的系统分析体外细胞滚动使用多孔板微流控系统

以下实验的总体目标是在严格控制的、生理相关的剪切流下进行细胞滚动研究，并提高通量。这是使用多孔微流体系统实现的，其中专用板中的相邻孔通过微流体通道连接。该系统的接口将电动气动泵连接到多孔板的顶部，并施加气动压力，以规定的流速通过微流体通道驱动流体从孔内部排出。

一旦微流控通道涂上所需的衬底或细胞单层，感兴趣的细胞就会被引入微流控通道，以探索它们与涂被表面的特定滚动相互作用，细胞在不同实验条件下与衬底或单层涂覆表面相互作用时的滚动特性可以使用适当的软件进行分析。与平行板流通室等现有方法相比，该技术的主要优点是，该技术能够在精确控制、生理相关的管流下以显着更高的通量研究银轧制特性，同时最大限度地减少试剂和细胞消耗。该平台允许快速准确地分析旨在影响细胞滚动和归巢的工程方法，从而帮助推进基于细胞的外源性疗法。

要在微流体通道上涂覆蛋白质底物，首先将 25 至 50 μL 新鲜制备的蛋白质溶液添加到入口中。然后用每平方厘米 2 dine 的力搅拌 5 分钟，将溶液灌注到通道中。当出口处可见液体珠时，充分停止流速，将板与目标蛋白孵育适当的时间，然后从每个蛋白中吸出溶液。井。

接下来，将 200 至 500 微升 PBS 加入出口孔中，然后以每平方厘米 2 丁的纯粹流动方式清洗 5 分钟，以清洗通道，在微流体通道内形成细胞单层。首先，从培养皿中对目标细胞进行温和胰蛋白酶 3 分钟，用两倍体积的全培养基终止反应，然后以 400 Gs 和 rt 离心细胞 5 分钟。接下来，在 10 毫升全培养基中洗涤沉淀。

然后将细胞重悬于 1 毫升新鲜的全培养基中并计数，将细胞溶液调节至适当浓度，然后将 25 至 50 μL 细胞悬液接种到每个入口中。现在将板放在显微镜载物台上，以每平方厘米 2 丁的纯粹流动使细胞流入通道，直到观察到细胞充满整个通道。停止流流后，用 200 微升适当的细胞培养基填充出口孔和内陆孔，然后让细胞在 37 摄氏度的 5% CO2 中沉淀并粘附。

三小时后，用完整的培养基清洗通道以去除未附着的细胞。细胞现在应该完全汇合并准备好用于诱导通道中内皮细胞的炎症激活。将 100 微升新鲜制备的 TNF α 溶液加入进样孔中，然后以每平方厘米 2 丁的纯粹流动将溶液引入通道，持续 5 分钟。

对于对照未活化的内皮细胞通道，向入口处添加 100 微升内皮细胞基础培养基。为了阻断内皮细胞表面的 P 或 E 选择素，将每毫升 5 微克适当的中和抗体引入通道中，并在 37 摄氏度下孵育板 1 小时。然后在开始滚动测定之前用基础培养基洗涤通道。

在显微镜下仔细检查通道，以确认通道已正确包被。然后在第二次洗涤计数后用基础培养基洗涤 HL 60 细胞悬液 2 次，然后在 IMDM 中以 5 倍 10 至每毫升浓度重悬细胞至第 6 个细胞。将 25 至 50 微升细胞悬液加入出口后，将板放入 37 摄氏度温控板架中，然后将板架放在显微镜载物台上。

将细胞引入微流体通道。应在 10 到 15 秒内观察它们从出口流向入口的过程。在这里，可以观察到荧光标记的 HL 60 细胞，与 P 选择编码表面相互作用，显示滚动响应以检查滚动响应作为剪切应力的函数，将剪切力降低到每平方厘米 0.25 个丁恩，并在每个所需的剪切中使用流采集函数获取 20 到 32 个视频， 以及通过逐渐将剪切力从每平方厘米 0.25 增加到 5 丁。

