由细菌病原体不同程度定植的 C. elegans 的自动化分离

以下实验的总体目标是评估定植及其相关损伤对海鞘先天免疫反应启动的贡献。通过将同步化的年轻成年海鞘群体暴露于表达绿色荧光蛋白（GFP）的假单胞菌（Pseudomonas arosa），获得被病原体不同程度定植的线虫群体，从而实现这一目标。经过洗涤后，将不同程度定植的线虫群体分离，重点获取完全定植和未定植的两种极端纯群体。

随后从这些种群中提取RNA，并与在非致病性大肠杆菌上培养的线虫进行免疫基因表达的比较。为了研究免疫反应与定植之间的关系，实验结果表明，秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌的先天免疫反应可以与病原菌定植过程相分离。该技术相较于其他研究秀丽隐杆线虫免疫反应起始的方法，其主要优势在于能够解决线虫种群中感染的变异性问题，从而帮助我们解析感染过程中的不同环节。

该方法有助于回答海葵研究和先天免疫领域中的关键问题，例如先天免疫反应启动的基础是什么，以及如何以高通量的方式研究不同遗传或环境干预对抵抗病原体定植能力的影响？首先，在多个接种了大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上培养线虫，直至大量线虫发育至成虫阶段。

然后用卵制备液处理成年线虫，以获得同步化的培养物。接着将卵接种到多个已接种细菌的60毫米NGM平板上，每板约150至200个卵。

需要至少 15 到 20 个培养板才能获得数千条线虫。若需更多线虫，用户在进行分选实验时应使用直径更大的培养板，并在每个平板上接种更多的卵以扩大规模。将培养板在 20 °C 下孵育两天，直至线虫发育至 L4 或年轻成虫阶段。

在卵制备的次日，将表达GFP的POSA菌株PA 14 GFP接种至2毫升含有抗生素的Kings B培养基中。将培养物在37°C条件下振荡培养过夜。次日，将PA 14 GFP菌液接种至若干慢杀平板上，根据每项检测需要，每个150毫米的培养皿均需涂布相应数量的平板。

用移液器吸取75至100微升的饱和培养物，并均匀涂布。使用无菌玻璃涂布棒，将平板在37摄氏度下培养20至24小时。从培养箱中取出含有PA 14 GFP的平板，使其冷却至室温。

同时，收集在NGM平板上培养的线虫时，加入适量M9缓冲液，以覆盖平板表面为宜。轻轻旋转平板，将液体转移至15毫升锥形管中。待线虫沉降至管底后，吸除多余液体，再将线虫以最小体积的液体转移至PA14 GFP平板上。使用150毫米平板时，可在单个平板上放置数百条线虫。

将暴露于p. arrosa的年轻成虫线虫平板在25摄氏度下孵育18至21小时。此时间段内，定植与非定植动物的分布状态最佳，在进行样品分选前应确保仪器正常运行。关键步骤在此概述，详细信息可在线获取。

将鞘液阀压力设置为约五 PSI，以确认鞘液流速适当。在分配器下方放置一个 15 毫升锥形管。打开鞘液阀，并关闭分选阀。

将试管置于分配器下方保持60秒。试管中的体积应为9至10毫升。如果超出此范围。

相应调整鞘液阀压力，以确保鞘液流速能够实现准确分选。首先关闭鞘液阀，然后向储液槽中加入约 25 毫升的对照颗粒溶液，以测试分选速率。

在计算机软件上打开鞘液阀和样品阀。进入控制颗粒模式并点击采集。确保颗粒流速约为每秒5至8个颗粒，飞行时间接近40微米颗粒的宽度。

这将确保每次仅有一个40微米的物体通过。如果数值超出此范围，需相应调整设置。用M9缓冲液将线虫洗涤至15毫升锥形管中，静置使成虫通过重力沉降至管底，然后移除上清液。

用新鲜的M9缓冲液注满离心管，重复此过程三到四次。该步骤可去除大部分幼虫以及过量的细菌，耗时约10分钟。

将线虫加入含有轻轻搅拌的小型搅拌子的线虫分选仪储液槽中。通过将绿色光电倍增管设为600，红色和黄色光电倍增管设为200，调节初始信号增益。开始采集数据以调整设置。

分选速率应控制在每秒25至30个事件或线虫。如果计数速率过高，需用M9缓冲液适当稀释储液池中的线虫。

如果速率过低，可加入更多线虫及少量M9培养基。若实验需要严格区分定植与非定植线虫，应将重合检测设为“纯度优先”。此设置可确保当两个物体过于接近或位于同一液滴中时，仪器将自动弃除该液滴。

无需收集样本以分选目标群体，而应在指示大小和荧光强度的轴上绘制门控区域。荧光门控的数值必须通过实验确定。随后，在分配器下方放置多孔板或培养皿以收集线虫。

然后打开分选阀门以开始分选线虫。收集少量动物样本，在显微镜下确认分选出的群体是否为目标群体。如果不符合，应相应调整门控参数，并继续进行样品收集。

当将年龄匹配的遗传一致的海鞘暴露于表达GFP的成团泛菌（P. asosa）时，其定植水平表现出广泛分布。使用蠕虫分选仪可有效分离未定植与已定植的蠕虫。与未定植蠕虫不同，已定植蠕虫表现出明显的症状，如活动迟缓和排便减少。后者可能是被成团泛菌定植的蠕虫难以清除感染的原因之一。

无论线虫是否定植，四个基因在 P arosa 暴露后均表现出相似的诱导表达，采用定量 R-T-P-C-R 检测这些基因的表达水平。这四个基因已知属于 CL egan 的免疫应答相关基因。Lys two 编码一种溶菌酶，两个功能未明确的基因特异性响应感染，其中其中一个基因还参与感染抗性，PGP five 则对感染以及重金属胁迫均有响应。

结果证实了先前已发表的研究，表明定植及其相关损伤并非引发免疫反应所必需。相反，病原体相关分子模式可能是触发信号，数据显示在未发生定植的动物中PGP-5被诱导表达，而这些动物本不应经历显著损伤。这提示在秀丽海葵中，调控免疫反应与一般应激反应的调控程序存在重叠。

该方法可为海葵免疫应答启动机制提供新的见解，也可应用于其他问题的研究，例如环境条件或遗传操作对不同病原体定植或竞争过程（除感染过程外）的影响。该方法还可用于追踪线虫与其环境之间的其他相互作用，例如代谢物或化学物质的摄取或隔离。在完成该操作步骤后，所分选的目标种群可用于基因表达分析之外的多种用途。

这些包括采集活体动物以进行后续的感染实验、存活率检测或行为学实验。该技术为研究病原体暴露和定植对先天免疫及海葵优雅行为的影响提供了有效手段。