Name: 自动分离 C。线虫可多段由细菌病原体殖民者 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 了解利用虫体分选仪分离被铜绿假单胞菌GFP菌株定殖的秀丽隐杆线虫群体的方法。该技术通过RNA提取和基因表达分析，帮助研究人员研究病原体识别如何启动先天免疫反应，并揭示感染过程中的免疫机制。

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作者感谢艾略森医学基金会提供的支持。我们还要感谢Abby Dernburg实验室的成员在使用蠕虫分选仪方面提供的帮助。

1. 获得同步化的年轻成年动物培养物
<ol>
	<li>在多个接种了OP50-1的大肠杆菌的NGM平板上培养线虫 大肠杆菌&#160;细菌（10倍&#160;从饱和培养物中浓缩，直至大量线虫发育至产卵阶段。</li>
	<li>用卵制备液处理怀卵动物以获得同步化的卵培养物（卵）。</li>
	<li>将卵接种到多个铺有10倍浓度大肠杆菌的60毫米NGM平板上&#160;浓缩的OP50-1，密度约为150-200个卵/板。</li>
	<li>在25 °C下培养平板2天（直至线虫发育至L4-年轻成虫阶段）。</li>
</ol>
2. 准备 铜绿假单胞菌&#160;培养皿与感染性蠕虫
<ol>
	<li>在进行卵制备的当天（步骤 1.1），将 PA14::GFP 菌种接种至 2 ml 含利福平（终浓度为 100 μg/ml）的 King’s B 培养基中。于 37 °C 振荡培养过夜（O/N）。</li>
	<li>将 PA14::GFP 菌液接种至实验所需数量的慢杀平板（SKP）上。在每个 150&#160;mm 的 SKP 培养皿中加入 75–100 μl 饱和菌液，并使用无菌玻璃涂布器均匀涂布。于 37 °C 培养 20–24 小时。</li>
	<li>从培养箱中取出平板，静置冷却至室温（约 20 分钟）。使用 M9 缓冲液将步骤 1.4 中的线虫以最小体积冲洗至 PA14::GFP 平板上。当使用 150&#160;mm 平板时，可将数百条线虫置于单个平板上。</li>
	<li>将平板于 25 °C 培养 18–21 小时。对于暴露于 P. aeruginosa 的年轻成虫线虫，此时间段可获得定植与非定植个体的最佳分布状态。</li>
</ol>
3. 设置线虫分选仪
在进行样品分选之前，确保仪器正常运行。详细信息可访问 http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43，基本步骤如下所述。
<ol>
	<li>将鞘液阀压力设置为约 5 psi&#160;（4.5–5.5 范围）。</li>
	<li>为确认鞘液流速是否合适，在分配器下方放置一个 15&#160;ml 的锥形管，打开鞘液阀，关闭分选阀。将管子置于分配器下方保持 60 秒，管中液体体积应为 9–10 ml。若超出此范围，应相应调整鞘液阀压力。</li>
	<li>为确保鞘液流速（按步骤 3.2 设置）能够实现准确分选，使用 40 μm 的对照颗粒测试分选速率：</li>
	<li>关闭鞘液阀，向储液罐中加入约 25 ml 对照颗粒溶液。</li>
	<li>打开鞘液阀和样品阀。</li>
	<li>在计算机软件中进入 &#34;对照颗粒模式&#34;，然后点击采集。</li>
	<li>确保颗粒流速约为 5–8 个颗粒/秒，飞行时间（TOF）接近颗粒宽度，即 40 μm。此类 TOF 表明每次仅有一个 40 μm 的物体通过。若数值超出此范围，应根据上述说明相应调整设置。</li>
</ol>
4. 分选定植与非定植线虫
<ol>
	<li>使用M9缓冲液将线虫冲洗至15 ml锥形管中。静置使成虫自然沉降至管底，吸除上清液。加入新鲜M9缓冲液重悬，重复此洗涤步骤3–4次。该过程可去除大部分幼虫以及过量细菌，耗时约10分钟。</li>
	<li>将线虫加入蠕虫分选仪储液槽中，并用小型搅拌子轻轻混匀。</li>
	<li>通过将绿色PMT设为600，红色和黄色PMT设为200，调节初始信号增益。</li>
	<li>开始采集数据以调整设置。</li>
	<li>目标分选速率为每秒25-30个事件（线虫）。若事件速率过高，需用M9缓冲液适当稀释储液池中的线虫；若速率过低，则在少量M9缓冲液中加入更多线虫。</li>
	<li>如果实验需要对定植与非定植线虫进行非常严格的分离，则设置 &#34;共定位检测&#34; 到 &#34;纯度&#34;这可以确保当两个物体距离过近或同时出现在同一液滴中时，仪器会拒绝收集该液滴。</li>
	<li>为了分选目标群体，在指示大小（以获得成虫）和荧光强度的轴上绘制门控区域即 高表示定植，低表示非定植）。荧光门控的阈值需通过实验确定。</li>
	<li>在分配器下方放置一个多孔板或培养皿以收集线虫&#160;然后打开分选阀，开始分选线虫。</li>
	<li>收集少量细胞样本，在显微镜下确认分选所得细胞群体是否为目标细胞群体。若非目标群体，应相应调整设门参数，并继续样本收集。</li>
</ol>

