Name: 的系统分析体外细胞滚动使用多孔板微流控系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 了解多孔板微流控系统用于细胞滚动研究的高通量方法。该系统可在生理相关剪切流下精确控制流体，显著减少试剂消耗，为细胞归巢机制和细胞治疗研究提供高效平台。

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CHO-P 细胞由 Barbara Furie 博士（哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心）惠赠。本研究工作获得了美国国立卫生研究院资助项目 HL095722（资助对象：J.M.K.）的支持。此外，本工作还部分得到了 Movember-前列腺癌基金会挑战奖（资助对象：J.M.K.）的支持。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>人早幼粒细胞白血病（HL-60）细胞
	<ol>
		<li>在75 cm2 培养瓶中加入15 ml含20%（v/v）胎牛血清（FBS）、1%（v/v）L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素-链霉素的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM），培养HL-60细胞。</li>
		<li>每3天更换一次培养基，吸除一半细胞悬液后，补充等体积的新鲜完全IMDM培养基。</li>
		<li>进行羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色时，将HL-60细胞悬液离心（400 × g，5分钟），弃上清后重悬于预热PBS中配制的1 μM CFSE溶液，37 °C孵育15分钟。随后离心细胞，吸除上清液，将细胞重悬于新鲜预热培养基中孵育30分钟。用PBS洗涤细胞后，用于滚动实验（参见图1B，显示CFSE标记的HL-60细胞在P-选择素包被表面的代表性图像）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
注意：CFSE 染色为可选步骤，此处展示旨在说明微流控通道中的滚动现象。本文所呈现的滚动参数分析是利用标准明场成像对未染色细胞进行的。
<ol start="2">
	<li>肺微血管内皮细胞（LMVECs）
	<ol>
		<li>用0.1%明胶溶液（PBS中v/v）包被100 mm培养皿，在37 °C下孵育至少30分钟。</li>
		<li>在经明胶包被的100 mm培养皿中，使用完全内皮细胞生长培养基（内皮基础培养基-2（EBM-2））培养LMVECs，并添加特定生长补充剂试剂盒（参见试剂部分）。每隔一天更换一次培养基，当细胞融合度达到80–90%时进行传代培养。</li>
		<li>传代时，先用PBS洗涤细胞，然后加入4 ml 1×&#160;胰蛋白酶-EDTA，在37 °C下消化3分钟，再用等体积的完全EBM-2培养基中和。将细胞悬液转移至15 ml离心管中，离心（400 × g，5分钟）。离心后，将沉淀重悬于1 ml完全内皮细胞培养基中，用血细胞计数板计数细胞。避免过度传代，因为这会影响细胞的形态和功能——所有实验仅使用传代次数低于7代的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="3">
	<li>中国仓鼠卵巢-P-选择素（CHO-P）细胞
	<ol>
		<li>CHO-P 细胞是稳定转染以表达人 P-选择素（P-sel）的 CHO 细胞，由合作者提供（哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心）11,12。</li>
		<li>在 T175 cm2 培养瓶中加入 25 ml F-12 培养基培养 CHO-P 细胞。</li>
		<li>传代时，用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 4–5 秒，随后在 37 °C 下用 10 ml 1× 胰蛋白酶-EDTA 消化 3 分钟，接着用完全培养基中和。</li>
		<li>将细胞悬液离心（400 × g，5 分钟），小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml 完全培养基中，并用血细胞计数板计数细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 集成多孔板微流控系统的操作
<ol>
	<li>确保所有设备正确连接，并开启各个模块：计算机、控制器、倒置显微镜和CCD相机。</li>
	<li>打开成像软件；确保屏幕上正确显示多孔板模块和成像模块。</li>
	<li>将管路连接至蒸气捕集器（连接至控制器），并同时将其连接至压力接口。</li>
	<li>将多孔板放入板加热器/适配器中。向孔中加入试剂（如下所述），并在板上方安装接口。将板放置于自动载物台上进行成像。</li>
	<li>该接口安装在板的顶部，通过控制器向各孔顶部施加气动压力，从而以设定的流速推动液体流经微流控通道，流速可通过多孔板模块界面的手动模式轻松控制。</li>
	<li>试剂在通道中流动，经过位于孔之间的观察区域。微流控通道尺寸为350 μm宽 ×&#160;70 μm高。线性通道长度为1 mm，通道底部由180 μm的盖玻片玻璃构成，适用于明场、相差、荧光和共聚焦显微镜观察。</li>
	<li>使用CCD相机（连续采集，11帧/秒）采集视频，并通过兼容软件进行分析。</li>
