建立和高通量安装程序研究优化表皮葡萄球菌和分枝杆菌感染作为模型药物发现

该程序的总体目标是生成大量受感染的斑马鱼胚胎，用于高通量化合物测试，以实现药物发现。这是通过首先使用大型繁殖容器在单个事件中获得大量同步斑马鱼卵来实现的。接下来，将鸡蛋排列成 aros 网格，并使用自动微型注射器感染蛋黄中的细菌。

当感染通过胚胎扩散时，它们会通过大颗粒流式细胞术进行预分类，然后再用药物治疗。最后，在复合处理后分析感染胚胎中的细菌负荷水平。最终，通过共聚焦显微镜椎骨进行高分辨率分析。

自动筛选和大颗粒采样用于更详细地显示化合物对感染的影响。与手动注射或 PIX 扫描分析等现有技术相比，这种方法的主要优点是，有了它，我们可以生成大量受同质影响的胚胎，我们可以以高通量方式进行分析。为了制备 S 表皮接种物，从含有 A PW VW 180 9 衍生的 M cherry 表达载体的 O 47 的 S 表皮菌株平板中分离出几个单独的菌落，并接种。

25 毫升 LB 补充每毫升 10 微克。氯霉素在 37 摄氏度下孵育过夜至第二天中期，将 1 毫升培养物以 12， 000 GS 离心 1 分钟，并使用 1 毫升无菌 PBS，每体积体积 0.3%，在 80 之间洗涤沉淀 3 次。在 OD 600 处测量光密度，并使用 2% 重量单位体积、聚乙烯钙 40 或 PVP 40 在 PBS 中将细菌悬浮液稀释至 OD 600 等于 0.3 或每毫升 8 个 CFU 的 10 倍。

为了制备胺接种物，从稳定表达 PS MT 3M 樱桃载体的 M Meum 菌株 M 或 E 11 中分离几个单独的菌落，并接种 10 毫升 Middlebrook 7 H 9 肉汤，每体积含有 10% 体积。Middlebrook A DC 富集剂补充每毫升 50 微克潮霉素，第二天在 28 摄氏度下孵育过夜。将 1 毫升培养物以 12， 000 GS 离心 1 分钟，并使用 1 毫升无菌 PBS，每体积体积为 0.3%，介于 80 之间，洗涤沉淀 3 次。

测量细菌悬浮液的 OD 600，每体积重量为 2%。将 PBS 中的 PVP 40 稀释至 OD 600 的 0.3 或 0.3 倍 10 倍/毫升 8 个 CFU 以获得斑马鱼卵，在收集前一晚将最多 50 条雌性斑马鱼放入大型繁殖船的底部腔室，将 70 条雄性斑马鱼放入容器的顶部。第二天早上，从容器中取出分离器大约 1 小时后，通过饲养容器底部的鸡蛋收集器，将鸡蛋收集到一个装满鸡蛋水的 50 毫升试管中。

准备注射板后，根据自动微型注射器作软件上的文本协议，单击校准阶段，然后单击 10 24。将孔网格网格并将 aros 板放入微量进样器中，通过单击孔中心位置的屏幕校准板。然后转到针菜单并单击 Calibrate Needle Holder（校准持针器）。

使用微型注射针头，在 10 微米直径的针头注射针中填充 10 微升 PVP 40（每升 S 表皮含有 100 个 CFU）、每纳升血清 30 个 CFU 或单独的 PVP 40（用于模拟注射），将针头放入自动微量注射器中，并通过降低或向上移动针头并点击针头位置的屏幕来校准 XY 位置。然后通过单击屏幕在针尖位置校准针的 Z 位置。接下来，使用塑料移液管将鸡蛋分布在 aros 网格上，并去除多余的鸡蛋水分。

然后将装满鸡蛋的 agros 网格放入注射菜单中的自动微量注射器中，将注射压力设置调整为 200 公顷帕斯卡，注射时间为 0.2 秒，补偿压力为 15 公顷帕斯卡，这与 Femto 喷射器设置菜单中的 1 纳升相关。单击全部注射并在注射后注射整个胚胎板。通过在培养皿中清洗鸡蛋并在 28 摄氏度下孵育来收集鸡蛋。

设置好大颗粒流式细胞仪后，进入 PMT 菜单，将红色通道设置为 650 伏，将绿色和黄色通道设置为零伏。然后在阈值菜单中，将光密度阈值信号设置为 50，对应于 975 毫伏，最小飞行时间设置为 800，对应于 320 微秒。为了减少碎屑的影响，将胚胎放入样品杯和排序菜单中，通过输入 70 找到每个板最多 70 个胚胎进行排序。

将空培养皿放在分选仪下方，然后单击手动分选。装满培养皿后，单击存储保存数据。如果需要高分辨率分析或成像，可以将胚胎单独分选到 96 孔板的孔中。

将胚胎放入样品杯中，并定义每个孔中最多一个胚胎进行排序。然后将空的 96 孔板放入左侧板支架中，然后单击填充板。装满板后，通过单击存储来保存数据，以在注射 erum 后三天分析药物处理的胚胎。

在溶剂中用感兴趣的化合物处理一组胚胎，单独用溶剂处理另一组胚胎。将处理过的胚胎在受精后 4 天和 5 天放入流式细胞仪上的样品杯中，并在 trica 中麻醉胚胎并设置脊椎动物自动筛选系统和大颗粒采样器后，将分选设置为每板 70 个胚胎。根据成像物体检测设置菜单中的文本协议，在成像自动存储图像菜单中选择与胚胎年龄相对应的参考图像，选择要创建的照片数量和要使用的方向。

将装满胚胎的 96 孔板放入大颗粒采样器的左板支架中，然后单击 Run Plate。当胚胎正确定位后，使用 10 x 普通干燥物镜并分别对头部和尾部进行成像。然后使用图像处理软件将图像拼接在一起，以评估哪个发育阶段最适合蛋黄感染。

1 和 512 细胞阶段之间的所有不同阶段进行皮炎和 marum 注射。如图所示，在 16 至 128 细胞期之间进行 100 CFU 皮炎注射提供了最佳的感染模式。细菌在蛋黄内增殖了 3 天，并在感染后 3 天开始扩散到体内。

使用大颗粒流式细胞仪通过荧光强度分析对细菌负荷进行高通量定量。如图所示，胚胎内存在的活细菌量与测得的荧光信号非常吻合。该图表明，注射 30 CFU 胺的最佳发育阶段是 E 11 菌株的 16 至 128 细胞期和 16 至 64 细胞期。

对于毒性更强的 EM 菌株，在这些阶段注射的胚胎显示细菌在橡树内生长，细菌通过胚胎传播。在对 emerin 感染的胚胎进行预排序处理后，用不同浓度的利福平显示分枝杆菌感染以剂量依赖性方式减少。以 200 微摩尔的剂量使用该药物表明，它有效阻止了 M mein E E 11、24 小时及治疗后的发展后细菌进展。

这些技术为化合物检测和药物开发领域的研究人员铺平了道路，他们为结核病或生物材料相关感染等感染性疾病寻找新的治疗方法。