<ol><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li>
<li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).</li>
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<li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li>
<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li>
<li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection%2C+by+modulating+the+nematode%27s+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
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<li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法利用对线虫外部实体的荧光标记，来追踪线虫与其环境之间的相互作用。在我们所展示的案例中，分离基于对病原体的标记，用于将携带大量病原体的线虫与无（或少量）病原体负载的线虫区分开来。后续的基因表达分析发现，这两组之间在免疫应答方面没有差异，表明免疫应答与病原体负载量无关。已有研究显示，触发该应答的信号在物理上与细菌相关联，而非由细菌分泌，提示该信号可能是一种病原体相关分子模式（PAMP）。综合这些结果支持了如下假说：PAMP识别在秀丽隐杆线虫（C. elegans）免疫应答的启动中发挥重要作用19。
上述分选方案的一个优点是，能够从同一种群中分离出定植与非定植的线虫。这依赖于种群中定植与非定植个体具有理想的分布比例。我们发现，在用野生型幼年成虫线虫感染时 P. aeruginosa，这相当于约18小时的暴露时间。该暴露时间导致动物群体中大多数个体被定植至一定程度 &#34;中等&#34; 学位，但数百条线虫表现出完全定植，同样数量的线虫未被定植。尽管这符合我们实验目的下的最佳分布，但其他人可依据自身需求定义其最佳分布。...