</ol>
3. 蛋白质基质或细胞单层对微流控通道的包被
<ol>
	<li>用纤连蛋白或 P-/E-选择素包被微流控通道
	<ol>
		<li>在 PBS 中配制 1 ml 浓度为 20 μg/ml 的纤连蛋白溶液。根据需包被的通道数量调整体积（每个通道使用 25–50 μl 纤连蛋白）。</li>
		<li>向每个入口孔中加入 25–50 μl 纤连蛋白溶液。施加 2 dyn/cm2 的剪切力，灌注通道 5 分钟。请注意观察出口孔中出现的液滴。室温下孵育 30–45 分钟。</li>
		<li>从孔中吸除溶液（切勿直接从为通道供液的中间孔吸液）1,13。向出口孔中加入 200–500 μl PBS，并施加 2 dyn/cm2 的剪切流 5 分钟，以 PBS 洗涤通道。此时通道已成功包被纤连蛋白，可直接使用。</li>
		<li>若需使用 P-或 E-选择素包被，将所需的人重组蛋白溶于 PBS，配制成 5 μg/ml 的溶液，并按上述步骤包被通道，于 37 °C 孵育 1 小时，以完成表面包被。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在微流控通道内形成 CHO-P 或 LMVEC 单层
	<ol>
		<li>将细胞从培养皿中轻柔消化 3 分钟，用两倍体积的完全培养基终止消化，离心（400 × g，5 分钟）。用 10 ml 完全培养基重悬细胞，再次离心（400 × g，5 分钟）。</li>
		<li>计数细胞以确定悬液中的细胞浓度。为确保通道内形成融合的 LMVEC 单层，将细胞浓度调整至 1500–2000 万个细胞/ml；对于融合的 CHO-P 细胞单层，则使用 5000–6000 万个细胞/ml。每个通道使用 25–50 μl 细胞悬液——根据此参数确定实验所用的初始细胞数量。</li>
		<li>将适当浓度的 25–50 μl 细胞悬液加入入口孔。将培养板置于显微镜载物台上，以 2 dyn/cm2 的流速将细胞引入通道，直至显微镜视野中观察到细胞完全充满通道，随后停止流动。</li>
		<li>向出口孔和入口孔均加入 200 μl 完全 LMVEC 培养基或 CHO 培养基。将培养板放入培养箱中（37 °C，5% CO2），静置 3 小时，使细胞沉降并贴壁。</li>
		<li>3 小时孵育后，用完全培养基以 2 dyn/cm2 的剪切流洗涤通道 10–15 分钟，以去除未贴壁的细胞。此时细胞应已完全融合，通道可直接用于后续实验。根据初始接种密度，可能需要额外 2–3 小时的静置时间，以确保细胞完全覆盖通道表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肺微血管内皮细胞的促炎性激活及P-/E-选择素的抗体阻断
<ol>
	<li>在LMVEC基础培养基中配制TNF-α溶液（10 ng/ml）。</li>
	<li>为诱导通道内LMVEC的炎症活化，向入口孔中加入100 μl TNF-α溶液，并施加2 dyn/cm2的剪切流5分钟，使溶液进入通道。对于对照通道（非活化内皮细胞），向入口孔中加入100 μl LMVEC基础培养基，并以2 dyn/cm2剪切流作用5分钟引入通道。此时通道已准备好进行滚动实验。</li>
	<li>为阻断LMVEC和CHO-P细胞上的P-选择素和E-选择素，将中和性P-选择素抗体（克隆AK4，5 μg/ml溶于基础培养基）或E-选择素抗体（克隆P2H3，5 μg/ml溶于基础培养基）引入通道，在37 °C孵育1小时。随后，用基础培养基清洗通道（2 dyn/cm2，5分钟）。此时通道已准备好进行滚动实验。</li>
</ol>
5. 在底物/细胞单层包被的微流控通道中进行 HL-60 细胞滚动实验
<ol>
	<li>在显微镜下仔细检查通道，确认通道已正确包被（若为细胞包被，则应观察到完全融合的单层细胞）。</li>
	<li>为准备用于滚动实验的HL-60细胞悬液，将HL-60细胞悬液以400 × g离心5分钟，并用基础培养基洗涤一次。计数细胞后，重悬于IMDM（基础培养基，含Ca2+和Mg2+）中，制备浓度为500万个细胞/mL的HL-60细胞悬液。每个通道使用25–50 μl细胞悬液进行滚动实验。</li>
	<li>将25–50 μl细胞悬液加入出口孔中，将培养板放入温控板架（37 °C）内，并置于显微镜载物台上。随后施加2 dyn/cm2的剪切力，使细胞进入通道（应在10–15秒内观察到细胞从出口流向入口）。</li>
	<li>为研究不同剪切应力下的滚动反应，将剪切力降低至0.25 dyn/cm2，并在每个目标剪切力下（从0.25逐步增加至5 dyn/cm2，也可使用更高的剪切力）使用&#34;流式采集&#34;功能采集20–30秒的视频。</li>
	<li>使用CCD相机（流式采集，每秒11帧）采集视频，并通过兼容软件分析细胞滚动轨迹和滚动速度。</li>
</ol>
6. 流式细胞术检测表面分子的表达
<ol>
	<li>胰酶消化后，用 PBS (-/-) 制备所需细胞类型（HL-60、CHO-P 或 LMVECs）的细胞悬液（每样本使用 1–2 ×&#160;105 个细胞），并添加 2% FBS。用相同缓冲液洗涤细胞两次，并将样本体积调至 50 μl。</li>
	<li>每份样本加入相应荧光素标记的抗体（详细信息见附表），在 4 °C 孵育 20 分钟（用铝箔覆盖避光）。</li>
	<li>用相同缓冲液洗涤细胞两次，并将染色后的细胞悬液终体积调至 200 μl。使用流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况。</li>
</ol>

