自动分离 C。线虫可多段由细菌病原体殖民者

以下实验的总体目标是评估定植及其相关损伤对 Sea Elegance 先天免疫反应启动的贡献。这是通过将年轻成年 sea elegance 的同步种群暴露于表达绿色荧光蛋白或 GFP 的 Pseudomonas arosa 来实现的，该假单胞菌产生一个由病原体不同定植的蠕虫种群。洗涤差异后，定植的蠕虫种群被分成纯种群，专注于完全定植和非定植蠕虫的两个极端。

接下来，从这些群体中提取 RNA，并与在非致病性大肠杆菌上生长的蠕虫进行比较，评估免疫基因表达。为了检查免疫反应与定植之间的关系，获得的结果表明 Sea Elegance 对 p arosa 的先天免疫反应可以与病原体定植脱钩。与其他研究 Sea Elegance 中免疫反应启动的方法相比，该技术的主要优点是它解决了温暖种群感染的可变性，使我们能够梳理感染过程的不同方面。

这种方法可以帮助以高通量的方式回答海洋优雅、先天免疫的关键问题，例如先天免疫反应启动的基础是什么。不同的遗传或环境作对抵抗病原体定植的能力有什么影响？要开始在几个线虫、生长培养基或接种大肠杆菌的 NGM 板上培养蠕虫，直到许多蠕虫达到严重阶段。

然后用鸡蛋制备溶液处理坟墓动物以获得同步培养物。下一个板块。鸡蛋放在几个 60 毫米 NGM 平板上，以每板大约 150 到 200 个鸡蛋的密度接种细菌。

至少需要 15 到 20 个板才能获得数千个蠕虫。对于分选实验，如果需要更多的蠕虫，用户应使用更大直径的板，每板有更多的鸡蛋。将板在 20 摄氏度下孵育两天，直到蠕虫达到 L 4 或年轻成虫阶段。

在鸡蛋制备的第二天，将表达 POSA 培养物的 A GFP（PA 14 GFP）接种到两毫升含有抗生素的 kings B.Medium 中。将培养物在 37 摄氏度下搅拌孵育过夜。第二天，将 PA 14 GFP 培养物接种到每个 150 毫米培养皿上测定所需的任意数量的慢杀灭平板上。

移液 75 至 100 微升饱和培养物并均匀涂抹。使用无菌玻璃涂抹器，将板在 37 摄氏度下孵育 20 至 24 小时。从培养箱中取出含有 PA 14 GFP 的板，让它们冷却至室温。

同时，要收集在 NGM 平板上生长的蠕虫，请添加少量 M 9 缓冲液以覆盖平板。轻轻旋转板，将液体转移到 15 毫升锥形管中。让蠕虫沉降到底部并去除多余的液体，然后将蠕虫转移到 PA 14 GFP 板上 在最小体积的液体中，当使用 150 毫米板时，可以将数百条蠕虫放在一个板上。

将板在 25 摄氏度下孵育 18 至 21 小时，用于暴露于 p arosa 的年轻成虫。这是显示定植动物与非定植动物最佳分布的时间窗口，在执行样品分选之前，确保机器正常运行。此处概述了基本步骤，详细信息可在线获取。

将护套阀压力设置为大约 5 PSI，以验证护套流体流速是否合适。将 15 mL 锥形管放在分液器下方。打开护套阀并关闭分拣阀。

将试管放在分配器下方 60 秒。试管中的体积应为 9 至 10 毫升。如果超出此范围。

相应地调整护套阀压力，以确保护套流体流速允许准确分选。首先关闭护套阀以测试分选速率。然后向储液槽中加入约 25 毫升对照颗粒溶液。

在计算机软件上打开鞘阀和样品阀。导航到控制粒子模式，然后单击 acquire。确保颗粒流速约为每秒 5 到 8 个颗粒，飞行时间约为 40 微米颗粒的宽度。

这将确保一次只有一个 40 微米的物体通过。如果值超出此范围，请相应地调整设置。将 M 9 缓冲液洗涤蠕虫放入 15 毫升锥形管中，让成虫在重力作用下沉到管底并去除上清液。

用新鲜的 M nine 缓冲液填充试管。重复此过程 3 到 4 次。这去除了很大一部分幼虫和多余的细菌，大约需要 10 分钟。

将蠕虫添加到蠕虫分选器储液槽中，该储液槽中包含一个轻轻混合的小搅拌棒。通过将绿色光电倍增管设置为 600 并将红色和黄色光电倍增管设置为 200 来调整初始信号增益。开始采集数据以调整设置。

目标是每秒 25 到 30 个事件或蠕虫的分拣率。如果编号率太高，则用 M 9 稀释储液器中的蠕虫。相应地缓冲。

如果速率太低，则以 M nine 的小体积添加更多蠕虫。如果实验需要非常严格地区分定植蠕虫和非定植蠕虫，请将符合检查设置为 pure。这可确保如果两个物体彼此距离太近或位于同一液滴中，机器会拒绝该液滴。

与其收集它来对感兴趣的群体进行排序，不如在轴周围绘制指示大小和荧光强度的门。荧光门控的值必须根据经验确定。接下来，在分配器下方放置一个多孔板或培养皿以收集蠕虫。

然后打开分拣阀开始分拣蠕虫。收集一小群动物，在显微镜下验证排序的种群是感兴趣的种群。如果没有，请相应地调整设门参数并继续样品采集。

当年龄匹配、基因相同的 Sea Elegance 暴露于 GFP 表达 posa 导致定植水平的广泛分布时，使用蠕虫分选机实现了非定植蠕虫与定植蠕虫的有效分离。与非定植蠕虫不同，定植蠕虫表现出明显的迹象，例如反应迟缓并减少排便。后者可能是 P arosa 定植的蠕虫难以清除感染的一个原因。

与蚯蚓暴露类似，无论蠕虫的定植状态如何，都诱导了 4 个基因，并使用定量 R-T-P-C-R 来测量基因的表达。已知这四个基因是 CL egan 免疫反应的一部分。Lys 2 编码溶菌酶 2 个未表征的基因对感染有特异性反应，其中 1 个也有助于感染抵抗，PGP 5 对感染和重金属应激有反应。

结果证实了先前发表的结果，表明定植及其相关损伤不是免疫反应所必需的。相反，将病原体相关分子模式作为信号数据，表明 PGP 5 是在非定植动物中诱导的，预计不会经历。广泛的损害表明 Sea Elegance 中控制免疫反应和一般压力反应的调节程序存在重叠。

这种方法可以为 Sea Elegance 中免疫反应的启动提供新的见解，但它也可以应用于其他问题，例如环境条件或基因作对除感染过程之外不同病原体之间的定植或竞争的影响。这种方法也可以应用于跟踪蠕虫与其环境的其他相互作用，例如摄入或封存代谢物或化学物质。按照此程序，分选的目标群体可用于基因表达以外的多种目的。

这些包括收集活体动物进行后续感染或存活分析或行为实验。该技术为研究病原体暴露和定植对先天免疫和海洋优雅的影响提供了一种有用的手段。