物模型可能能够更好地测试实验性治疗在人类患者中是否有效。我们的操作旨在提出一种改进的模型，该模型能更准确地模拟糖尿病或高脂血症患者所遇到的治疗抵抗情况。该动物模型可用于测试外周缺血的新疗法，并提供一种对缺血具有受损新生血管形成能力的临床前模型。在确认麻醉状态下四至六个月大的糖尿病合并高脂血症兔对后肢足垫夹捏无反应后，使用带15号刀片的手术刀，在气管右侧旁开处作一个4至5厘米长的切口，通过钝性分离暴露右侧颈总动脉。使用小型Weitlaner拉钩撑开切口，仔细分离颈总动脉与颈静脉及迷走神经。当颈动脉完全与神经和颈静脉分离后，在暴露的动脉近端和远端各放置一根4-0丝线缝合线，并用外科结加四个方结结扎颈动脉的远端。在近端则使用血管硅胶结扎线，以便根据需要收紧或松解血管。接下来，沿暴露的颈动脉和神经周围注射约0.5毫升1%利多卡因，以促进血管扩张并减少神经刺激。静脉注射500国际单位肝素。将一根4英寸的导丝插入工具置入动脉。通过该插入工具送入一根0.014英寸×185厘米的导丝，直至降主动脉髂嵴处的主动脉分叉。沿导丝推进一根3 French猪尾血管造影导管。将猪尾导管推进至降主动脉髂嵴处主动脉分叉近端2厘米处，使导管尖端位于第7腰椎与第1骶椎之间。通过手动注射2至4毫升造影剂来检测导管位置。确认位置正确后，经导管给予100微克硝酸甘油进行动脉内注射，以增强血管扩张。随后经导管注射0.8至1毫升1%利多卡因，以辅助血管扩张，并用肝素化生理盐水冲洗导管。将自动血管造影注射器的管路连接至导管，并确保排尽管路中的空气。使用自动血管造影注射器以每秒3毫升的速度经导管注入9毫升造影剂，并以每秒6帧的速度进行数字减影血管造影。选择序列图像，并将血管造影图像调整为-40%的设置，以最小化骨骼影像的显示，从而完整捕捉血管灌注的造影图像。为分离股动脉，使用15号手术刀片在右侧股动脉上方做一纵向皮肤切口，确保切口从腹股沟韧带起始向下延伸，止于髌骨近端附近区域。采用钝性分离暴露股动脉，并使用韦特兰纳拉钩撑开切口。局部注射约0.5毫升1%利多卡因，以减轻神经刺激并促进血管扩张。继续钝性分离组织，游离股动脉全长及其所有分支，包括腹壁下动脉、股深动脉、旋股外侧动脉和腹壁浅动脉。沿腘动脉、隐动脉以及髂外动脉进行解剖，期间定期用生理盐水润湿操作区域，以防止组织损伤。仔细将股动脉与股静脉及股神经分离，并在股动脉上放置两根4-0丝线缝线，两缝线之间留出足够间距，以便后续切断动脉。然后使用小型梅岑鲍姆剪刀在结扎动脉的两道结扎线之间剪断。从股动脉分叉形成隐动脉和腘动脉处开始，向近端游离，结扎并切除沿途的侧支，将股动脉一直游离至腹壁浅动脉下方。对于重复血管造影，使用带有固定好的3毫米不锈钢球的硅橡胶片。使用4-0丝线将不锈钢小球固定在股四头肌上部。小球就位后，将皮

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糖尿病家兔欣德肢体缺血的临床前模型

展示了诱导单侧后肢缺血的手术操作，并通过激光多普勒血流成像证实缺血效果。...

下肢缺血小鼠模型

我们开发了一种微创技术，通过分离中央动脉和神经以及颅侧神经血管束，建立兔缺血性耳部伤口模型。随后，通过皮下隧道切断所有皮下组织。该手术对皮肤的损伤极小，可安全用于糖尿病动物。...

一种简化的小鼠缺血性伤口模型制备技术

本视频介绍了通过向兔模型的降主动脉注射造影剂以实现血管造影的技术，用于观察血管灌注情况。该技术有助于理解血管在发生阻塞以及治疗后恢复期间的灌注状态。...

通过血管造影评估血管灌注：一种在兔模型中向降主动脉注入造影剂以可视化血管灌注的技术

在本视频中，我们演示了一种通过结扎兔股动脉诱导外周缺血的外科手术方法。该方法为外周血管疾病研究提供了一个有效的实验模型。...

一种外周缺血的实验模型：通过兔股动脉结扎诱导外周缺血的操作方法

关键词：外周缺血，股动脉结扎，兔模型，缺血再灌注，血管疾病，实验外科

在小鼠中通过手术诱导后肢缺血有助于研究血管生成，但在某些近交系小鼠中，该方法受到限制，因为这些品系会出现明显的缺血诱导性组织坏死。本文描述了一种使用缩窄环（ameroid...

小鼠后肢急性与亚急性缺血模型的建立方法

动脉粥样硬化的动物模型对于理解其发病机制以及探索预防斑块形成或破裂的新方法至关重要，而斑块破裂是工业化国家主要的死亡原因之一。本方案采用球囊损伤联合高胆固醇饮食的方法，在兔髂动脉中诱导形成动脉粥样硬化斑块。...

髂动脉球囊损伤的兔动脉粥样硬化加速模型：方法学视角

本实验方案旨在通过使静脉承受动脉血压，实验性地建立静脉内膜增生模型，以开发在使用静脉移植进行血管重建手术后减轻静脉内膜增生的策略。...

一种模拟使用静脉移植物进行血管重建手术的兔静脉移植模型，用于评估动脉血压下的内膜增生

本文展示了一种通过小切口在小鼠体内建立急性缺血的高效手术方法。该方法无需对实验室进行任何升级改造，大多数研究团队均可应用。...

一种改良的ApoE基因敲除小鼠后肢缺血外科模型-/- 采用微型切口的小鼠手术

连续动脉血压记录可用于研究各种血流动力学参数的影响。本报告展示了在缺血性卒中的大型动物模型中应用连续动脉血压监测，以确定卒中的病理生理机制、不同血流动力学因素的影响，以及评估新的治疗策略。...

缺血性卒中兔模型中血压的实时监测与调控

本研究展示了一种在兔子中建立急性区域性心肌缺血和再灌注损伤的动物模型，该模型具有高度可重复性，适用于通过左侧小切口开胸术进行存活实验，或通过正中胸骨切开术进行非存活实验。...

兔缺血-再灌注损伤模型

了解在糖尿病和高脂血症家兔中诱导后肢缺血的手术方法，建立外周动脉疾病的临床前模型。该模型通过血管造影评估缺血程度和血流恢复，为测试新疗法提供有价值的工具。

糖尿病兔后肢缺血的临床前模型

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