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<li>Sarkar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+cell+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered cell homing.</a> Blood. 118, e184-e191 (2011).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Migration+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Modified+With+CXCR4+Gene+to+Infarcted+Myocardium+Improves+Cardiac+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance.</a> Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).</li>
<li>Enoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+mesenchymal+cell+engraftment+by+IGF-1+improves+left+ventricular+function+in+rats+undergoing+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction.</a> Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

外源性细胞治疗成功转化的主要挑战之一是无法高效地将细胞递送至损伤和炎症部位，并实现高的植入效率3。细胞滚动是细胞归巢过程中的关键步骤，可促进细胞在血管壁上减速，最终导致其牢固黏附并穿过内皮进入组织5。深入理解候选细胞类型的滚动过程，可能有助于开发增强细胞归巢的技术，从而显著推动细胞治疗的发展。
平行板流动室（PPFC）是一种广泛用于研究细胞滚动以及其他在剪切流条件下细胞行为的工具。1987年，Lawrence et al. 首次研究了将PPFC应用于检测中性粒细胞在内皮上的黏附，此后已开发出多种商业化产品8,9。PPFC由两块平板组成，中间通过垫片隔开，以控制腔室的尺寸7。上板包含进液口和出液口，通过使用注射泵可实现细胞悬液在腔室内的灌注7,8。此外还有一个额外的端口用于施加负压（真空），以确保上下板紧密贴合7。尽管平行板流动室已被有效用于研究包括细胞滚动在内的多种细胞响应，但在剪切流条件下的应用仍存在诸多限制，影响其有效性。流动室的...

细胞治疗成功实现临床转化的主要挑战之一，是系统性输注的细胞难以有效递送或靶向至目标部位3,4因此，人们一直在不断探索改善细胞归巢、特别是细胞滚动的方法，以此作为提高细胞治疗效果的策略。细胞在血管上的滚动是细胞归巢级联反应中的关键步骤，这一过程最初是针对被招募至疾病部位的白细胞而定义的5. 此步骤由内皮选择素之间的特异性相互作用所调控， 即 P-和E-选择素（P-和E-sel）及其在白细胞表面的相应配体5,6更好地理解并提高细胞归巢效率，特别是滚动步骤的效率，对于开发新型细胞治疗平台具有重要意义。迄今为止，这一目标主要通过使用平行板流动室（PPFCs）实现，该装置由两块平板和中间的垫片组成，上板设有进流和出流孔，通过注射泵将细胞悬液经此系统灌注7,8 ,9底部平板的表面可包被相关的细胞单层/基质，随后在剪切流条件下研究灌注细胞与表面之间的相互作用7然而，PPFC是一种通量低、试剂消耗大且相当繁琐的方法，气泡形成、泄漏以及流速控制不佳是其主要缺点。
一种替代传统平行板流动室（PPFC）的技术是多孔板微流控系统，该系统可在精确的计算机控制剪切流条件下进行细胞实验，通量更高（比PPFC高至多10倍），且试剂消耗量低1,10。细胞滚动实验在微流控通道内进行，通道表面可包被细胞单层或工程化基底，并通过显微镜成像，利用合适的软件对滚动特性进行快速分析。在本研究中，我们通过分析人早幼粒细胞白血病（HL-60）细胞在不同表面上的滚动特性，展示了该多孔板微流控系统的功能。研究分析了HL-60细胞在P-和E-选择素等基质以及表达不同滚动受体的细胞单层上的滚动行为。此外，采用抗体（Ab）阻断实验，验证了特定选择素在介导HL-60细胞在这些表面上滚动过程中的直接作用。滚动实验以更高的通量进行，剪切流稳定，试剂和细胞消耗极少，从而可高效分析关键的滚动参数，如滚动速度、滚动细胞数量及滚动轨迹特性。