自动线虫分选技术与流式细胞术（FACS）类似，其工作原理是当线虫在管道中被拉直后通过时，检测其体内荧光信号&#160;（通常由报告蛋白的转基因表达提供），然后根据研究者设定的门控参数，将线虫导向收集管/孔或废液容器&#160;1。线虫分选仪可在多个研究领域中发挥重要作用；例如，有研究将其作为分析工具，系统追踪了近1,000个基因的启动子活性在时空上的动态变化模式2。 
然而，线虫分选仪最主要的应用仍在于遗传筛选，用于检测目标基因的表达水平或荧光蛋白在线虫体轴上的定位情况3-5。
本文介绍了一种蠕虫分选仪的新应用，用于追踪荧光标记病原体在蠕虫体内的定植过程。利用该工具，我们重点研究了病原体定植程度/载量与免疫应答之间的关系，以深入了解在蠕虫中启动免疫应答的相关机制。
迄今为止，在几乎所有被研究过的生物体中，针对微生物病原体的先天免疫反应的启动都依赖于对病原体相关分子模式（PAMPs）和/或危险/损伤相关分子模式（DAMPs）的识别6,7。前者是指保守的微生物结构，包括微生物细胞壁、鞭毛或脂双层的组分6；后者则包括释放的分子（例如 ATP8）、发生改变的蛋白质或其他细胞过程异常的标志物9,10。这两类信号均由被称为模式识别受体（PRRs）的蛋白质识别，当这些受体特异性结合相应的模式分子后，会激活一系列事件，从而引发保护性免疫反应。C. elegans 作为一种易于操作的模型生物，在解析宿主-病原体相互作用的多个方面极为有用，但目前尚不清楚的是，该线虫中免疫反应是如何被启动的。迄今尚未发现任何与其它生物中模式识别受体（PRRs）同源的候选受体能够结合PAMPs，而且许多在其他生物中对免疫反应至关重要的PRR同源物在C. elegans中对病原体反应和抗性的贡献却出人意料地有限。例如，在Drosophila&#160;中对抵抗革兰氏阳性病原体至关重要的Toll受体，在C. elegans中仅有一个同源基因tol-1，它仅有助于抵御革兰氏阴性病原体Salmonella Typhimurium11，而对其他已测试的革兰氏阴性或革兰氏阳性病原体则无保护作用11,12。这些观察结果，结合一些研究表明干扰细胞蛋白质翻译可诱导免疫反应，使部分研究者提出C. elegans主要识别DAMPs9,13,14。然而，也有报道指出死亡的病原体能够诱导免疫反应，提示PAMP的识别可能在C. elegans的病原体识别中具有重要作用15,16。先前针对基因型相同且年龄同步化的C. elegans群体的免疫反应研究显示，个体间在肠道被革兰氏阴性细菌病原体Pseudomonas aeruginosa定植的程度上存在显著差异。
然而，转录谱分析研究将这些定植程度不同的种群视为单一整体17,18。我们利用这种变异性，开发了一种实验方案，通过自动化蠕虫分选仪对暴露于表达GFP的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中定植程度不同的种群进行分离。对不同定植水平种群的基因表达进行分析，有助于评估病原体载量（及其引起的损伤）与免疫应答之间的关系，并为秀丽隐杆线虫（C. elegans）中病原体识别机制提供了新的见解19。下文将描述该实验方案，该方案可适用于分选感染了任何荧光标记病原体的线虫。
需要提醒潜在使用者的是，所需分选的线虫数量取决于后续分析的性质及所采用的实验方案。例如，在进行微阵列基因表达分析时， &#62;需要1,000条线虫才能获得足够的RNA（采用标准实验方案时），但如果使用扩增技术，则仅需约100条线虫即可，从而加快材料收集速度，最大限度地减少对线虫的应激。

<table><tbody><tr><td>M9 缓冲液</td><td>实验室自制</td><td></td><td>配方见 wormbook.org</td></tr><tr><td>利福平</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>卵制备溶液</td><td>实验室自制</td><td></td><td>50 ml 水；40 ml 漂白剂；10 ml 10 N 氢氧化钠</td></tr><tr><td>NGM 平板</td><td>实验室自制</td><td></td><td>配方见 wormbook.org</td></tr><tr><td>SKP 平板</td><td>实验室自制</td><td></td><td>配方与 NGM 相同，仅蛋白胨浓度为 0.35% 而非 0.25%</td></tr><tr><td>对照测试颗粒</td><td>Union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

由细菌病原体不同程度定植的 c. elegans 的自动化分离

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

分选蠕虫仪是一种类似于流式细胞仪（FACS）的仪器，用于开展以下研究： 秀丽隐杆线虫，通常用于根据荧光报告基因的表达对线虫进行分选。本文中，我们重点介绍该仪器的一种替代用途，即根据线虫被表达GFP的病原体定植的程度对其进行分选。这一新应用使我们能够探究线虫肠道定植程度与免疫反应诱导之间的关系。而 秀丽隐杆线虫 已记录到针对不同病原体的免疫反应，但其启动机制仍不清楚。两种主要的可能机制（并非互斥）是：对病原体相关分子模式的识别，以及对感染所造成损伤的感知。为了区分这两种可能性，必须将生物体对病原体的暴露与其引发的损伤分离开来。利用蠕虫分选仪，可实现对被革兰氏阴性病原菌大量定植的线虫进行分离 铜绿假单胞菌，其损伤可能由病原体载量引起，而对照线虫虽经相似暴露但未被定植或仅有轻微定植。利用这些不同的群体评估病原体载量与转录免疫应答诱导之间的关系。结果表明二者相互分离，支持存在病原体识别的可能性。