最后，使用 CCD 相机以每秒 11 帧的流采集来采集检测视频。例如，这里显示了在单层 chope 细胞上滚动的 HL 60 细胞。使用适当的兼容软件分析轧制路径和速度。

HL 60 细胞被认为是金标准滚轮，因为它们表达多种归巢配体，包括滚动配体、P select 和糖蛋白配体 one 以及 CI Lewis X.To 测试多孔板微流控系统的能力，许多微流控通道同时涂有不同的底物和 HL 60 细胞的滚动相互作用。通过分析这些底物，细胞在 P select 编码表面上表现出稳健的滚动行为，细胞首先从流动中捕获，然后是明显的滚动运动。如图所示，HL 60 细胞在 e 和 p 选择素表面表现出相似的滚动行为，但在 FiberInc 涂层基材上则没有。

通过兼容软件分析的细胞速度与纯粹应力的关系图，显示细胞对 p 和 e 选择素的稳健滚动响应，平均速度在每秒 1 到 12 微米之间。为了评估该微流控系统在有效测试目标细胞与包被表面的细胞单层之间的相互作用的可行性，使用了转染以稳定表达 P 而不是 e 选择素的表面 CHO P 细胞，如下所示。HL 60 细胞在 CHO P 细胞单层上表现出显着的滚动反应，以测试 HL 60 的滚动运动是否确实是由果胶介导的。

HL 60 细胞注入通道之前，将单层与 P 或 E 选择素的封闭抗体预孵育。如图所示，用 P 选择素抗体阻断 CHO p 单层导致在表面滚动的 HL 60 细胞数量显著减少，表明 P 选择并确实介导了 HL 60 滚动。如前所述，多孔微流体板由许多独立的微流体通道组成，允许对多种不同条件进行更高通量的测试。

这种有利的设计用于将内皮细胞接种在微流体通道内，以便在各种实验条件下快速分析 HL 60 细胞与内皮细胞之间的相互作用以模拟炎症条件，内皮细胞用促炎细胞因子 TNF α 预处理，导致 E 上调，但 P 选择素上调内皮细胞表面。有趣的是，HL 60 细胞没有与失活的内皮细胞相互作用，也没有观察到细胞在该表面上滚动。相反，HL 60 细胞在 TNF α 活化的内皮细胞上表现出稳健的滚动行为，平均速度为每秒 5 至 15 微米，以探索 p 或 E 选择素参与 HL 60 细胞和活化内皮细胞之间的滚动相互作用。

将 TNF α 活化的内皮细胞与阻断抗体中的 P 或 E 选择预孵育，并如图所示分析 HL 60 细胞的滚动，在 TNF α 内皮细胞上选择的阻断导致活化的内皮单层上滚动细胞的数量显着下降。相比之下，使用同位素对照或抗果胶抗体（在活化的内皮细胞上不表达）对活化内皮层上滚动的 HL 60 没有显着影响。这些数据表明 S 选择素直接参与 HL 60 滚动对 TNF α 活化的内皮细胞，这与以前的报道一致。

分析软件允许跟踪单个细胞与表面相互作用时的路径。因此，专门跟踪单个细胞在有或没有 e select 和抗体阻断的情况下与 TNF α 活化的内皮细胞相互作用时的路径，如图所示，未阻断的活化内皮细胞上的滚动细胞数量显着高于选生和阻断的活化内皮细胞。此外，HL 60 细胞在未封闭的内皮细胞上的滚动运动似乎是连续和稳健的，而选生细胞和封闭内皮细胞上的细胞滚动路径是碎片化的。

与这一发现一致，HL 60 细胞在未阻断的 TNF α 活化内皮细胞上的滚动速度显著低于 e select 和封闭的内皮细胞上的滚动速度。本研究展示了使用多微流体系统在严格控制的管流下高效地进行细胞滚动实验，将通量提高到每小时 10 种滚动气体。总体而言，这种微流体系统成为研究细胞滚动的强大技术，这是细胞滚动的一个关键方面。

例如，我们的实验室目前正在使用该系统来筛选增强间充质干细胞归巢的条件，作为改善其治疗影响的策略。