<table><tbody><tr><td>人肺微血管内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>表达P-选择素的中国仓鼠卵巢细胞（CHO-P）</td><td>由Barbara Furie博士惠赠&lt;sup&gt;11,12&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HL-60细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;细胞培养试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>内皮基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>内皮基础培养基添加剂</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV SingleQuots</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>IMDM - 伊氏改良杜尔贝科培养基 1x</td><td>Gibco</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>F-12 (1x) 营养混合物（Ham）</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P/S）</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（L/G）200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Sa550</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>BD Falcon</td><td>BD-353003</td><td></td></tr><tr><td>100 mm细胞培养皿，组织培养处理聚苯乙烯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管（15 ml聚丙烯锥形管）</td><td>MedSupply Partners</td><td>TC1500</td><td></td></tr><tr><td>T75培养瓶</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>明胶溶液（2%）</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>dPBS（不含氯化钙和氯化镁）</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA溶液（10x）</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>抗人E-选择素/CD62E</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的小鼠IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>抗人P-选择素</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA34</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的小鼠IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA34</td><td></td></tr><tr><td>FITC小鼠IgG&amp;shy;1 &amp;kappa;同型对照</td><td>BD Bioscience</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>抗SLeX /CD15s抗体，克隆：5F18</td><td>Santa Cruz</td><td>SC70545</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记</td><td>Santa Cruz</td><td>SC70545</td><td></td></tr><tr><td>正常小鼠IgM-FITC同型对照</td><td>Santa Cruz</td><td>SC2859</td><td></td></tr><tr><td>PE标记的小鼠抗人CD162，克隆：KPL-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>556055</td><td></td></tr><tr><td>PE标记的小鼠IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; k同型对照</td><td>BD Pharmingen</td><td>550617</td><td></td></tr><tr><td>抗P-选择素抗体（AK4）</td><td>Santa Cruz</td><td>SC19996</td><td></td></tr><tr><td>抗E-选择素抗体，克隆P2H3</td><td>Millipore</td><td>MAB2150</td><td></td></tr><tr><td>小鼠IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;同型对照</td><td>Santa Cruz</td><td>SC3877</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;其他试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>重组人TNF-α</td><td>PeproTech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trace CFSE细胞增殖检测试剂盒 - 用于流式细胞术</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>人P-选择素-Fc重组蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>137-PS-050</td><td></td></tr><tr><td>人E-选择素-Fc重组蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>724-ES-100</td><td></td></tr><tr><td>人纤维连接蛋白，血浆来源</td><td>Invitrogen</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bioflux 1000</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>Bioflux Montage为用于运行实验和分析数据的软件</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux 48孔板</td><td>Fluxion Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6流式细胞仪</td><td>BD Bioscience</td><td>CFlow Plus为用于运行实验和分析数据的软件</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-S</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 CCD相机</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

系统分析 体外 使用多孔板微流控系统进行细胞滚动实验

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

细胞治疗面临的主要挑战之一是在静脉或动脉内输注后，无法高效地将大量有活力的细胞系统性地靶向至目标组织。因此，目前正将增强细胞归巢能力作为改进细胞治疗的一种策略进行研究。细胞在血管内皮上的滚动是细胞归巢过程中的重要步骤，可通过相关方法进行检测 体外 使用平行板流动室（PPFC）进行实验。然而，该方法极为繁琐，通量低，且流动条件控制不佳。相比之下，我们采用了一种多孔板微流控系统，可在精确控制、符合生理相关性的剪切流条件下，实现对细胞滚动特性的高通量研究。1,2本文展示了如何便捷地检测HL-60（人早幼粒细胞白血病）细胞在P-和E-选择素包被表面以及细胞单层包被表面上的滚动特性。为了更好地模拟炎症条件，微流控通道表面被包被内皮细胞（ECs），随后用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）激活，显著增强了在动态条件下与HL-60细胞的相互作用。高通量检测结合集成的多参数软件分析平台，可快速分析滚动速度和滚动轨迹等参数，是评估细胞滚动特性的关键优势 体外该平台可快速、准确地分析旨在影响细胞滚动和归巢的工程学方法，有望推动外源性细胞治疗技术的发展。

