在光刻定义的聚对二甲苯-C：SiO 上进行细胞图案化₂ 底物

本实验的总体目标是根据预设的聚对二甲苯线条设计，将细胞在二氧化硅表面进行图案化。该过程首先制备所需图案的光刻掩模，第二步是对硅片进行氧化处理，然后涂覆聚对二甲苯。

接下来在微电子洁净室设施中进行的光刻工艺用于选择性蚀刻聚对二甲苯涂层，以显现出所需的设计图案。最后一步是先用piranha溶液活化芯片，然后在胎牛血清中孵育3至12小时，之后即可接种细胞悬液进行培养。最终，可通过解剖显微镜进行活细胞成像，或在固定后采用共聚焦荧光显微镜观察来评估细胞图案化效果。

与现有的多种细胞图案化技术相比，该技术的主要优势在于无需将生物试剂带入洁净室。此外，图案化芯片可在激活前无限期保存，激活过程需先使用对苯二甲酸，再使用血清。为了设计所需的平行线C型构型，应使用能够读取和编写CIF或GDS II文件的版图编辑软件包。

将光刻掩模的制造外包给合适的微电子设施，或在内部完成。如果具备相应设施，则在大气压水平炉中于 950 摄氏度对硅片进行 40 分钟氧化处理，以生成 200 纳米的二氧化硅层。随后，通过小范围测量确认其厚度。

光谱反射仪。将晶圆放入真空沉积系统中，将派瑞林（paraline）粘附促进剂涂于腔室盖内侧。在抽真空过程中，派瑞林粘附促进剂以每毫克二聚体1.3纳米的速率，在常温下通过真空沉积系统将氧化晶圆装载并沉积派瑞林C。

随后，在涂有聚酰亚胺的晶圆上沉积 HMDS 偶联剂。使用合适的光刻胶涂布系统，以 4,000 RPM 的转速旋涂晶圆 30 秒，同时涂布正性光刻胶，以获得 1 微米厚度的光刻胶层，然后在 90 摄氏度下进行前烘 60 秒。接着，将晶圆和预制的光刻掩模一同插入掩模对准仪中。

用紫外光照射涂有光刻胶的晶圆，以将所需图案转移到光刻胶中。随后，将曝光后的晶圆在110摄氏度下烘烤60秒。然后使用适当的显影液进行显影，去除晶圆上所有曝光的光刻胶。接着，利用氧气等离子体刻蚀系统去除未受保护的区域，暴露出下方的二氧化硅。

然后将切割后的芯片存放在无尘盒中，待用时取出。在此步骤中，用丙酮清洗芯片10秒，以去除残留的光刻胶。随后用去离子蒸馏水冲洗三次，在酸性通风橱中配制新鲜的piranha酸，再将芯片浸入piranha酸中浸泡10分钟，以进行清洗和刻蚀。

然后用去离子 H2O 将芯片冲洗三次，并转移至超净台中的无菌培养皿内。通过将两个芯片放入一个孔中，置于六孔板内，以激活芯片用于细胞图案化。接着，加入两毫升胎牛血清，使所有芯片完全浸没。

将芯片置于血清中，在 37 摄氏度下孵育 3 至 12 小时。现在将芯片从激活溶液中取出，用 Hanks 平衡盐溶液洗涤一次，持续 10 秒。

然后将芯片放入培养孔中，并将选定的细胞类型以其常规培养基作为悬浮液接种。最佳细胞接种密度取决于细胞类型和芯片上 paraline C 的几何图案。每毫升 5 × 10⁴ 个细胞的密度是一个合理的起始点。

成像方法可根据细胞图案化的具体目的进行调整，但活细胞行为可轻松通过解剖显微镜结合配备合适中继镜头的数码相机进行观察。以下是人子宫内膜癌 HEC-293 细胞在对位线性 C 型二氧化硅材料上培养三天后的活细胞成像结果。体外实验中，芯片先在胎牛血清中孵育三小时，随后将细胞以每毫升 5 × 10⁴ 个细胞的浓度接种于悬浮液中。

Paraline C 促进细胞黏附，而裸露的二氧化硅则排斥细胞。该图显示了在二氧化硅表面不同 Paraline C 图案上培养的原代人源胶质瘤干细胞样细胞的免疫荧光图像。此处示意图展示了网状 Paraline C 设计、固定细胞经胶质纤维酸性蛋白染色后的荧光显微图像，以及同一芯片上活细胞的明场显微图像。

这是一张荧光图像，展示了在不同平行线设计上经GFAP染色的细胞，以及轮辐状平行线设计中节点的反射光图像。该图还显示了培养在平行线C型二氧化硅上的三株T3L1细胞的活细胞成像结果。体外培养四天后，芯片在胎牛血清中激活三小时，随后将细胞以每毫升5×10⁴个细胞的浓度悬浮接种。

在此情况下，该平台无法实现细胞在 Lene C 和二氧化硅区域上均等汇合的图案化。执行本方案时，必须注意：血清活化必须在 piranha 处理后立即进行，否则将破坏图案化过程。

请勿忘记，使用piranha酸可能极其危险。务必在化学通风橱中配制和使用piranha酸，并确保佩戴合适的眼镜、实验服和手套。