当将年龄匹配且基因型相同的 C. elegans 暴露于 P. aeruginosa 时，其定植水平呈现广泛分布（图 1A）。借助本文所述的实验方案，可有效分离未定植与已定植线虫（图 1B）。与未定植线虫不同，已定植线虫表现出组织损伤的迹象，例如行动迟缓和排便减少19。后者可能是导致 P. aeruginosa 定植线虫难以清除感染的原因之一。这一点对本方案具有直接意义，提示被分选为未定植的线虫此前并未被定植。为了直接验证这一推论是否正确，将手工挑选的已定植线虫接受与分选实验中相同的洗涤步骤，随后在荧光显微镜下进行观察；结果显示仅有 4/56 的线虫清除了病原体。因此，被分选为未定植的线虫中曾被定植的比例极可能可忽略不计。然而，建议在洗涤过程中监测定植状态的变化，以避免错误分选对分析结果造成影响，这一问题对于其他病原体可能比 P. aeruginosa 更为显著。
先前采用本方案的研究利用分选的线虫进行了微阵列基因表达分析...

蠕虫分选仪通过根据荧光报告基因的表达对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进行分选，从而促进遗传筛选。在此，我们描述一种新的应用：&#160;根据表达GFP的病原体的定植情况进行分选，并利用该方法研究病原体识别在启动免疫反应中尚未被充分理解的作用。

由细菌病原体不同程度定植的 C. elegans 的自动化分离

蠕虫分选仪是一种类似于流式细胞分选仪（FACS）的仪器，常用于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究，通常根据线虫的表达特征进行分选……

以下实验的总体目标是评估定植及其相关损伤对海鞘先天免疫反应启动的贡献。通过将同步化的年轻成年海鞘群体暴露于表达绿色荧光蛋白（GFP）的假单胞菌（Pseudomonas arosa），获得被病原体不同程度定植的线虫群体，从而实现这一目标。经过洗涤后，将不同程度定植的线虫群体分离，重点获取完全定植和未定植的两种极端纯群体。随后从这些种群中提取RNA，并将免疫基因的表达水平与在非致病性大肠杆菌上培养的秀丽隐杆线虫进行比较。为了探究免疫反应与定植之间的关系，实验结果表明，秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌的先天免疫反应可以与病原菌定植过程相分离。该技术相较于其他研究秀丽隐杆线虫免疫反应起始方法的主要优势在于，它能够解决线虫种群中感染差异的变异性问题，从而帮助我们解析感染过程的不同方面。该方法有助于回答海鞘研究和先天免疫学中的关键问题，例如先天免疫反应启动的基础是什么，以及如何以高通量的方式研究不同的遗传或环境干预对抵抗病原体定植能力的影响。首先，在接种了大肠杆菌的多种线虫生长培养基（NGM）平板上培养线虫，直至大量线虫发育至成虫阶段。然后用卵制备液处理成年线虫，以获得同步化的培养物。接着将卵接种到多个接种了细菌的60毫米NGM平板上，每板约150至200个卵。需要至少 15 到 20 个培养板才能获得数千条线虫。若需更多线虫，用户在进行分选实验时应使用直径更大的培养板，并在每个平板上接种更多的卵以扩大规模。将培养板在 20 °C 下孵育两天，直至线虫发育至 L4 或年轻成虫阶段。在卵制备的次日，将表达GFP的POSA菌株PA 14 GFP接种至2毫升含有抗生素的Kings B培养基中。将培养物在37°C条件下振荡培养过夜。次日，将PA 14 GFP菌液接种至若干慢杀平板上，根据每项检测需要，每个150毫米的培养皿均需涂布相应数量的平板。用移液器吸取75至100微升饱和培养物并均匀涂布。使用无菌玻璃涂布器，在37摄氏度下培养平板20至24小时。将含有PA 14 GFP的平板从培养箱中取出，并使其冷却至室温。同时，为了收集在 NGM 平板上培养的线虫，加入适量 M 九缓冲液，以覆盖平板表面为宜。轻轻旋转平板混匀，将液体转移至 15 毫升锥形管中。待线虫沉降至管底后，吸除多余液体，再将线虫以最小体积的液体转移至 PA 14 GFP 平板上。使用 150 毫米平板时，可在单个平板上放置数百条线虫。将暴露于 p. arrosa 的年轻成虫线虫在 25 摄氏度下孵育 18 至 21 小时。此时间段内，定植与非定植动物的分布状态最佳，适合在进行样本分选前使用。关键步骤在此概述，详细信息可在线获取。将鞘液阀压力设置为约五 PSI，以确认鞘液流速是否合适。在分配器下方放置一个 15 毫升的锥形管。打开鞘液阀，关闭分选阀。将试管置于分配器下方保持 60 秒。试管中的体积应为 9 至 10 毫升