HL-60 细胞在 P-选择素和 E-选择素表面发生滚动，但在纤连蛋白表面不发生滚动
HL-60 细胞被认为是“滚动”行为的金标准模型，因其表达多种归巢配体，包括滚动配体 P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）和唾液酸化路易斯X（SLeX）5,14（图1A）。表面蛋白 PSGL-1 作为四糖 SLeX 的支架，介导与 P-选择素（P-sel）和 E-选择素（E-sel）的特异性相互作用，而 P-sel 和 E-sel 在炎症期间于内皮细胞表面表达上调5,6,15。为测试多孔板微流控系统的性能，多个微流控通道被同时包被不同底物，并对 HL-60 细胞在这些表面的滚动相互作用进行了分析。HL-60 细胞在 P-sel 包被的表面表现出显著的滚动行为，细胞首先从流动中被捕获，随后呈现明显的滚动运动。如图1C所示，并与文献报道一致，HL-60 细胞在 E-sel 表面也表现出类似的滚动行为，但在纤维连接蛋白（fibronectin）包被的底物上则无此现象14,16-19</...

本研究采用多孔板微流控系统，显著提高了在生理相关剪切流条件下细胞滚动研究的通量。鉴于细胞滚动在多步细胞归巢级联反应中的重要性，以及在外源性细胞群体经系统性递送至患者后细胞归巢的关键作用，该系统有望作为筛选平台，用于优化细胞治疗策略。

细胞治疗面临的主要挑战之一是无法以高效率将大量有活力的细胞系统性地靶向输送至目标组织……

以下实验的总体目标是在严格控制且具有生理相关性的剪切流条件下，进行通量更高的细胞滚动研究。该目标通过使用一种多孔微流控系统实现，该系统中特殊培养板的相邻孔通过微流控通道相连。系统的接口将电控气动泵连接至多孔板的顶部，并施加气动压力，从而以设定的流速驱动液体从孔内经微流控通道流动。在微流控通道被目标底物或单层细胞包被后，将待研究的细胞引入微流控通道，以探究其与包被表面之间特定的滚动相互作用；随后可在不同实验条件下，利用适当的软件分析细胞与底物或单层细胞包被表面相互作用时的滚动特性。与现有的平行板流动腔等方法相比，该技术的主要优势在于，能够在精确控制、生理相关的管状流动条件下，以显著更高的通量研究细胞滚动特性，同时最大限度地减少试剂和细胞的消耗。该平台有望通过快速、准确地分析旨在影响细胞滚动与归巢能力的工程化策略，推动外源性细胞治疗技术的发展。为了在微流控通道内包被蛋白底物，首先将25至50微升新鲜配制的蛋白溶液加入入口。然后施加2 dyne/cm²的剪切力，持续5分钟，使溶液灌注进入通道。当出口处出现液滴时，停止流动，将含有目标蛋白的溶液在适当条件下孵育一定时间，随后从每个孔中吸除溶液。接下来，向出口孔中加入 200 至 500 微升 PBS，然后以每平方厘米两达因的剪切流处理五分钟，以清洗通道，从而在微流控通道内形成单层细胞。首先，将目标细胞从培养皿中轻轻胰酶消化 3 分钟，加入两倍体积的完全培养基终止反应，随后在室温下以 400 ×g 离心 5 分钟。接着，用 10 毫升完全培养基重悬细胞沉淀进行洗涤。然后将细胞重悬于1毫升新鲜的完全培养基中，计数后调整细胞悬液至适当浓度，随后将25至50微升细胞悬液加入每个入口。现在将培养板置于显微镜载物台上，施加2达因/平方厘米的剪切流，使细胞流入微通道，直至观察到细胞充满整个通道。停止流动后，向出口和内陆孔中各加入200微升适当的细胞培养基，然后在37°C、5%CO2条件下静置，使细胞沉降并贴壁。三小时后，用完全培养基清洗微通道，以去除未贴壁的细胞。此时细胞应已完全汇合，可用于诱导微通道内内皮细胞的炎症活化。向入口孔中加入100微升新鲜配制的TNF-α溶液，然后施加2 dynes/cm²的剪切流5分钟，将溶液引入微通道中。对于对照组非活化内皮细胞通道，在入口处加入 100 微升内皮细胞基础培养基。为阻断内皮细胞表面的 P 选择素或 E 选择素，向通道中加入每毫升 5 微克的相应中和抗体，并将培养板在 37 摄氏度孵育 1 小时。随后用基础培养基洗涤通道，再开始滚动实验。在显微镜下仔细检查通道，确认通道已正确包被。然后用基础培养基将HL 60细胞悬液洗涤两次，在第二次洗涤后进行细胞计数，随后将细胞重悬于IMDM中，浓度为每毫升5 × 10⁶个细胞。将25至50微升细胞悬液加入出口孔后，将培养板置于37°C温控载板架上，

systematic-analysis-vitro-cell-rolling-using-multi-well-plate

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

的系统分析体外细胞滚动使用多孔板微流控系统

我们利用一种新型的基于琼脂糖凝胶的微流控装置，证明了表皮生长因子受体（EGFR）的过表达可增强神经干细胞（NSCs）的迁移能力。该技术可轻松适用于其他哺乳动物细胞系统，特别是在细胞来源稀少（如人神经干细胞）且实验周期至关重要的情况下。...

利用基于琼脂糖凝胶的微流控装置评估神经干细胞迁移能力

本报告以可视化方式展示了在生理剪切应力条件下研究白细胞与内皮细胞相互作用的平行板流动腔分析方法。该方法特别适用于研究内皮细胞选择素（E-选择素）及其白细胞配体在介导白细胞沿内皮细胞表面滚动过程中的作用。...

E-选择素介导白细胞在微血管内皮上生理滚动的分析

能够正常化细胞结构的黏附性微图案可用于提高药物效应检测的灵敏度，改善实验重复性，并简化自动图像采集与分析。该技术将有助于在传统细胞培养支持物上进行的药物/siRNA筛选实验，此类实验通常因细胞间变异性过大而受限。...

利用微图案化细胞改善药物效应的可视化与定量分析

我们描述了一种用于观察和分析细胞在不对称受体图案化基底上滚动轨迹的实验方案。所得数据可用于设计用于无标记细胞分离与分析的受体图案化基底。...

在不对称受体图案上研究细胞滚动轨迹

本视频文章介绍了一种已成功建立的高通量流程，可用于感染并分析大量斑马鱼胚胎，从而为利用完整动物脊椎模型进行化合物筛选和药物发现提供了一种新的强大工具。...

高通量研究体系的建立与优化 表皮葡萄球菌 和 Mycobacterium marinum 感染作为药物发现的模型

我们报道了一种用于研究细胞和胚胎的装置及新方法。单个细胞被精确地排列在微腔阵列中。这种三维限制更接近生理条件下的三维环境，有助于细胞器的定向排列。通过控制细胞形态，该装置可最大限度地减少标准检测中常见的变异性。...

在三维限域中排列单细胞与单胚胎：一种用于高内涵筛选的新装置

本方案描述了使用可定制的自动化微流控装置来观察生物膜形成的实验方法 Candida albicans...

生物膜形成的可视化 白色念珠菌 使用自动化微流控装置

本文描述了一种高通量微流控生物反应器与荧光显微镜联用的方法，用于分析剪切应力对表达绿色荧光蛋白的铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

剪切应力对活细胞分析的影响 铜绿假单胞菌 使用自动化高通量微流控系统

本方案描述了一种包被方法，用于在6孔板的特定区域限制内皮细胞生长，以便利用轨道摇床模型施加剪切应力。...

在轨道摇床中于6孔板内分割培养内皮细胞以用于力学生物学研究

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

本研究展示了一种灵活的实验方案，采用微孔板格式的荧光标记弹性可收缩表面（FLECS）技术，通过可视化荧光蛋白微图案的位移，实现对单细胞收缩力的简化、免手动定量分析。...

使用微图案化弹性体进行单细胞收缩力的简化高通量分析

了解多孔板微流控系统用于细胞滚动研究的高通量方法。该系统可在生理相关剪切流下精确控制流体，显著减少试剂消耗，为细胞归巢机制和细胞治疗研究提供高效平台。

系统分析体外使用多孔板微流控系统进行细胞滚动实验

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