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

自动分离<em&gt; C。线虫</em&gt;可多段由细菌病原体殖民者

来源： Taylor, M. N., 等。 利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用 视频实验杂志 (2022)本视频展示了将无菌且年龄匹配的Caenorhabditis...

评估无菌 C. elegans 中的肠道细菌定植

来源：Petersen, C. et. al., 模式线虫Caenorhabditis elegans天然微生物群的分离与表征。J. Vis. Exp. (2022)本视频展示了与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）相关的细菌物种的分离与培养方法。通过基于微珠的秀丽隐杆线虫（C.

秀丽隐杆线虫相关细菌的分离与培养

来源： Chen, Y., 等评估毒力与致病机制 气单胞菌属 感染在A中 秀丽隐杆线虫 模型。 视频实验杂志 (2018)本视频展示了一种利用秀丽隐杆线虫（C.

建模 气单胞菌属 发病机制 C. elegans 使用存活率测定实验

来源： Le, T. A. N., 等测量细菌和化学物质对肠道通透性的影响 秀丽隐杆线虫. 视频实验杂志 (2019)本视频展示了一种基于荧光的检测方法，用于定量暴露于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道通透性。与喂食大肠杆菌（Escherichia...

细菌暴露后对 C. elegans 肠道通透性的评估

本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis...

秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

本文介绍一种可灵活应用的全生物体高内涵筛选工具，可用于研究宿主与病原体之间的相互作用，并适用于药物发现。...

一种高通量、高内涵、基于液体的 C. elegans 病理系统

野生的Caenorhabditis线虫与多种微生物相关，这些微生物通常位于肠道腔内或感染肠道。本方案详细介绍了一种利用dauer幼虫角质层的抗性来富集定植于肠道中不可培养微生物的方法。...

选择性清洗野生 Caenorhabditis 线虫以富集肠道微生物组细菌

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C.

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

本方案描述了一种在低温麻痹和表面漂白 以去除外部细菌后，对单个细菌定植的Caenorhabditis...

利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

Caenorhabditis elegans 是生物学中的主要模式物种之一，然而几乎所有研究都是在缺乏其天然共生微生物的情况下进行的。本文所述方法将有助于增进我们对这些共生微生物多样性的理解，为未来开展功能性的 C. elegans...

模式线虫天然微生物群的分离与表征 秀丽隐杆线虫

了解利用虫体分选仪分离被铜绿假单胞菌GFP菌株定殖的秀丽隐杆线虫群体的方法。该技术通过RNA提取和基因表达分析，帮助研究人员研究病原体识别如何启动先天免疫反应，并揭示感染过程中的免疫机制。

由细菌病原体不同程度定植的 C. elegans 的自动化分离

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